CN112816637A - 一种吗替麦考酚酯片的体外溶出方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桥接吗替麦考酚酯片体内吸收速率的体外溶出方法。所述方法通过吗替麦考酚酯参比制剂的人体内吸收速率常数k_a逆向推导溶出介质的流速，其特征在于，所述k_a是由Loo‑Riegelman反卷积法解析，再根据公式吸收半衰期(t_1/2)＝0.693/k_a计算所述介质流速为t_1/2时间内替换溶出杯内一半的介质体积，所述介质流速为24mL/min。此外，所述方法还包括开放式溶出装置和pH4.5醋酸盐缓冲液溶出介质。本发明公开的体外溶出方法与体内吸收速率具有较好的相关性，可以反映不同吗替麦考酚酯片剂间的实际微分溶出能力。本发明为吗替麦考酚酯片的处方优化提供重要参考。

Description

一种吗替麦考酚酯片的体外溶出方法

技术领域

本发明专利属于药品溶出度试验技术领域，具体涉及一种桥接吗替麦考酚酯片体内吸收速率的体外溶出方法。

背景技术

仿制药物一致性评价中，通常以大数据重构、物理化学等反向工程，通过剖析参比制剂的处方组成和制剂工艺等，指导仿制药的研发，为企业广泛采取的研究思路。然而，仿制药研发的成功与否最终取决于人体生物等效性(BE)试验结果。目前，体外溶出实验被认为可以预估体内溶出行为和吸收情况，但是，由于人体内环境的复杂性，经常造成制剂间体外溶出行为相似而人体内BE不等效的现象，给企业带来沉重的经济负担。若转换思路，将仿制药研发从生物药剂学与药物动力学的角度出发，即通过解析药物参比制剂的溶出/吸收动力学过程，了解药物吸收动力学变化对药物暴露量的影响，再建立体内外一致、相关或者高度区分的体外溶出方法，这样可以大大提高仿制药研发效率和成功率。现阶段，还未出现该设想及相关报道。

对于免疫抑制剂这种需要终身服用的药物，仿制药的细微差异可能会产生长期的副作用。其中，吗替麦考酚酯是用于器官移植术后排异反应和自身免疫性疾病治疗的一种免疫抑制剂，其参比制剂的专利已经过期，国内仿制药正在加速研发。目前，企业主要以美国药典(USP)收录的吗替麦考酚酯溶出度方法测定体外溶出曲线，作为其仿制药质量控制的标准，USP的方法为：桨法，900mL的0.1N盐酸溶液为溶出介质，转速为50rpm，取样点至15min，即15min内吗替麦考酚酯片溶出度达到85％及以上。但是，成人口服吗替麦考酚酯片的体内达峰时间约为1h。所以，体外溶出方法与体内实际差异较大，无法反映人体内的实际溶出情况。另一方面，吗替麦考酚酯口服后同时存在体内溶出与吸收的动态持续过程，而传统闭合式的溶出方法没有考虑吸收机制，其释药速率明显快于体内的释放/吸收过程，可能导致体外溶出行为相似而体内BE不等效。

发明内容

本发明目的在于提供一种桥接吗替麦考酚酯体内吸收速率的体外溶出方法，旨在提供一种可以良好预测人体生物等效性(BE)的体外溶出测定方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种吗替麦考酚酯片的体外溶出方法，基于吗替麦考酚酯片的体内溶出/吸收动态过程逆向构建体外溶出方法，其步骤为：

基于吗替麦考酚酯片参比制剂的体内溶出/吸收动态过程获得体内吸收半衰期t_1/2；

采用开放式溶出装置中进行溶出测定；

所述的开放式溶出装置包括内室多孔滤膜杯和外室溶出杯，所述外室溶出杯套置于所述内室多孔滤膜杯外，所述内室多孔滤膜杯内设有转篮，插设在所述内室多孔滤膜杯中的介质输入管路与溶出介质源连通，插设在所述外室溶出杯和内室多孔滤膜杯之间的采样针通过出液总路连接至集样三通阀，所述集样三通阀的两输出端分别连接至集样器和废液收集瓶，所述介质输入管路和出液总路上分别设有进液泵和出液泵；

预先向外室溶出杯中加入溶出介质，控制原始的体积为V；将待测吗替麦考酚酯片置于转篮中，并浸泡在溶出介质中；转动转蓝，并开启进液泵和出液泵，进行开放式测定；并控制测定过程中，介质输入管路的溶出介质的输入流速为0.45～0.63V/t_1/2。

现有制剂的研发逻辑通常是预先进行体外溶出测定，待体外溶出测定合格后再进行人体BE临床试验。然而，现有的体外溶出方法和体内实际溶出和吸收行为存在一定的偶然性，尤其对于难溶性药物，难以基于体外溶出结果较为准确的判断人体生物等效性结果。为解决该技术问题，本发明创新地提出一种基于药物在体内的溶出/吸收行为逆向构建体外溶出方法的全新思路；其创新地基于所述的开放式溶出设备，并配合所述人体内、体外桥接公式设计，如此能够创新地实现体内、体外溶出行为相关性评估，能够有效实现体外溶出测定的前提下，还能够快速、准确地预测其人体生物等效性。本发明技术方案，在行业内开创性地能够实现体外溶出以及人体生物等效性的同步测定和评估，为药物制剂的开发提供了一种简便、低成本、行之有效的思路。

本发明技术方案，填补制剂的体外溶出以及体内BE性能关联测定、实现体外溶出测定的同时，并同步实现体内BE性能关联性评估的技术空白。本发明人还研究发现，通过对开放式溶出设备的结构、体内外桥接公式的优化、溶出介质以及溶出介质的输送/输出流速比以及转速的联合控制，有助于进一步改善体外溶出与人体生物等效性的相关性，提高BE结果的预测准确性。

进一步的，所述介质输入管路通过介质选择器分出多条与介质储存瓶连通的介质输送支路，在各介质输送支路上均设有进液控制阀。根据具体药物的不同，介质选择器可以在不同时间段选择不同的溶出介质进入内室多孔滤膜杯，对药物进行溶出。

进一步的，所述内室多孔滤膜杯包括多孔钢杯和包裹在所述多孔钢杯外的滤膜。具体的，微孔滤膜的孔径为0.1～10μm，所述的多孔钢杯的孔径为100～1200目，尺寸直径为3～6cm，高10～12cm，可装50～500mL体积的溶出介质，转篮可以完全浸入溶出介质中，适用于难溶性药物溶解。

进一步的，所述内室多孔滤膜杯的内锥底内填充有惰性微球，可以模拟进食条件下的溶出行为。

进一步的，所述外室溶出杯的顶部开口端上设有可启闭的顶盖，所述转篮的一端从所述顶盖穿出与搅拌泵传动连接，使得多孔滤膜杯内的溶出介质具有不同横向转速，可以模拟体内胃肠道的生理蠕动对药物溶出的影响，更加真实的模拟药物在胃肠道内的溶出行为。

进一步的，所述集样三通阀与所述集样器之间的管路上设有集样控制阀，以实现定时采样。

进一步的，还包括外部水浴槽和恒温水浴槽，各个所述介质储存瓶通过所述水浴槽进行预热和保温，外室溶出杯置于恒温水浴槽中，以保证内室多孔滤膜杯内的溶出介质维持恒温，使释放介质与体内胃肠道的生理温度相近。

作为优选，溶出测定过程中，转蓝的搅拌转速为75～100rpm。

作为优选，t_1/2＝0.693/k_a，其中，k_a为吗替麦考酚酯片的体内吸收速率。

作为优选，所述吗替麦考酚酯片的体内吸收速率常数k_a通过Loo-Riegelman或Wagner-Nelson反卷积分法计算，优选符合双室模型的Loo-Riegelman法。

作为优选，测定过程的溶出介质的输入流速为0.5V/t_1/2。

作为优选，溶出介质初始体积(V)为50～500mL。

进一步地，解析进液量和出液量的速度为24mL/min。

作为优选，测定过程中，输入速度和输出速度相等。本发明中通过调节输入/输出溶出介质的参数，使介质进液和出液速度相等，保持溶出装置内介质总体积不变。

作为优选，溶出介质选择模拟生理介质，优选模拟餐后状态胃液或pH4.5醋酸盐缓冲液，模拟吗替麦考酚酯片于餐后条件的体内溶出环境。

与现有技术相比，本发明具有的优势在于：

1、本发明填补了吗替麦考酚酯片体外溶出以及体内BE的相关性测定的技术空白；

2、为成功实现吗替麦考酚酯片体外溶出以及体内BE的相关性测定，本发明创新地采用开放式设备，并基于吗替麦考酚酯片体内溶出和吸收行为构建所述的桥接公式，指导体外溶出测定手段的有目的性设计，从而实现体外溶出和体内BE的相关性测定；

3、为了进一步改善体外溶出以及体内BE测定的相关性以及准确率，本发明还发现，基于所述的开放式溶出设备的结构、桥接公式、溶出介质以及搅拌转速的优化联合，有助于进一步改善体外、体内手段的测定相关性，有助于进一步改善BE预测的准确性。

附图说明

图1为实施例1中开放式溶出装置的结构图；

图2为实施例2中吗替麦考酚酯在不同溶出介质中的溶解度；

图3为实施例3中吗替麦考酚酯片参比制剂和两自制制剂的微分溶出曲线；

图4为实施例3中吗替麦考酚酯片参比制剂和两自制制剂的累积溶出曲线；

图5为实施例5中解析得到的吗替麦考酚酯片参比制剂和两自制制剂的体外累积溶出度(F_diss)与体内吸收分数(F_abs)的回归曲线和相关系数；

图6为实施例6采用的开放式溶出设备的结构图；

图7为实施例6获取的吗替麦考酚酯片参比制剂和两自制制剂的累积溶出曲线；

图8为实施例6中解析得到的吗替麦考酚酯片参比制剂和两自制制剂的F_diss与F_abs的回归曲线和相关系数；

图9为实施例7中吗替麦考酚酯片参比制剂在不同流速下的累积溶出曲线；

图10为实施例8中吗替麦考酚酯片参比制剂在不同转速下的累积溶出曲线；

图11为对比例1获取的吗替麦考酚酯片参比制剂和两自制制剂的累积溶出曲线；

图12为对比例1中解析得到的吗替麦考酚酯片参比制剂和两自制制剂的F_diss与F_abs的回归曲线和相关系数；

图13为对比例2中降低流速后吗替麦考酚酯片参比制剂和两自制制剂的累积溶出曲线。

具体实施方式

通过下述实例将有助于理解本发明，但不局限本发明的内容。

以下案例，所述的吗替麦考酚酯片参比制剂为

(规格：0.5g，生产商：罗氏制药有限公司)。

实施例1

数据库检索成人口服吗替麦考酚酯片参比制剂后体内的血药浓度数值，通过WinNonlin8.2软件进行拟合，明确吗替麦考酚酯片的体内过程满足双室模型，因此，选择Loo-Riegelman法解析体内吸收速率常数k_a，再根据公式t_1/2＝0.693/k_a计算吸收半衰期t_1/2。

本发明采用了开放式溶出装置，以介质流速模拟药物体内溶出/吸收速率，所以体内吸收半衰期应与体外溶出介质流速相对应。

采用的开放式溶出装置的结构如图1所示，主要包括顶端开放的内室多孔滤膜杯9和外室溶出杯8，外室溶出杯8套置于内室多孔滤膜杯9外，内室多孔滤膜杯9上设有连通外室溶出杯8的渗滤孔，内室多孔滤膜杯9内部设有装有药物12(口服药物制剂)的转篮11，插设在外室溶出杯8和内室多孔滤膜杯9之间的采样针13将外室溶出杯8内的溶出介质通过出液总路15实时输送至集样三通阀16，集样三通阀16分出两条分别与集样器18和废液收集瓶19连通的出液支路，插设在内室多孔滤膜杯9中的介质输入管路7与介质选择器5连接，介质选择器5则通过介质输送支路3与装有溶出介质的介质储存瓶2连通，介质输入管路7和出液总路15上分别设有进液泵6和出液泵14，介质输入管路7进液口的流量和采样针13的采集量相等，以保证内室多孔滤膜杯9和外室溶出杯8内溶出介质含量的稳定。

预先向外室溶出杯中加入溶出介质，控制原始的体积为V(本案例为300mL)；将待测吗替麦考酚酯片置于转篮中，并浸泡在溶出介质中；转动转蓝，并开启进液泵和出液泵，进行开放式测定；并控制测定过程中，介质输入管路的溶出介质的输入流速为0.5V/t_1/2；

所述的t_1/2为吗替麦考酚酯片的吸收半衰期，通过换算为6.25min。

体外溶出测定过程中，溶出介质输入速度和溶出体系输出速度相同。

进而测定得到待测吗替麦考酚酯片的体外溶出结果。

实施例2

和实施例1相比，区别仅在于，控制溶出介质的种类，具体为：

取适量的吗替麦考酚酯原料药分别加入至固定体积的模拟餐后胃液(FeSSGF)、模拟禁食胃液(FaSSGF)、模拟餐后肠液(FeSSIF-V2)、模拟禁食肠液(FaSSIF-V2)、pH6.8磷酸盐缓冲液、pH4.5醋酸盐缓冲液、pH5.0磷酸盐缓冲液、pH1.2盐酸溶液，于37℃下振荡12h后，5000rpm离心取上清液，采用高效液相色谱法测定上清液中吗替麦考酚酯的含量，所有样品平行3次。结果显示(图2)，吗替麦考酚酯的溶解度随着介质pH的降低而显著提高，其中该药在FeSSGF和pH4.5醋酸盐缓冲液中的溶解度无显著性差异(p＞0.05)。所以，pH4.5醋酸盐溶液可以替代FeSSGF，作为溶出介质，模拟吗替麦考酚酯片剂口服后在胃内的溶出环境。

实施例3

本实施例结合实施例1、2获取的优选溶出条件，应用于开放式溶出装置(同实施例1)中，用以鉴别不同吗替麦考酚酯片的溶出能力。具体地，开放式溶出装置的溶出条件：以pH4.5醋酸盐缓冲液为溶出介质，温度为37±0.5℃，流速设置为0.5V/t_1/2。分别投入吗替麦考酚酯参比制剂、自制制剂1和自制制剂2各一粒，于溶出开始后5、10、15、20、30、40、50、60、75、90、105、120、150min分别取样1.5mL，5000rpm离心3min，取上清液，采用高效液相色谱法测定不同时间点的吗替麦考酚酯浓度，绘制微分溶出曲线和累积溶出曲线。结果显示，吗替麦考酚酯片剂在不同时间点的溶出能力(微分溶出曲线)如图3所示，溶出实验开始的5分钟内，自制制剂1的释放速率显著快于参比制剂和自制制剂2。参比制剂的溶出峰值为15分钟，而自制制剂1的峰值浓度为10分钟，而自制制剂2为20分钟。另外，参比制剂、自制制剂1和自制制剂2的溶出速率峰浓度分别为392.6±26.1、340.0±13.2和318.5±21.9μg/mL。所以，溶出能力总结为：溶出前5分钟内，释放速率为自制制剂2＞参比制剂＞自制制剂1；10～75分钟内，参比制剂释放速率始终保持最快，自制制剂2先快后慢，而自制制剂1先慢后快。75～150分钟内，自制制剂2＞参比制剂＞自制制剂1。累积释放百分比(图4)的结果表明，参比制剂的累积释放量高于自制制剂1和自制制剂2，主要因为10～75分钟内参比制剂溶出较快导致的。

实施例4

本实施例为了验证实施例3的体外溶出结果，开展的人体内BE试验。采用随机、开放、三周期、交叉试验设计对12例健康志愿者进行餐后的生物等效性研究。周期间洗脱期为7天，每周期志愿者分别口服吗替麦考酚酯参比或自制制剂500mg，采血时间设计为给药前(0h)及给药后10min、20min、30min、45min、1.0h、1.25h、1.5h、1.75h、2h、2.5h、3h、4h、5h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h分别采集上肢静脉血4mL。样品离心(3,500rpm，10min)，分离血浆，置于-80℃超低温冰箱中保存。由于吗替麦考酚酯口服后在人体内迅速代谢为麦考酚酸起生理作用，所以本研究通过测定血浆中麦考酚酸的含量代表吗替麦考酚酯的体内溶出与吸收。具体地，取100μL血浆样品，加入600μL无水甲醇(含内标)，涡旋5min，充分混匀，12,000rpm离心10min，取上清进高效液相色谱串联质谱仪分析血浆中麦考酚酸的含量。

通过WinNonlin8.2软件计算麦考酚酸的药动学参数，并采用双单侧t检验和计算90％置信区间的统计分析方法对不同制剂间麦考酚酸的吸收程度进行比较。所有统计分析均使用SPSS17.0进行。结果显示，餐后条件下，吗替麦考酚酯参比制剂和自制制剂的吸收速度均较快，达峰时间为1.25h。参比制剂、自制制剂1及自制制剂2的AUC_t分别为25.58±3.04、26.68±4.82、26.25±4.70μg·h/mL，C_max分别为11.01±2.66、9.99±3.97、8.81±2.88μg/mL。BE结果显示，两制剂的C_max不等效，90％置信区间范围为67.69～112.28％和63.20～96.53％，低于标准区间范围(80.00％～125.00％)，表明吗替麦考酚酯参比制剂的吸收速率高于两自制制剂，与体外结果一致。

实施例5

将实施例4中三制剂的药时曲线，采用Loo-Riegelman法解析口服吗替麦考酚酯后的吸收曲线，并与实施例3中的累积溶出度进行相关性分析。如图5所示，累积溶出度(F_diss)和累积吸收分数(F_abs)的相关系数R²＞0.93，斜率接近1.0，具有A级体内外相关性。

实施例6

和实施例3相比，所采用的开放式溶出装置原理相同，区别仅在于开放式溶出设备中未设转篮(无横向剪切力)(授权公告号：CN207263738U)。具体地，如图6所示的开放式设备(流通池)对不同吗替麦考酚酯片的溶出能力进行区分。分别投入参比制剂和两种自制制剂各一粒至流通池装置中(流通池直径为12mm)，其他条件与实施例3相同(温度为37±0.5℃，溶出介质为pH 4.5醋酸盐缓冲液，介质流速为0.5V/t_1/2)，分别于5、10、15、20、30、40、50、60、75、90、105、120、150分钟取样1.5mL，5000rpm离心3min，取上清液，进高效液相色谱仪检测样品中吗替麦考酚酯的浓度。结果显示，三制剂在150分钟的累积释放度均低于25％(图7)，结果差于实施例1。

该体外溶出结果与实施例4中所获得的吗替麦考酚酯片体内吸收曲线进行相关性分析发现，相关系数R²＜0.90，且斜率为0.2，相关性较差(图8)。

实施例7

单因素考察流速对吗替麦考酚酯溶出度及体内外相关性的影响，即以pH4.5醋酸盐缓冲液为溶出介质，温度为37±0.5℃，转篮转速设为75rpm，流速分别设为18、24、30mL/min。以参比制剂为筛选对象，以达到漏槽条件为溶出标准。结果显示，吗替麦考酚酯参比制剂120min内的累积溶出度随着流速的升高而显著提高，当达到24mL/min及以上时，累积溶出度不再升高，表明24～30mL/min可以使吗替麦考酚酯片剂达到漏槽条件，使其完全释放，且参比制剂的体内外相关性较好(图9)。另外，当流速设置为24mL/min时，吗替麦考酚酯的溶出峰浓度高于30mL/min，表明30mL/min的流速过大，导致溶出杯内吗替麦考酚酯被稀释。所以，最优选的介质流速为24mL/min。

实施例8

单因素考察转篮转速对吗替麦考酚酯溶出度及体内外相关性的影响，即以pH4.5醋酸盐缓冲液为溶出介质，温度为37±0.5℃，介质流速设为24mL/min，分别考察50rpm、75rpm、100rpm的转篮转速对吗替麦考酚酯微分溶出度及累积溶出度的影响。以参比制剂为筛选对象，以达到漏槽条件为溶出标准。结果显示，吗替麦考酚酯参比制剂120min内的累积溶出度随着转速的升高而提高，当达到75rpm及以上时，累积溶出度不再升高，表明75～100rpm可以提供合适的横向剪切力，促使吗替麦考酚酯片剂完全释放，且参比制剂的体内外相关性较好(图10)。

对比例1

为了详述本发明的优势，本实施例采用美国药典规定的传统方法(桨板法，封闭式设备)对吗替麦考酚酯片剂的溶出进行。具体地，使用900mL的溶出介质(pH4.5醋酸盐缓冲液)，转速为50rpm，温度为37±0.5℃，分别投入参比制剂和两种自制制剂各一粒，于15、30、45、60min分别取样5mL，并补充5mL新鲜介质，样品过滤(0.22μm)后，进高校液相色谱仪分析。结果显示，参比制剂和两种自制制剂的累积释放无法区分(图11)，将体外溶出曲线与实施例4获得吸收曲线进行相关性分析发现，该方法不具有体内外相关性(图12)。

对比例2

为了详述本发明的优势，本实施例降低介质流速(12mL/min)对吗替麦考酚酯参比制剂和受试制剂的溶出度进行考察，以pH4.5醋酸盐缓冲液为溶出介质，温度为37±0.5℃，转篮转速设为75rpm。结果显示，两制剂的累积溶出度不能很好的区分，且与实施例4的参比制剂与自制制剂的体内数据趋势不一致(图13)。

上述实施例仅仅是清楚地说明本发明所作的举例，而非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里也无需也无法对所有的实施例予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种吗替麦考酚酯片的体外溶出方法，其特征在于，基于吗替麦考酚酯片的体内溶出/吸收动态过程逆向构建体外溶出方法，其步骤为：

基于吗替麦考酚酯片参比制剂的体内溶出/吸收动态过程获得体内吸收半衰期t_1/2；

采用开放式溶出装置中进行溶出测定；

所述的开放式溶出装置包括内室多孔滤膜杯和外室溶出杯，所述外室溶出杯套置于所述内室多孔滤膜杯外，所述内室多孔滤膜杯内设有转篮，插设在所述内室多孔滤膜杯中的介质输入管路与溶出介质源连通，插设在所述外室溶出杯和内室多孔滤膜杯之间的采样针通过出液总路连接至集样三通阀，所述集样三通阀的两输出端分别连接至集样器和废液收集瓶，所述介质输入管路和出液总路上分别设有进液泵和出液泵；

预先向外室溶出杯中加入溶出介质，控制原始的体积为V；将待测吗替麦考酚酯片置于转篮中，并浸泡在溶出介质中；转动转蓝，并开启进液泵和出液泵，进行开放式测定；并控制测定过程中，介质输入管路的溶出介质的输入流速为0.45～0.63V/t_1/2。

2.如权利要求1所述的吗替麦考酚酯片的体外溶出方法，其特征在于，溶出测定过程中，转篮搅拌转速为75～100rpm。

3.如权利要求1所述的吗替麦考酚酯片的体外溶出方法，其特征在于，t_1/2＝0.693/k_a，其中，k_a为吗替麦考酚酯片参比制剂的体内吸收速率常数。

4.如权利要求3所述的吗替麦考酚酯片的体外溶出方法，其特征在于，所述吗替麦考酚酯片的体内吸收速率k_a通过Loo-Riegelman或Wagner-Nelson反卷积分法计算，优选符合双室模型的Loo-Riegelman法。

5.如权利要求1所述的吗替麦考酚酯片的体外溶出方法，其特征在于，所述溶出介质为模拟餐后状态胃液或pH4.5醋酸盐缓冲液。

6.如权利要求1～5任一项所述的吗替麦考酚酯片的体外溶出方法，其特征在于，测定过程的溶出介质的输入流速为0.5V/t_1/2。

7.如权利要求1所述的吗替麦考酚酯片的体外溶出方法，其特征在于，测定过程中，输入速度和输出速度相等。

8.根据权利要求1所述的溶出测定方法，其特征在于：V为50～500mL。

9.根据权利要求1所述的溶出测定方法，其特征在于：解析获得的介质流速为24mL/min。

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