CN112823037A - 抑制去泛素化酶usp25和usp28 - Google Patents

抑制去泛素化酶usp25和usp28 Download PDF

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Abstract

本公开涉及选自USP28和USP25的至少一种途径的调节剂诸如抑制剂、包含所述抑制剂的药物组合物，以及使用所述抑制剂的方法。选自USP28和USP25的至少一种途径的调节剂诸如抑制剂可用于治疗癌症以及其他疾病。本公开提供了式(I)化合物。

Description

抑制去泛素化酶USP25和USP28
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年8月9日提交的美国临时申请号62/716,738的优先权和权益，其全部内容通过引用并入文中。
技术领域
本公开涉及使用新型化合物抑制泛素特异性蛋白酶28(USP28)和/或泛素特异性蛋白酶25(USP25)。
背景技术
USP28和USP25在多种癌蛋白和表观遗传驱动因子和免疫调节蛋白以及其它细胞因子的去泛素化和稳定化中起作用，这些细胞因子与人类的免疫应答以及肿瘤起始和生长有关。因此，可以开发出用小分子抑制剂抑制USP28和/或USP25以用于医学用途，例如用于治疗癌症，例如肺癌。为此，仍然非常需要USP28和/或USP25的新型和有效的小分子抑制剂。
发明内容
本公开提供了式(I)化合物：
Figure BDA0003011569000000011
及其药学上可接受的形式，其中：
X选自N或C(R’)；
R'选自氢、氘和CH3；
Y是C(R)；
R选自氢、NH2和C1-C4烷基；
R1选自Rx、氢、C1-C5直链和C3-C5支链烷基，其中烷基任选地被一个或多个Rx取代；
Rx选自在USP28和/或USP25生化测定中表现出活性的小的亲脂性和/或吸电子基团，
R2选自氢和卤素；
R3、R4和R4’各自独立地选自氢和C1-C4烷基；
R5选自6至8元杂环；
R6选自氢、氘、卤素、C1-C4烷基和-CN；以及
n为0、1或2。
另外的目的和优点将部分陈述在随后的描述中，并且将部分通过所述说明而显而易见，或者可通过实践而学到。所述目的和优点将借助在所附权利要求中具体指出的要素和组合来实现和达到。
应理解，上述一般描述和以下详细描述均仅为示例性和解释性的并且不限制权利要求。
具体实施方式
本文公开了可用于抑制USP28和/或USP25的化合物，包括如本文定义的USP25抑制剂化合物、USP28抑制剂化合物和USP28/25抑制剂化合物。USP28/25抑制剂、USP28抑制剂和/或USP25抑制剂化合物可以是本文公开的化合物，包括式(I)化合物。
本文所用的术语“USP28抑制剂”是指在如本文实施例A-1(a)和/或A-1(b)中所述的USP28的泛素-罗丹明110测定中具有10微摩尔或更小的IC50的本文公开的化合物(例如，式(I)化合物)。例如，USP28抑制剂可以是本文公开的式的化合物，其使用如实施例A-1(a)中所述的USP28的泛素-罗丹明110测定具有至多10微摩尔的IC50值，包括0.001-10微摩尔，例如0.001-2微摩尔，优选0.001-0.2微摩尔，更优选0.001-0.05微摩尔的IC50值。USP28抑制剂可以是本文公开的式的化合物，其使用如实施例A-1(b)中所述的USP28的泛素-罗丹明110测定具有至多10微摩尔的IC50值，包括0.001-10微摩尔，例如0.001-2微摩尔，优选0.001-0.2微摩尔，更优选0.001-0.05微摩尔的IC50值。USP28抑制剂可以是本文公开的式的化合物，其使用如实施例A-1(a)中所述的USP28的泛素-罗丹明110测定和如实施例A-1(b)中所述的USP28的泛素-罗丹明110测定具有至多10微摩尔的IC50值，包括对两种测定而言0.001-10微摩尔，例如0.001-2微摩尔，优选0.001-0.2微摩尔，更优选0.001-0.05微摩尔的IC50值。
如本文所用，术语“USP25抑制剂”是指在如本文实施例A-2中所述的USP25的泛素-罗丹明110测定中具有10微摩尔或更小的IC50的本文公开的化合物(例如，式(I)化合物)。例如，USP25抑制剂可以是本文公开的式的化合物，其使用如实施例A-2中所述的USP25的泛素-罗丹明110测定具有至多10微摩尔的IC50值，包括0.001-10微摩尔，例如0.001-2微摩尔，优选0.001-0.2微摩尔，更优选0.001-0.05微摩尔的IC50值。
本文所用的术语“USP28/25抑制剂”是指本文公开的化合物(例如，式(I)化合物)，其为如本文定义的USP28抑制剂或USP25抑制剂或USP28抑制剂和USP25抑制剂两者。
任选地，式(I)化合物中的任一个或多个氢原子可以独立地被氘或其他氢同位素替代。
如上文和下文所述，本公开涉及式(I)化合物：
Figure BDA0003011569000000041
及其药学上可接受的形式，其中：
X、Y、R、R’、Rx、R1、R2、R3、R4、R4’、R5、R6和n均如上定义。
在至少一个实施方案中，X为N。在至少一个实施方案中，X为C(R')，其中R为氢。在至少一个实施方案中，X为C(R’)，其中R为CH3。在优选的实施方案中，X为CH。
在至少一个实施方案中，Y为CH。在至少一个实施方案中，Y为C-NH2。
在至少一个实施方案中，Rx选自卤素、氘、-OH。
在至少一个实施方案中，R1选自氢。在至少一个实施方案中，R1选自直链或支链烷基，其任选地被一个或多个Rx取代。在至少一个实施方案中，R1选自被Rx取代的支链烷基，其中Rx选自卤素和-OH基团。
在至少一个实施方案中，R2选自氢。在至少一个实施方案中，R2选自卤素。
在至少一个实施方案中，R3、R4和R4’各自为氢。在至少一个实施方案中，R3为氢，并且R4和R4’中的一个为氢，而另一个选自C1-C4烷基。在至少一个实施方案中，R3为氢，并且R4和R4’中的一个为氢，而另一个是CH3。
在至少一个实施方案中，R5选自6元杂环。在至少一个实施方案中，R5选自7元杂环。在优选的实施方案中，杂环具有两个氮。
在至少一个实施方案中，R6选自氢。在至少一个实施方案中，R6选自卤素。在优选的实施方案中，卤素选自F和Cl。
在至少一个实施方案中，n为0。在至少一个实施方案中，n为1。在至少一个实施方案中，n为2。
在至少一个实施方案中，式(I)化合物选自其中X为C(R')；R’选自氢和氘；R为NH2；R1、R2、R3、R4和R4’为氢；R5选自6元杂环，且n为0的化合物。
在至少一个实施方案中，式(I)化合物选自其中X为C(R')；R’选自氢和氘；R为氢；R1选自任选地被1至3个Rx取代的C1-C3直链烷基；Rx选自卤素和-OH；R2和R3为氢；R4和R4’选自氢和CH3；R5选自6-8元杂环；R6选自氢、氘和卤素；且n为0、1或2的化合物。
在至少一个实施方案中，式(I)化合物选自其中X为C(R')；R’选自氢；R为氢；R1选自任选地被1至3个Rx取代的甲基和乙基；Rx选自卤素和-OH；R2和R3为氢；R4和R4’选自氢和CH3；R5选自6-8元杂环；R6选自氢和卤素；且n为0、1或2的化合物。
在至少一个实施方案中，式(I)化合物选自其中X为C(R')；R’选自氢和氘；R为氢；R1选自任选地被1至3个Rx取代的C3-C4支链烷基；Rx选自卤素和-OH；R2和R3为氢；R4和R4’选自氢和CH3；R5选自6-8元杂环；R6选自氢、氘和卤素；且n为0、1或2的化合物。
在至少一个实施方案中，式(I)化合物选自其中X为C(R')；R’选自氢；R为氢；R1选自任选地被1至3个Rx取代的C3-C4支链烷基；Rx选自卤素和-OH；R2和R3为氢；R4和R4’选自氢；R5选自6-8元杂环；R6选自氢和卤素；且n为0、1或2的化合物。
在至少一个实施方案中，式(I)化合物选自其中X为C(R')；R’选自氢；R为氢；R1为氢；R2为卤素；R3为氢；R4和R4’选自氢；R5选自6-8元杂环；R6选自氢和卤素；且n为0、1或2的化合物。
在至少一个实施方案中，式(I)化合物选自其中X为C(R')；R’选自氢；R为氢；R1选自氢，和任选地被1至3个Rx取代的C1-C3直链烷基；Rx选自卤素和-OH；R2为卤素；R3为氢；R4和R4’选自氢；R5选自6-8元杂环；R6选自氢和卤素；且n为0、1或2的化合物。
在至少一个实施方案中，式(I)化合物选自其中X为N；R为氢；R1选自氢，和任选地被1至3个Rx取代的C1-C3直链烷基；Rx选自卤素和-OH；R2为氢；R3为氢；R4和R4’选自氢和CH3；R5选自6-8元杂环；R6选自氢和卤素；且n为0、1或2的化合物。
优选地，化合物为式(I)化合物，其为如本文所定义的USP28抑制剂、USP25抑制剂和/或USP28/25抑制剂。
如本文所用，杂环烷基应理解为是指单环或多环。该基团可以是稠合的(例如萘烷)或桥接的(例如降冰片烷)。此外，在整个环碳或杂原子之间不共享离域π电子(芳香性)。
本文公开的化合物的药物形式可以包括药学上可接受的盐、溶剂化物等。除非另有说明，否则所有药物形式(例如所有互变异构形式和立体异构体)在本文中均视为本公开的一部分。除非另用星号(*)表示，否则本文所指的立体化学是指每个分子内的相对(任意指定的)立体化学方向，其不一定与绝对立体化学相同。
本文提供的用于抑制USP28和/或USP25的化合物可用于抑制USP28和/或USP25，以及用于开发用于治疗与USP28和/或USP25的活性有关的人类疾病或疾病症状的药物组合物。本文公开的USP28抑制剂可用于开发用于治疗疾病例如癌症(例如，肺癌)的药物组合物。本文公开的USP25抑制剂可用于开发用于治疗疾病例如癌症(例如，肺癌)的药物组合物。式(I)化合物可以是用于开发用于治疗疾病例如癌症(例如，肺癌)的药物组合物的本文公开的USP28抑制剂和USP25抑制剂。
可以将作为USP28抑制剂和/或USP25抑制剂的式(I)化合物以治疗有效方式配制成施用于受试者(动物或人)或样品(例如，包含一种或多种含有USP28和/或USP25的细胞))的药物组合物，所述治疗有效方式经选择以在细胞、组织、系统、动物、个体或人中引起所需和/或治疗性生物学或医学响应或效应，包括以下中的任一种或多种：(1)预防疾病(例如预防可能易患疾病、病症或障碍但尚未经历或显示疾病的病理或症状的个体的疾病、病症或障碍)，(2)抑制疾病的进展(例如减缓或阻止正经历或显示疾病、病症或障碍的病理或症状的个体的疾病或疾病、病症或障碍的症状的进展，包括阻止病理和/或症状的进一步发展)；或(3)改善疾病或其症状(例如降低正在经历或显示疾病、病症或障碍的病理或症状的个体中与疾病、病症或障碍相关的症状的频率或强度，包括逆转病理和/或症状)。本文公开的USP28和/或USP25抑制剂化合物可以有效提供预期效果的量使用。
尽管不受任何具体理论的束缚，但申请人认为式(I)化合物及其药物形式可用于抑制USP28和/或USP25。这种抑制可以导致对USP28和/或USP25需要抑制的疾病或病症的症状和/或潜在原因进行有效治疗。例如，USP28和/或USP25的抑制剂可用于治疗癌症，例如肺癌。
本公开的另一方面涉及药物组合物，其包含选自式(I)化合物的化合物及其药物形式，以及药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以进一步包括赋形剂、稀释剂或表面活性剂。本文公开的用于抑制USP28和/或USP25的化合物可以与适于向人或动物施用的预期途径的药学上可接受的赋形剂组合。可以选择赋形剂以提供适于预期施用途径的药物剂型，包括口服或肠胃外施用剂型。
因此，本公开涉及提供的治疗与USP28和/或USP25有关的疾病或障碍的方法，其包括向患有所述疾病或障碍中的至少一种的患者施用式(I)化合物和/或其药物形式，任选地在药物组合物中。所公开的化合物可以以有效量施用以在受试者中治疗或预防障碍和/或预防其发展。用已知具有如本文实施例A-1(a)、A-1(b)和A-2中所述的USP28和/或USP25的泛素-罗丹明110测定中小于约1微摩尔或更小的IC50的抑制USP28和/或USP25的化合物治疗疾病或障碍的方法可包括向有此需要的患者施用治疗有效量的包含式(I)化合物的药物组合物。优选地，药物组合物包含式(I)的USP28和/或USP25抑制剂化合物和/或具有本文实施例A-1(a)、A-1(b)和A-2中所述的USP28和/或USP25的泛素-罗丹明110测定中小于约1微摩尔或更小的IC50的USP28和/或USP25抑制剂化合物。
根据本公开的式(I)的化合物的非限制性实例包括下表1、2、3和4的那些。
化合物的合成方法
本公开的化合物可以以有机合成领域的技术人员已知的多种方式制备。本公开的化合物可以通过多种方法制备，包括标准化学方法。在本文提供的方案中描述了合适的合成路线。本文公开的化合物可以通过有机合成领域中已知的方法制备，如通过以下合成方案部分阐述。在本文描述的方案中，充分理解的是，根据一般原理或化学，在必要时使用敏感或反应性基团的保护基。根据有机合成的标准方法操纵保护基(T.W.Greene和P.G.M.Wuts,"Protective Groups in Organic Synthesis",第三版,Wiley,纽约1999)。使用本领域技术人员显而易见的方法在化合物合成的方便阶段除去这些基团。选择方法以及反应条件和其执行顺序应与式(I)化合物的制备相一致。
本文描述的化合物可以由可商购的起始原料制备或使用已知的有机、无机和/或酶促方法合成。本领域技术人员将认识到本文公开的化合物中是否存在立体中心。因此，本公开包括两种可能的立体异构体(除非在合成中另有说明)，并且不仅包括外消旋化合物，还包括单独的对映异构体和/或非对映异构体。当期望化合物作为单一对映异构体或非对映异构体时，其可以通过立体特异性合成或通过拆分最终产物或任何方便的中间体来获得。最终产物、中间体或起始原料的拆分可通过本领域已知的任何合适方法来实现。参见，例如，E.L.Eliel、S.H.Wilen和L.N.Mander的“有机化合物的立体化学”(Wiley-Interscience，1994)。
举例来说，本公开的化合物可以使用以下描述的方法，以及合成有机化学领域中已知的合成方法，或其本领域技术人员所理解的变化来合成。一般方案1中描述了制备本发明化合物的一般程序。在合适的溶剂如甲苯中，在合适的温度(如100℃)下，使用合适的钯络合物、配体和碱(例如但不限于：RuPhos第3代钯预催化剂和碳酸铯)，在钯催化的碳-氮偶联方案下，适当取代和保护的双环中间体1可与适当取代的保护的胺中间体2反应，得到中间体3。保护基1(PG1；通常为Cbz基团)可在适合的脱保护条件(例如但不限于：氢气(气体)，在合适的溶剂如甲醇、乙醇或乙酸乙酯中用碳载钯)下去除，得到胺中间体4。适当取代的胺中间体4可在酰胺偶联条件下与适当取代的羧酸反应(例如但不限于：偶联试剂EDC和HOBt与适当的碱如Et3N或DIEA在溶剂如DMF或DMA中)，得到倒数第二酰胺中间体5。保护基2(PG2；通常为Boc基团)可在适当条件如TFA下在溶剂如DCM或HCl中在溶剂如MeOH或二恶烷中移除，得到最终化合物6。通常可以通过制备型HPLC纯化最终化合物，并分离得到游离碱。在形成对映异构体和/或非对映异构体的混合物的情况下，可以在适当的阶段，在许多情况下通过手性HPLC纯化各个立体异构体。
一般方案：
Figure BDA0003011569000000101
在钯催化的碳氮偶联条件下(例如Pd2(dba)3、XantPhos、叔丁醇钠，在溶剂例如甲苯中，在升高的温度下)，将适当取代的芳基卤化物1(包含两个选自Cl、Br或I的卤素)与适当取代的受保护的胺2反应，得到偶联的芳基卤化物产物3。在钯催化的偶联条件下(例如Pd(dppf)Cl2、RuPhos、Cs2CO3，在溶剂系统例如甲苯/水中，在升高的温度下)，将芳基卤化物3与BF3钾盐4反应得到偶联产物。可以在氢解条件下(例如在氢气氛中，使用10％Pd/C，在溶剂如EtOAc中)除去Cbz保护基，得到胺5。胺5可以与适当取代的羧酸6在酰胺偶联条件(例如EDCI、HOBt和DIEA作为碱，在溶剂如DCM中)下反应，得到酰胺产物，其可以在BOC-脱保护条件(例如TFA/DCM)下进一步脱保护，得到产物7。
实施例
通过以下实施例和合成方案进一步说明本公开，这些实施例和合成方案不应被解释为将本公开的范围或精神限于本文所述的具体程序。应理解的是，提供这些实施例以举例说明某些实施方案，因此并不意图由此限制本公开的范围。还应理解，在不脱离本公开的精神和/或所附权利要求的范围的情况下，可以采取本领域技术人员可以想到的各种其他实施例、修改及其等同物。
分析方法、材料和仪器
除非另有说明，否则试剂和溶剂按来自商业供应商原样使用。除非另有说明，否则反应在氮气惰性气氛下进行。质子核磁共振(NMR)谱在Bruker或Varian光谱仪上在300或400MHz下获得。光谱以ppm(δ)表示，且偶合常数J以赫兹报告。四甲基硅烷(TMS)用作内标。使用Waters ZQ单四极杆质谱仪(离子阱电喷雾电离(ESI))收集质谱。使用具有Acquity光电二极管阵列检测器、Acquity蒸发光散射检测器(ELSD)和Waters ZQ质谱仪的WatersAcquityi级超高效液相色谱(UPLC)系统测量纯度和低分辨率质谱数据。使用WatersMassLynx 4.1软件获取数据，并通过UV波长220nm、蒸发光散射检测(ELSD)和电喷雾正离子(ESI)表征纯度。(柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7μm 2.1X 50mm；流速0.6mL/min；溶剂A(95/5/0.1％：10mM甲酸铵/乙腈/甲酸)，溶剂B(95/5/0.09％：乙腈/水/甲酸)；梯度：0至2分钟内5-100％B，保持100％B至2.2分钟，2.21分钟时为5％B。如下所示进行制备型HPLC纯化。偶尔测定本文所述实施例中化合物的分离对映异构体的绝对构型。在所有其他情况下，分离的对映异构体的绝对构型均未测定，且在这些情况下，拆分后的物质的构型在每种情况下均任意指定为R或S。
实施例A-1(a)：生化测定：USP28活性的泛素-罗丹明110测定。
在含有20mM Tris-HCl(pH8.0，(1M Tris-HCl，pH8.0溶液；Corning46-031-CM))、3mM BME(2-巯基乙醇；Sigma 63689-25ML-F)、0.03％BGG(0.22μM过滤，Sigma，G7516-25G)和0.01％Triton X-100(Sigma，T9284-10L)的测定缓冲液中以9μL的最终体积进行测定。将纳升量的DMSO中的10点、3倍系列稀释液预先分配到1536个测定板(Corning，#3724BC)中，最终测试浓度分别为25μM至1.3nM，从最高到最低剂量。酶USP28，构建体His-标记的USP28-FL-哺乳动物(蛋白质表达和纯化步骤如下所述)。针对最大信号背景比来优化浓度和孵育时间，同时在固定底物浓度下维持初始速度条件。测定中酶的最终浓度为75pM。最终底物(Ub-Rh110；泛素-罗丹明110，UbiQ-126)的浓度为25nM，[Ub-Rh110]<<Km。将3μL 2x酶添加到用USP25预孵育30分钟的测定板(用化合物预标记)中，然后将3μL 2x Ub-Rh110添加到测定板中。将板在室温下孵育45分钟，然后添加3μL终止溶液(终浓度为10mM柠檬酸(Sigma，251275-500G))。在Envision(485nm激发和535nm发射；Perkin Elmer)或PheraSTAR(485nm激发和535nm发射；BMG Labtech)上读取荧光。
用于构建体His-标记的USP28-FL-哺乳动物的蛋白表达和纯化程序
在Expi293f细胞中进行USP28(1-1077)-TEV-6*His(pTT5载体)的表达(序列来自uniprot ID：Q96RU2-1)。将细胞重悬于裂解缓冲液B(50mM二羟乙甘胺酸(Bicine)，pH 8.0，20mM NaCl，5％甘油，0.1％CHAPS，5mMβ-ME，1mM PMSF，1ug/ml亮抑酶肽，1ug/ml胃酶抑素)中，并通过超声裂解。通过离心去除不溶物，并将上清液加载到用Ni缓冲液A(50mM二羟乙甘胺酸，pH 8.0，20mM NaCl，5％甘油，0.1％CHAPS，5mMβ-ME)平衡的Ni-NTA柱(GEHealthcare)上，并用Ni缓冲液A+20mM咪唑洗涤，直到A280达到基线。用Ni缓冲液B(50mM二羟乙甘胺酸，pH 8.0，20mM NaCl，5％甘油，0.1％CHAPS，5mMβ-ME，300mM咪唑)洗脱蛋白质。使用以50mM二羟乙甘胺酸，pH 8.0，20mM NaCl，5％甘油，0.1％CHAPS，5mMβ-ME平衡的SuperdexTM 200 10/300GL柱(GE Healthcare)进一步纯化蛋白质。将蛋白质浓缩至2.5mgml-1，在液体N2中快速冷冻，然后储存在-80℃下。
实施例A-1(b)：生化测定：USP28活性的泛素-罗丹明110测定。
在含有20mM Tris-HCl(pH 8.0，(1M Tris-HCl，pH 8.0溶液；Corning 46-031-CM))、2mM CaCl2(1M氯化钙溶液；Sigma#21114)，2mM BME(2-巯基乙醇；Sigma 63689-25ML-F)，0.01％Prionex(0.22μM过滤，Sigma#G-0411)和0.01％Triton X-100的测定缓冲液中以20μL最终体积进行每次测定。将储备化合物溶液在DMSO中以10mM在-20℃下储存。直到测定前1个月，将2mM测试化合物预先分配到测定板(黑色，小体积；Corning#3820)中，并在-20℃冷冻。在测定当天，使预先标记的测定板达到室温。对于筛选，预分配100nL 2mM，最终筛选浓度为10μM(DMSO(fc)＝0.5％)。针对最大信号背景比来优化酶(USP28，构建体USP28(USP28-5(1-1077)-TEV-6*His；LifeSensors)浓度和孵育时间，同时在固定底物浓度下维持初始速度条件。测定中酶的最终浓度为400pM。最终底物(Ub-Rh110；泛素-罗丹明110，R&DSystems#U-555)的浓度为25nM，[Ub-Rh110]<<Km。将10μL 2x酶与2x Ub-Rh110同时添加到测定板(用化合物预标记)中，或者在将10μL 2x Ub-Rh110添加到化合物板中之前用USP28预孵育40分钟。将板在室温下堆叠孵育90分钟，然后在Envision(485nm激发和535nm发射；Perkin Elmer)或PheraSTAR(485nm激发和535nm发射；BMG Labtech)上读取荧光。
对于后续研究，在含有20mM Tris-HCl(pH 8.0，(1M Tris-HCl，pH 8.0溶液；Corning 46-031-CM))、3mM BME(2-巯基乙醇；Sigma63689-25ML-F)、0.03％BGG(0.22μM过滤，Sigma，G7516-25G)和0.01％Triton X-100(Sigma，T9284-10L)的测定缓冲液中以15μL最终体积进行每次测定。将纳升量的DMSO中的8点或10点、3倍系列稀释液预先分配到测定板(Perkin Elmer,ProxiPlate-384 F Plus,#)中，最终测试浓度分别为25μM至11nM或25μM至1.3nM。针对最大信号背景比来优化酶USP28，构建体USP28(USP28-5(1-1077)-TEV-6*His；LifeSensors)浓度和孵育时间，同时在固定底物浓度下维持初始速度条件。测定中酶的最终浓度为75pM。最终底物(Ub-Rh110；泛素-罗丹明110，R&D系统#U-555)的浓度为25nM，[Ub-Rh110]<<Km。将5μL 2x酶添加到用USP28预孵育30分钟的测定板(用化合物预标记)中，然后将5μL 2x Ub-Rh110添加到测定板中。在室温下，将板堆叠孵育20分钟，然后添加5μL终止溶液(最终浓度为10mM柠檬酸(Sigma，251275-500G))。在Envision(485nm激发和535nm发射；Perkin Elmer)或PheraSTAR(485nm激发和535nm发射；BMG Labtech)上读取荧光。
实施例A-2：生化测定：USP25活性的泛素-罗丹明110测定。
在含有20mM Tris-HCl(pH 8.0，(1M Tris-HCl，pH 8.0溶液；Corning 46-031-CM))、3mM BME(2-巯基乙醇；Sigma63689-25ML-F)、0.03％BGG(0.22μM过滤，Sigma，G7516-25G)和0.01％Triton X-100(Sigma，T9284-10L)的测定缓冲液中以9μL的最终体积进行测定。将纳升量的DMSO中的10点、3倍系列稀释液预先分配到1536个测定板(Corning，#3724BC)中，最终测试浓度分别为25μM至1.3nM，从最高到最低剂量。酶USP25，构建体USP25-His6，(Boston Biochem E-546)。针对最大信号背景比来优化浓度和孵育时间，同时在固定底物浓度下维持初始速度条件。测定中酶的最终浓度为75pM。最终底物(Ub-Rh110；泛素-罗丹明110，R&D Systems#U-555)的浓度为25nM，[Ub-Rh110]<<Km。将3μL 2x酶添加到用USP25预孵育30分钟的测定板(用化合物预标记)中，然后将3μL 2x Ub-Rh110添加到测定板中。将板在室温下孵育45分钟，然后添加3μL终止溶液(终浓度为10mM柠檬酸(Sigma，251275-500G))。在Envision(485nm激发和535nm发射；Perkin Elmer)或PheraSTAR(485nm激发和535nm发射；BMG Labtech)上读取荧光。
对于测定形式实施例A-1a、A-1b和A-2，根据以下等式，将数据报告为与对照孔相比的抑制百分比：％inh＝1-(((FLU-Ave低)/(Ave高-Ave低))，其中FLU＝测量的荧光，Ave低＝无酶对照的平均荧光(n＝16)，且Ave高＝DMSO对照的平均荧光(n＝16)。IC50值是通过Activity Base软件包中包含的标准4参数逻辑拟合算法的曲线拟合测定的：IDBS XE设计器模型205。使用Levenburg Marquardt算法拟合数据。
在根据本公开的生化IC50测定(IC50范围)中化合物的活性根据以下报道于下表1-4中：
“-”：>10μM；“+”：2-10μM；“++”：0.2-2μM；“+++”：0.05-0.2μM；“++++”：0.001-0.05μM.。
实施例1-1.N-[2-(4-[3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛-3-基]-2,5-二氟苯基)乙基]-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺
Figure BDA0003011569000000151
步骤1. 1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸
在0℃下向1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸甲酯(3.00g，17.0mmol在N,N-二甲基甲酰胺(80mL)中的搅拌溶液中添加氢化钠(2.04g，51.1mmol，60％分散液)。将所得溶液在0℃下搅拌1h。在0℃下加入碘乙烷(2.73mL，34.1mmol)。将所得溶液在室温(25℃)下搅拌10h。用10mL水淬灭反应。搅拌0.5h后，用盐酸(3N)将溶液的pH值调节至7～8。将得到的混合物用乙酸乙酯(6x50mL)萃取。合并有机层，用盐水(50mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到黄色固体的1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸，其不经进一步纯化继续使用。LCMS:(ESI,m/z):191[M+H]+
步骤2.甲酰基(乙烯基)氨基甲酸苄酯
在0℃下，向N-乙烯基甲酰胺(100g，1.41mol)在四氢呋喃(2L)中的搅拌溶液中加入氯甲酸苄酯(220mL，1.54mol)。将所得溶液在冰/盐浴中于0℃搅拌30分钟。将所得溶液再搅拌2h，同时将温度保持在25℃，然后通过添加NH4Cl(饱和；500mL)淬灭。将所得混合物用乙酸乙酯(4x500mL)萃取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到浅黄色油状的甲酰基(乙烯基)氨基甲酸苄酯。LCMS:(ESI,m/z):206[M+H]+
步骤3.乙烯基氨基甲酸苄酯
将氢氧化钠(800g，20.0mol)在水(1L)中的溶液添加到甲酰基(乙烯基)氨基甲酸苄酯(166g，808mmol)在四氢呋喃(1L)中的搅拌溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌3h，然后在真空下除去溶剂。将所得残余物用乙酸乙酯(3x500mL)萃取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(用1/10乙酸乙酯/石油醚洗脱)，得到浅黄色固体的乙烯基氨基甲酸苄酯。LCMS:(ESI,m/z):178[M+H]+
步骤4.(2-(三氟-λ4-硼烷基)乙基)氨基甲酸苄酯，钾盐
在0℃下，在氮气下向2,5-二甲基己-2,4-二烯(88.5mL，0.622mol)在四氢呋喃(500mL，6.17mol)中的溶液中添加BH3(313mL，在THF中1M)溶液。将所得溶液在水/冰浴中于0℃搅拌3.5h。然后将乙烯基氨基甲酸苄酯(20.0g，113mmol)添加到混合物中，同时保持温度在0℃。使所得溶液升温至25℃，搅拌2h，在冰浴中冷却，然后小心地加入H2O(35mL)。在25℃下再过2h后，添加甲醛(15mL，37％)水溶液。然后将所得混合物在25℃下搅拌过夜。将反应用盐水淬灭，并将所得混合物用乙酸乙酯(3x500mL)萃取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。向残余物中加入丙酮(500mL)、水(100mL)和KHF2(220g，2.82mol)。将混合物在25℃下再搅拌4h。真空除去溶剂。然后将残余物用热丙酮(500mL)萃取。滤出不溶盐，并将滤液在真空下浓缩。通过溶解于热丙酮中并在Et2O(350mL)中沉淀来纯化粗化合物，得到白色固体的(2-(三氟-λ4-硼烷基)乙基)氨基甲酸苄酯钾盐。HRMS(ESI-,m/z):212[M-K+]
步骤5. 3-(4-溴-2,5-二氟苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
1,4-二溴-2,5-二氟苯(15.0g，55.0mmol)、3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(10.6g，49.9mmol)、Pd2(dba)3.CHCl3(2.59g，2.50mmol)、XantPhos(2.89g，5.00mmol)和叔丁醇钠(9.60g，99.9mmol)在甲苯(500mL)中的混合物在氮气下在70℃搅拌45min。冷却至25℃后，将所得混合物在真空下浓缩。将所得残余物通过硅胶柱色谱法纯化(用1:10乙酸乙酯/石油醚洗脱)，得到浅黄色油状的3-(4-溴-2,5-二氟苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。LCMS:(ESI,m/z):403,405[M+H]+
步骤6. 3-[4-(2-[[([苄氧基)羰基]氨基]乙基)-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
3-(4-溴-2,5-二氟苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(14.0g，34.7mmol)、(2-(三氟-λ4-硼烷基)乙基)氨基甲酸苄酯，钾盐(10.9g，38.2mmol)、Pd(dppf)Cl2(2.55g，3.49mmol)、RuPhos(3.25g，6.96mmol)、Cs2CO3(22.7g，69.7mmol)、甲苯(500mL)和水(100mL)的混合物在氮气下在100℃下搅拌3h。冷却至25℃后，将所得混合物在真空下浓缩。得到的残余物通过硅胶柱色谱法纯化(用1:5乙酸乙酯/石油醚洗脱)，得到黄色油状的3-[4-(2-[[([苄氧基)羰基]氨基]乙基)-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。LCMS:(ESI,m/z):502[M+H]+
步骤7. 3-[4-(2-氨基乙基)-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将3-[4-(2-[[(苄氧基)羰基]氨基]乙基)-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(12.0g，23.9mmol)、碳载钯(12.0g，10％)和乙酸乙酯(500mL)的混合物在氢气气氛(气球)下于20℃搅拌1h。用氮气吹扫氢气气氛，并通过硅藻土过滤除去固体。真空浓缩滤液，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(用10:1二氯甲烷/甲醇洗脱)，得到浅黄色油状的3-[4-(2-氨基乙基)-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。LCMS:(ESI,m/z):368[M+H]+
步骤8. 3-[4-[2-([1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基]甲酰胺基]乙基]-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸(60mg，0.32mmol)、3-[4-(2-氨基乙基)-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(116mg，0.320mmol)、HOBt(51mg，0.38mmol)、EDCI(86mg，0.450mmol)和DIEA(0.100mL，0.630mmol)在二氯甲烷(8mL)中的溶液在40℃油浴中搅拌2h。将得到的混合物真空浓缩，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(用1/1乙酸乙酯/石油醚洗脱)。合并收集的级分并真空浓缩，得到白色固体的3-[4-[2-([1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基]甲酰胺基]乙基]-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。LCMS(ESI,m/z):540[M+H]+.
步骤9.N-[2-(4-[3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛-3-基]-2,5-二氟苯基)乙基]-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺
将3-[4-[2-([1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基]甲酰胺基)乙基]-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(50mg，0.090mmol)和三氟乙酸(1mL)在二氯甲烷(5mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。将得到的混合物真空浓缩，得到残余物，将其用NH3溶液(2mL，在MeOH中7M)处理。将所得溶液搅拌0.5h，然后真空浓缩，得到残余物，将其通过制备型HPLC(柱：XBridge BEH C18 OBD制备柱，
Figure BDA0003011569000000192
5μm,19mm×150mm；流动相，A：水(含有10mmol NH4HCO3)和B：MeCN(18％直至38％，在7min内)；流速：30mL/min；检测器：254&220nm)，得到N-[2-(4-[3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛-3-基]-2,5-二氟苯基)乙基]-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺白色固体。
1H-NMR(CD3OD,400MHz)δ(ppm):8.66(s,1H),8.36(s,1H),7.52(d,J＝3.6Hz,1H),7.01-6.96(m,1H),6.66(dd,J＝11.6,7.6Hz,1H),6.59(d,J＝3.6Hz,1H),4.36(q,J＝7.2Hz,2H),3.63-3.56(m,4H),3.23–3.20(m,2H),2.91–2.87(m,4H),2.02-1.97(m,2H),1.93-1.84(m,2H),1.45(t,J＝7.2Hz,3H).LCMS(ES,m/z):440[M+H]+
表1中的化合物可以使用针对实施例1-1所述的方法制备
表1.
Figure BDA0003011569000000191
Figure BDA0003011569000000201
Figure BDA0003011569000000211
Figure BDA0003011569000000221
Figure BDA0003011569000000231
实施例2-1和2-2.N-[(2S)-2-[2,5-二氟-4-(哌嗪-1-基)苯基]丙基]-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺和N-[(2R)-2-[2,5-二氟-4-(哌嗪-1-基)苯基]丙基]-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺
Figure BDA0003011569000000241
步骤1. 4-(4-溴-2,5-二氟苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将1,4-二溴-2,5-二氟苯(2.97g，10.9mmol)、哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.86g，9.99mmol)、Pd2(dba)3.CHCl3(0.518g，0.500mmol)、XantPhos(0.579g，1.00mmol)和t-BuONa(1.92g，20.0mmol)在甲苯(100mL)中的混合物在氮气下在70℃搅拌1h。冷却至室温(25℃)后，将所得混合物用H2O(50mL)稀释，然后用乙酸乙酯(3x40mL)萃取。将有机层合并，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到残余物，将其用硅胶柱色谱法纯化(用1/100-1/6乙酸乙酯/石油醚洗脱)，得到浅黄色固体的4-(4-溴-2,5-二氟苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。LCMS(ESI,m/z):377[M+H]+。
步骤2. 4-(4-乙酰基-2,5-二氟苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
4-(4-溴-2,5-二氟苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(2.30g，6.10mmol)、Pd(dppf)Cl2(1.23g，1.68mmol)、DIEA(3.71mL，22.4mmol)、和三丁基(1-乙氧基乙烯基)锡烷(1.23g，3.41mmol)在甲苯(100mL)中的溶液在氮气下在80℃搅拌18h。冷却至室温(25℃)后，将所得混合物用H2O(50mL)稀释，并用乙酸乙酯(3x40mL)萃取。合并有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(用1/100-1/2乙酸乙酯/石油醚洗脱)，得到4-(4-乙酰基-2,5-二氟苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯黄色固体。LCMS(ESI,m/z):341[M+H]+。
步骤3. 4-[4-(1-氰乙基)-2,5-二氟苯基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将4-(4-乙酰基-2,5-二氟苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.70g，4.99mmol)、t-BuOK(1.40g，12.5mmol)和TOSMIC(1.46g，7.49mmol)在叔丁醇(20mL)和乙二醇二甲醚(20mL)中的溶液在90℃搅拌18h。冷却至室温(25℃)后，将所得混合物用H2O(10mL)稀释，然后用乙酸乙酯(3x20mL)萃取。合并有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(用1/100-1/5乙酸乙酯/石油醚洗脱)，得到黄色油状的4-[4-(1-氰乙基)-2,5-二氟苯基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯。LCMS(ESI,m/z):352[M+H]+。
步骤4. 4-[4-(1-氨基丙-2-基)-2,5-二氟苯基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将NH3(7M)于甲醇(20mL)中的溶液添加至4-[4-(1-氰基乙基)-2,5-二氟苯基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(800mg，2.28mmol)于甲醇(20mL)中的搅拌溶液中。将该溶液置于氮气下，并向其中加入雷尼镍(湿)(800mg)。将所得混合物在25℃在氢气气氛(气球)下搅拌2h。通过硅藻土过滤除去固体，并真空浓缩滤液，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(用10/1二氯甲烷/甲醇洗脱)，得到4-[4-(1-氨基丙-2-基)-2,5-二氟苯基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯黄色油。LCMS(ESI,m/z):356[M+H]+。
步骤5.(S)-4-(4-(1-(1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺基)丙-2-基)-2,5-二氟苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯和(R)-4-(4-(1-(1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺基)丙-2-基)-2,5-二氟苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将4-[4-(1-氨基丙-2-基)-2,5-二氟苯基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.150g，0.420mmol)、1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸(上述合成；0.080g，0.420mmol)、EDCI(0.097g，0.510mmol)、HOBt(0.068g，0.500mmol)和DIEA(0.210mL，1.26mMol)在N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中的溶液在25℃搅拌18h。用H2O(10mL)稀释所得混合物，然后用乙酸乙酯(3x20mL)萃取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(用1/1乙酸乙酯/石油醚洗脱)，得到4-(4-(1-(1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺基)丙-2-基)-2,5-二氟苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。通过手性制备HPLC(柱，CHIRAL ART Cellulose-SB，2x25cm，5um；流动相，A：己烷和B：EtOH(30分钟内保持30％)；流速：20mL/min；检测器：220/254nm；RT1：10.28min；RT2：12.26min)，将外消旋产物分离为其单个对映异构体。收集具有第一洗脱异构体的级分(RT1:10.28min)，真空浓缩，得到白色油状物的(S)-4-(4-(1-(1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺基)丙-2-基)-2,5-二氟苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。收集第二洗脱的异构体级分(RT1:12.26min)，真空浓缩，得到白色油状物的(R)-4-(4-(1-(1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺基)丙-2-基)-2,5-二氟苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。LCMS(ESI,m/z):528[M+H]+。
步骤6.N-[(2S)-2-[2,5-二氟-4-(哌嗪-1-基)苯基]丙基]-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺
将(S)-4-(4-(1-(1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺基)丙-2-基)-2,5-二氟苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.050g，0.090mmol)和三氟乙酸(1mL)在二氯甲烷(4mL)中的溶液在25℃搅拌30min。将所得混合物真空浓缩，得到残余物，将其溶于DCM(5mL)。用NH3(7M)在MeOH中的溶液将pH值调节至8，将所得混合物真空浓缩，得到残余物，将其通过制备型HPLC纯化(柱：XBridge BEH C18 OBD制备柱，
Figure BDA0003011569000000271
5μm，19mm×150mm；流动相，A：水(含10mmol NH4HCO3)，和B：MeCN(30％至47％，在7min内)；流速：20mL/min；检测器：254和220nm)，得到N-[(2S)-2-[2,5-二氟-4-(哌嗪-1-基)苯基]丙基]-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺黄色固体。1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):8.60(s,1H),8.26(s,1H),7.29(d,J＝3.6Hz,1H),6.93(dd,J＝12.8,6.8Hz,1H),6.63(dd,J＝11.6,7.6Hz,1H),6.52(d,J＝3.6Hz,1H),6.07(br s,1H),4.38-4.33(m,2H),3.84–3.77(m,1H),3.54-3.47(m,1H),3.40–3.34(m,1H),3.07-3.05(m,8H),1.48(d,J＝7.2Hz,3H),1.32(d,J＝6.8Hz,3H)。LCMS(ESI,m/z):428[M+H]+。
步骤7.N-[(2R)-2-[2,5-二氟-4-(哌嗪-1-基)苯基]丙基]-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺
将(R)-4-(4-(1-(1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺基)丙-2-基)-2,5-二氟苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.050g，0.090mmol)和三氟乙酸(1mL)在二氯甲烷(4mL)中的溶液在25℃搅拌30分钟。将所得混合物在真空下浓缩成用DCM(5mL)稀释的溶液。用NH3(7M)在MeOH中的溶液将溶液的pH值调节至8。将所得混合物在真空下浓缩成残余物，将其通过制备型HPLC纯化(柱：XBridge BEH C18 OBD制备柱，
Figure BDA0003011569000000272
5μm，19mm×150mm；流动相，A：水(含10mmol NH4HCO3)，和B：MeCN(30％至47％，在7min内)；流速：20mL/min；检测器：254和220nm)，得到N-[(2R)-2-[2,5-二氟-4-(哌嗪-1-基)苯基]丙基]-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺黄色固体。1H-NMR(CD3OD,400MHz)δ(ppm):8.60(s,1H),8.31(s,1H),7.51(d,J＝3.6Hz,1H),6.93(dd,J＝13.2,6.8Hz,1H),6.74(dd,J＝12.0,7.2Hz,1H),6.57(d,J＝3.6Hz,1H),4.35(q,J＝7.2Hz,2H),3.63–3.60(m,1H),3.58-3.43(m,2H),3.04–3.02(m,8H),1.44(d,J＝7.2Hz,3H),1.30(d,J＝8.0Hz,3H)。LCMS(ESI,m/z):428[M+H]+。
表2中的化合物可以使用针对实施例2-1和2-2所述的方法制备。
表2.
Figure BDA0003011569000000281
Figure BDA0003011569000000291
实施例3-1. 3-氯-1-乙基-N-[2-[4-(哌嗪-1-基)苯基]乙基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺
Figure BDA0003011569000000301
步骤1. 1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸
在0℃下向1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸甲酯(3.00g，17.0mmol在N,N-二甲基甲酰胺(80mL)中的搅拌溶液中添加氢化钠(2.04g，51.1mmol，60％分散液)。将所得溶液在0℃下搅拌1h。然后在0℃下添加碘乙烷(2.73mL，34.1mmol)，将所得溶液在室温(25℃)下搅拌10h。用水(10mL)小心淬灭反应。搅拌0.5h后，用盐酸(3N)将溶液的pH值调节至7～8。将得到的混合物用乙酸乙酯(6x50mL)萃取。合并有机层，用盐水(50mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸黄色固体。LCMS:(ESI,m/z):191[M+H]+
步骤2. 3-氯-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸
将1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸(190mg，1.00mmol)和NCS(147mg，1.10mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液在20℃搅拌18h。所得溶液用30mL H2O稀释，然后用乙酸乙酯(3x20mL)萃取。合并有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(用1/1乙酸乙酯/石油醚洗脱)，得到3-氯-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸浅黄色油。LCMS(ESI,m/z):225,227[M+H]+。
步骤3. 4-[4-(氰甲基)苯基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将2-(4-溴苯基)乙腈(5.00g，25.6mmol)、哌嗪-1-甲酸叔丁酯(7.16g，38.5mmol)、Pd(OAc)2(1.15g，5.13mmol)、XPhos(4.89g，10.0mmol)、Cs2CO3(25.1g，76.9mmol)和甲苯(100mL)在氮气气氛下合并。将所得溶液在100℃下搅拌18h。冷却至20℃后，通过过滤除去固体，并将所得滤液在真空下浓缩，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(用1/2乙酸乙酯/石油醚洗脱)，得到4-[4-(氰甲基)苯基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯黄色固体。LCMS(ESI,m/z):302[M+H]+。
步骤4. 4-[4-(2-氨基乙基)苯基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将BH3(20mL，在THF中1M)溶液在氮气下添加到4-[4-(氰基甲基)苯基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.80g，5.98mmol)在THF(100mL)中的搅拌溶液中。将所得溶液在20℃搅拌2h，然后通过添加甲醇淬灭。将所得溶液在80℃搅拌2h。冷却至20℃后，将反应混合物在真空下浓缩，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(用2/1乙酸乙酯/石油醚洗脱)，得到4-[4-(2-氨基乙基)苯基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯黑色固体。LCMS(ESI,m/z):306[M+H]+。
步骤5. 4-(4-(2-(3-氯-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺基)乙基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
3-氯-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸(100mg，0.444mmol)、4-(4-(2-(氨基乙基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(163mg，0.530mmol)、EDCI(110mg，0.570mmol)、HOBt(73.0mg，0.540mmol)和DIEA(0.150mL，0.890mmol)合并到N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中并在20℃搅拌18h。将所得溶液用H2O(50mL)稀释，然后用乙酸乙酯(3x20mL)萃取。合并有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(用1/1乙酸乙酯/石油醚洗脱)，得到4-(4-(2-(3-氯-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺基)乙基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯浅黄色油。LCMS(ESI,m/z):512,514[M+H]+。
步骤6. 3-氯-1-乙基-N-[2-[4-(哌嗪-1-基)苯基]乙基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺
将4-(4-(2-(3-氯-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺基)乙基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(80.0mg，0.156mmol)和三氟乙酸(1mL)在二氯甲烷(4mL)中的溶液在20℃搅拌30min。将得到的混合物在真空下浓缩得到残余物，将其通过制备型HPLC纯化(柱名称：XBridge Prep C18 OBD柱，150mm*19mm，5um；流动相，A：水(含10mmol/L NH4HCO3)和B：MeCN(21％直至46％，在8min内)；探测器：UV 220&254nm)，得到3-氯-1-乙基-N-[2-[4-(哌嗪-1-基)苯基]乙基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺白色固体。
1H-NMR(CD3OD,300MHz)δ(ppm):8.77(s,1H),8.38(s,1H),7.62(s,1H),7.19(d,J＝8.4Hz,2H),6.96(d,J＝8.1Hz,2H),4.37(q,J＝7.2Hz,2H),3.62(t,J＝7.2Hz,2H),3.13-3.11(m,4H),3.03-3.00(m,4H),2.89(t,J＝7.2Hz,2H),1.47(t,J＝7.2Hz,3H)。LCMS(ESI,m/z):412,414[M+H]+。
表3中的化合物可以使用针对实施例3-1所述的方法制备。
表3.
Figure BDA0003011569000000331
实施例4-1：N-[2-(4-[3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛-3-基]-2,5-二氟苯基)乙基]-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酰胺
Figure BDA0003011569000000341
步骤1. 3-氯-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪
在0℃下，向3-氯-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪(0.300g，1.95mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(8mL)中的搅拌溶液中加入氢化钠(0.197g，4.92mmol；60％分散液)。将反应混合物在0℃搅拌30min。向其中加入碘乙烷(1.88mL，2.35mmol)。将所得溶液在25℃搅拌2h。然后通过加入NH4Cl(饱和；20mL)淬灭反应，然后用乙酸乙酯(3x20mL)萃取。合并有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(用1/1乙酸乙酯/石油醚洗脱)得到3-氯-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪黄色油状物。LCMS(ESI,m/z):182,184[M+H]+
步骤2. 7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸甲酯]
向50-mL压力反应器中加入3-氯-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪(0.110g，0.604mmol)、Pd(dppf)Cl2(0.044g，0.060mmol)、TEA(1mL)和甲醇(20mL)的混合物。将所得溶液在120℃下在油浴中在CO气氛(50atm)下搅拌14h。冷却至25℃后，将所得混合物真空浓缩得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(用1/20-1/1乙酸乙酯/石油醚洗脱)，得到7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸甲酯]黄色固体。LCMS(ESI,m/z):206[M+H]+
步骤3. 7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸
将氢氧化钠(0.098g，2.45mmol)在水(5mL)中的溶液添加至7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸甲酯(0.100g，0.488mmol)在甲醇(5mL)中的搅拌溶液中。将所得溶液在25℃搅拌18h。用盐酸(1N)将溶液的pH值调节至6，然后真空浓缩得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(用10/1二氯甲烷/甲醇洗脱)，得到7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸黄色固体。LCMS(ESI,m/z):192[M+H]+
步骤4. 3-[4-(2-[[([苄氧基)羰基]氨基]乙基)-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将3-(4-溴-2,5-二氟苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(14.0g，34.7mmol)、(2-(三氟-λ4-硼烷基)乙基)氨基甲酸苄酯，钾盐(10.9g，38.2mmol)、Pd(dppf)Cl2(2.55g，3.49mmol)、RuPhos(3.25g，6.96mmol)、Cs2CO3(22.7g，69.7mmol)、甲苯(500mL)和水(100mL)的混合物在氮气下在100℃搅拌3h。冷却至25℃后，将所得混合物在真空下浓缩得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(用1:5乙酸乙酯/石油醚洗脱)，得到3-[4-(2-[[([苄氧基)羰基]氨基]乙基)-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯黄色油。LCMS:(ESI,m/z):502[M+H]+
步骤5. 3-[4-(2-氨基乙基)-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将3-[4-(2-[[(苄氧基)羰基]氨基]乙基)-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(12.0g，23.9mmol)和碳载钯(12.0g，10％)在乙酸乙酯(500mL)中的混合物在20℃在氢气气氛(气球)下搅拌1h。通过硅藻土过滤除去固体，并将滤液在真空下浓缩得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(用10:1二氯甲烷/甲醇洗脱)，得到3-[4-(2-氨基乙基)-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯浅黄色油。LCMS:(ESI,m/z):368[M+H]+
步骤6. 3-[4-[2-([7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-基]甲酰胺基)乙基]-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸(0.30g，0.159mmol)、3-[4-(2-氨基乙基)-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(0.070g，0.190mmol)、EDCI(0.039g，0.200mmol)、HOBT(0.026g，0.190mmol)和DIEA(0.130mL，0.320mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中的溶液在25℃搅拌18h。将所得混合物用H2O(10mL)稀释，然后用乙酸乙酯(3x20mL)萃取。合并有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(用1/10-1/1乙酸乙酯/石油醚洗脱)，得到3-[4-[2-([7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-基]甲酰胺基)乙基]-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯白色固体。LCMS(ESI,m/z):541[M+H]+
步骤7.N-[2-(4-[3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛-3-基]-2,5-二氟苯基)乙基]-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酰胺
将3-[4-[2-([7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-基]甲酰胺基)乙基]-2,5-二氟苯基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(0.022mg，0.041mmol)和三氟乙酸(1mL)在二氯甲烷(5mL)中的溶液在20℃搅拌30min。将所得混合物在真空下浓缩得到残余物，将其溶于DCM(5mL)中。用NH3(7M)在MeOH中的溶液将pH值调节至8，将所得混合物真空浓缩，得到残余物，将其通过制备型HPLC纯化(柱：XBridge BEH C18 OBD制备柱，
Figure BDA0003011569000000371
5μm，19mm×150mm；流动相，A：水(含0.05％NH3H2O)和B：MeCN(30％至45％，在8分钟内)；流速：20mL/min；检测器：254和220nm)，得到N-[2-(4-[3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛-3-基]-2,5-二氟苯基)乙基]-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酰胺白色固体。
1H-NMR(CD3OD,300MHz)δ(ppm):8.43(s,1H),7.86(d,J＝3.6Hz,1H),7.01-6.94(m,1H),6.71(d,J＝3.3Hz,1H),6.66-6.59(m,1H),4.54(q,J＝7.2Hz,2H),3.70-3.64(m,2H),3.56-3.53(m,2H),3.29-3.17(m,2H),2.93-2.84(m,4H),2.04-1.96(m,2H),1.87-1.78(m,2H),1.58-1.46(t,J＝7.2Hz,3H)。LCMS(ES,m/z):441[M+H]+
表4中的化合物可以使用针对实施例2-1、2-2和4-1所述的方法制备。
表4.
Figure BDA0003011569000000372
Figure BDA0003011569000000381
Figure BDA0003011569000000391

Claims (16)

1.一种式(I)化合物：
Figure FDA0003011568990000011
或其药学上可接受的形式，其中：
X选自N或C(R’)；
R'选自氢、氘和CH3；
Y是C(R)；
R选自氢、NH2和C1-C4烷基；
R1选自Rx、氢、C1-C5直链和C3-C5支链烷基，其中所述烷基任选地被一个或多个Rx取代；
Rx选自在USP28和/或USP25生化测定中表现出活性的小的亲脂性和/或吸电子基团，
R2选自氢和卤素；
R3、R4和R4’各自独立地选自氢和C1-C4烷基；
R5选自6至8元杂环；
R6选自氢、氘、卤素、C1-C4烷基和-CN；以及
n为0、1或2。
2.如权利要求1所述的化合物，其中X为C(R')；R’选自氢和氘；R为NH2；R1、R2、R3、R4和R4’为氢；R5选自6元杂环，且n为0。
3.如权利要求1所述的化合物，其中X为C(R')；R’选自氢和氘；R为氢；R1选自任选地被1至3个Rx取代的C1-C3直链烷基；Rx选自卤素和-OH；R2和R3为氢；R4和R4’选自氢和CH3；R5选自6-8元杂环；R6选自氢、氘和卤素；且n为0、1或2。
4.如权利要求1所述的化合物，其中X为C(R')；R’选自氢；R为氢；R1选自任选地被1至3个Rx取代的甲基和乙基；Rx选自卤素和-OH；R2和R3为氢；R4和R4’选自氢和CH3；R5选自6-8元杂环；R6选自氢和卤素；且n为0、1或2。
5.如权利要求1所述的化合物，其中X为C(R')；R’选自氢和氘；R为氢；R1选自任选地被1至3个Rx取代的C3-C4支链烷基；Rx选自卤素和-OH；R2和R3为氢；R4和R4’选自氢和CH3；R5选自6-8元杂环；R6选自氢、氘和卤素；且n为0、1或2。
6.如权利要求1所述的化合物，其中X为C(R')；R’选自氢；R为氢；R1选自任选地被1至3个Rx取代的C3-C4支链烷基；Rx选自卤素和-OH；R2和R3为氢；R4和R4’选自氢；R5选自6-8元杂环；R6选自氢和卤素；且n为0、1或2。
7.如权利要求1所述的化合物，其中X为C(R')；R’选自氢；R为氢；R1为氢；R2为卤素；R3为氢；R4和R4’选自氢；R5选自6-8元杂环；R6选自氢和卤素；且n为0、1或2。
8.如权利要求1所述的化合物，其中X为C(R')；R’选自氢；R为氢；R1选自氢和任选地被1至3个Rx取代的C1-C3直链烷基；Rx选自卤素和-OH；R2为卤素；R3为氢；R4和R4’选自氢；R5选自6-8元杂环；R6选自氢和卤素；且n为0、1或2。
9.如权利要求1所述的化合物，其中X为N；R为氢；R1选自氢和任选地被1至3个Rx取代的C1-C3直链烷基；Rx选自卤素和-OH；R2为氢；R3为氢；R4和R4’选自氢和CH3；R5选自6-8元杂环；R6选自氢和卤素；且n为0、1或2。
10.如权利要求1至10中任一项所述的化合物，其中R5选自具有两个氮的6-8元杂环。
11.如权利要求1至10中任一项所述的化合物，其中所述卤素选自F和Cl。
12.如权利要求1至11中任一项所述的化合物，其中所述化合物是
a.在如本文实施例A-1(a)中所述的USP28的泛素-罗丹明110测定中具有0.001-10微摩尔的IC50的USP28抑制剂化合物；和/或
b.在如本文实施例A-1(b)中所述的USP28的泛素-罗丹明110测定中具有0.001-10微摩尔的IC50的USP28抑制剂化合物；和/或
c.在如本文实施例A-2中所述的USP25的泛素-罗丹明110测定中具有0.001-10微摩尔的IC50的USP25抑制剂化合物。
13.如权利要求12所述的化合物，其中所述化合物是：
a.在如本文实施例A-1(a)中所述的USP28的泛素-罗丹明110测定中具有0.001-2微摩尔的IC50的USP28抑制剂化合物；和/或
b.在如本文实施例A-1(b)中所述的USP28的泛素-罗丹明110测定中具有0.001-2微摩尔的IC50的USP28抑制剂化合物；和/或
14.在如本文实施例A-2中所述的USP25的泛素-罗丹明110测定中具有0.001-2微摩尔的IC50的USP25抑制剂化合物。
15.如权利要求1所述的化合物，其选自：
Figure FDA0003011568990000041
Figure FDA0003011568990000051
Figure FDA0003011568990000061
16.一种组合物，其包含至少一种如权利要求1至15中任一项所述的化合物和生物学上可接受的载体。
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