CN112813173B - 从蜜蜂遗传图谱获取的保种蜜蜂诊断性STRs位点的PCR引物及其应用 - Google Patents

从蜜蜂遗传图谱获取的保种蜜蜂诊断性STRs位点的PCR引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了从蜜蜂遗传图谱获取的保种蜜蜂诊断性STRs位点的PCR引物及其应用。本发明所要保护的一个技术方案是获取蜜蜂DNA指纹图谱的成套引物对，成套引物对由序列表中SEQ ID No.1‑SEQ ID No.178共89种引物对中的n种引物对组成，n为89至1中的任一自然数。本发明所提供的89个诊断性STRs位点的成套引物对来源于蜜蜂遗传图谱AmeMap3，通过严格的PCR体系和PCR产物分析进行筛选得到，可最大程度地提供蜜蜂STRs固有的遗传背景信息，可用于鉴定保种蜜蜂的DNA分型，大大提高STRs标记技术鉴定保种蜜蜂的可靠性和实用性。

Description

从蜜蜂遗传图谱获取的保种蜜蜂诊断性STRs位点的PCR引物 及其应用
技术领域
本发明涉及动物生物技术领域，具体涉及从蜜蜂遗传图谱获取的保种蜜蜂诊断性STRs位点的PCR引物及其应用。
背景技术
动物DNA短串联重复序列(short tandem repeats，STRs)或植物DNA简单序列重复(simple sequence repeats，SSRs)是真核细胞基因组的组成型DNA序列，在形式上是由1～6个碱基长度类型的DNA序列单元重复排列形成的“弹性”DNA，在机制上主要是由于DNA复制滑动导致DNA扩展和收缩，广泛分布于基因间隔区等基因非编码区和内含子等基因编码区,具有重复频率变异特征，形成简单序列长度多态性，统称为微卫星DNA(microsatellite)[1,2]。其中，DNA序列单元为2～4个碱基长度类型的STRs在涉及遗传资源的保护遗传学(Conservation genetics)中被应用于动态监测和实时追踪种畜(breeds)的保存效果[3,4]。STRs标记技术的主要优势是遗传图谱STRs作为复等位基因通常不涉及DNA重组区，能够提供种畜繁育代次之间稳定的遗传背景信息[5]。
目前国内外有关蜜蜂(Apis mellifera)STRs标记技术总共涉及85个已应用的STRs位点，STRs位点的PCR产物被直接当作目标DNA扩增子直接用于数据分析[6-18]。然而，它们主要存在一方面技术缺陷：PCR引物来源于蜜蜂个别基因的表达序列标签和蜜蜂基因组细菌人工染色体载体而不是来源于蜜蜂遗传图谱的16个连锁群(染色体DNA)；由此，实验结果在一定程度上大大地损失了STRs固有的遗传背景信息，从而限制了蜜蜂STRs标记技术的进一步应用。
参考文献：
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发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高STRs标记技术鉴定保种蜜蜂的可靠性和实用性。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了获取蜜蜂DNA指纹图谱的引物对组合物。所述组合物由下述89种引物对中的n种引物对组成。n可为89至1中的任一自然数：
A1)由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的编号为1的引物对；
A2)由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成的编号为2的引物对；
A3)由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA组成的编号为3的引物对；
A4)由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA组成的编号为4的引物对；
A5)由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA组成的编号为5的引物对；
A6)由SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的两条单链DNA组成的编号为6的引物对；
A7)由SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的两条单链DNA组成的编号为7的引物对；
A8)由SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示的两条单链DNA组成的编号为8的引物对；
A9)由SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的两条单链DNA组成的编号为9的引物对；
A10)由SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示的两条单链DNA组成的编号为10的引物对；
A11)由SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示的两条单链DNA组成的编号为11的引物对；
A12)由SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示的两条单链DNA组成的编号为12的引物对；
A13)由SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示的两条单链DNA组成的编号为13的引物对；
A14)由SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所示的两条单链DNA组成的编号为14的引物对；
A15)由SEQ ID No.29和SEQ ID No.30所示的两条单链DNA组成的编号为15的引物对；
A16)由SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示的两条单链DNA组成的编号为16的引物对；
A17)由SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示的两条单链DNA组成的编号为17的引物对；
A18)由SEQ ID No.35和SEQ ID No.36所示的两条单链DNA组成的编号为18的引物对；
A19)由SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示的两条单链DNA组成的编号为19的引物对；
A20)由SEQ ID No.39和SEQ ID No.40所示的两条单链DNA组成的编号为20的引物对；
A21)由SEQ ID No.41和SEQ ID No.42所示的两条单链DNA组成的编号为21的引物对；
A22)由SEQ ID No.43和SEQ ID No.44所示的两条单链DNA组成的编号为22的引物对；
A23)由SEQ ID No.45和SEQ ID No.46所示的两条单链DNA组成的编号为23的引物对；
A24)由SEQ ID No.47和SEQ ID No.48所示的两条单链DNA组成的编号为24的引物对；
A25)由SEQ ID No.49和SEQ ID No.50所示的两条单链DNA组成的编号为25的引物对；
A26)由SEQ ID No.51和SEQ ID No.52所示的两条单链DNA组成的编号为26的引物对；
A27)由SEQ ID No.53和SEQ ID No.54所示的两条单链DNA组成的编号为27的引物对；
A28)由SEQ ID No.55和SEQ ID No.56所示的两条单链DNA组成的编号为28的引物对；
A29)由SEQ ID No.57和SEQ ID No.58所示的两条单链DNA组成的编号为29的引物对；
A30)由SEQ ID No.59和SEQ ID No.60所示的两条单链DNA组成的编号为30的引物对；
A31)由SEQ ID No.61和SEQ ID No.62所示的两条单链DNA组成的编号为31的引物对；
A32)由SEQ ID No.63和SEQ ID No.64所示的两条单链DNA组成的编号为32的引物对；
A33)由SEQ ID No.65和SEQ ID No.66所示的两条单链DNA组成的编号为33的引物对；
A34)由SEQ ID No.67和SEQ ID No.68所示的两条单链DNA组成的编号为34的引物对；
A35)由SEQ ID No.69和SEQ ID No.70所示的两条单链DNA组成的编号为35的引物对；
A36)由SEQ ID No.71和SEQ ID No.72所示的两条单链DNA组成的编号为36的引物对；
A37)由SEQ ID No.73和SEQ ID No.74所示的两条单链DNA组成的编号为37的引物对；
A38)由SEQ ID No.75和SEQ ID No.76所示的两条单链DNA组成的编号为38的引物对；
A39)由SEQ ID No.77和SEQ ID No.78所示的两条单链DNA组成的编号为39的引物对；
A40)由SEQ ID No.79和SEQ ID No.80所示的两条单链DNA组成的编号为40的引物对；
A41)由SEQ ID No.81和SEQ ID No.82所示的两条单链DNA组成的编号为41的引物对；
A42)由SEQ ID No.83和SEQ ID No.84所示的两条单链DNA组成的编号为42的引物对；
A43)由SEQ ID No.85和SEQ ID No.86所示的两条单链DNA组成的编号为43的引物对；
A44)由SEQ ID No.87和SEQ ID No.88所示的两条单链DNA组成的编号为44的引物对；
A45)由SEQ ID No.89和SEQ ID No.90所示的两条单链DNA组成的编号为45的引物对；
A46)由SEQ ID No.91和SEQ ID No.92所示的两条单链DNA组成的编号为46的引物对；
A47)由SEQ ID No.93和SEQ ID No.94所示的两条单链DNA组成的编号为47的引物对；
A48)由SEQ ID No.95和SEQ ID No.96所示的两条单链DNA组成的编号为48的引物对；
A49)由SEQ ID No.97和SEQ ID No.98所示的两条单链DNA组成的编号为49的引物对；
A50)由SEQ ID No.99和SEQ ID No.100所示的两条单链DNA组成的编号为50的引物对；
A51)由SEQ ID No.101和SEQ ID No.102所示的两条单链DNA组成的编号为51的引物对；
A52)由SEQ ID No.103和SEQ ID No.104所示的两条单链DNA组成的编号为52的引物对；
A53)由SEQ ID No.105和SEQ ID No.106所示的两条单链DNA组成的编号为53的引物对；
A54)由SEQ ID No.107和SEQ ID No.108所示的两条单链DNA组成的编号为54的引物对；
A55)由SEQ ID No.109和SEQ ID No.110所示的两条单链DNA组成的编号为55的引物对；
A56)由SEQ ID No.111和SEQ ID No.112所示的两条单链DNA组成的编号为56的引物对；
A57)由SEQ ID No.113和SEQ ID No.114所示的两条单链DNA组成的编号为57的引物对；
A58)由SEQ ID No.115和SEQ ID No.116所示的两条单链DNA组成的编号为58的引物对；
A59)由SEQ ID No.117和SEQ ID No.118所示的两条单链DNA组成的编号为59的引物对；
A60)由SEQ ID No.119和SEQ ID No.120所示的两条单链DNA组成的编号为60的引物对；
A61)由SEQ ID No.121和SEQ ID No.122所示的两条单链DNA组成的编号为61的引物对；
A62)由SEQ ID No.123和SEQ ID No.124所示的两条单链DNA组成的编号为62的引物对；
A63)由SEQ ID No.125和SEQ ID No.126所示的两条单链DNA组成的编号为63的引物对；
A64)由SEQ ID No.127和SEQ ID No.128所示的两条单链DNA组成的编号为64的引物对；
A65)由SEQ ID No.129和SEQ ID No.130所示的两条单链DNA组成的编号为65的引物对；
A66)由SEQ ID No.131和SEQ ID No.132所示的两条单链DNA组成的编号为66的引物对；
A67)由SEQ ID No.133和SEQ ID No.134所示的两条单链DNA组成的编号为67的引物对；
A68)由SEQ ID No.135和SEQ ID No.136所示的两条单链DNA组成的编号为68的引物对；
A69)由SEQ ID No.137和SEQ ID No.138所示的两条单链DNA组成的编号为69的引物对；
A70)由SEQ ID No.139和SEQ ID No.140所示的两条单链DNA组成的编号为70的引物对；
A71)由SEQ ID No.141和SEQ ID No.142所示的两条单链DNA组成的编号为71的引物对；
A72)由SEQ ID No.143和SEQ ID No.144所示的两条单链DNA组成的编号为72的引物对；
A73)由SEQ ID No.145和SEQ ID No.146所示的两条单链DNA组成的编号为73的引物对；
A74)由SEQ ID No.147和SEQ ID No.148所示的两条单链DNA组成的编号为74的引物对；
A75)由SEQ ID No.149和SEQ ID No.150所示的两条单链DNA组成的编号为75的引物对；
A76)由SEQ ID No.151和SEQ ID No.152所示的两条单链DNA组成的编号为76的引物对；
A77)由SEQ ID No.153和SEQ ID No.154所示的两条单链DNA组成的编号为77的引物对；
A78)由SEQ ID No.155和SEQ ID No.156所示的两条单链DNA组成的编号为78的引物对；
A79)由SEQ ID No.157和SEQ ID No.158所示的两条单链DNA组成的编号为79的引物对；
A80)由SEQ ID No.159和SEQ ID No.160所示的两条单链DNA组成的编号为80的引物对；
A81)由SEQ ID No.161和SEQ ID No.162所示的两条单链DNA组成的编号为81的引物对；
A82)由SEQ ID No.163和SEQ ID No.164所示的两条单链DNA组成的编号为82的引物对；
A83)由SEQ ID No.165和SEQ ID No.166所示的两条单链DNA组成的编号为83的引物对；
A84)由SEQ ID No.167和SEQ ID No.168所示的两条单链DNA组成的编号为84的引物对；
A85)由SEQ ID No.169和SEQ ID No.170所示的两条单链DNA组成的编号为85的引物对；
A86)由SEQ ID No.171和SEQ ID No.172所示的两条单链DNA组成的编号为86的引物对；
A87)由SEQ ID No.173和SEQ ID No.174所示的两条单链DNA组成的编号为87的引物对；
A88)由SEQ ID No.175和SEQ ID No.176所示的两条单链DNA组成的编号为88的引物对；
A89)由SEQ ID No.177和SEQ ID No.178所示的两条单链DNA组成的编号为89的引物对。
上文所述89种引物对的摩尔比可相同。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了获取蜜蜂DNA指纹图谱的试剂或试剂盒。所述试剂或试剂盒可含有上文所述的获取蜜蜂DNA指纹图谱的引物对组合物。
制备上文所述的获取蜜蜂DNA指纹图谱的引物对组合物的方法也属于本发明的保护范围。所述方法可包括将上文中任一所述引物对的两条单链DNA分别单独包装的步骤。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种获取蜜蜂DNA指纹图谱的方法。所述方法包括：
1)以蜜蜂的基因组DNA为模板，用上文所述的引物对组合物中的每一引物对分别进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
2)将1)中得到的所述PCR扩增产物进行检测，得到所述蜜蜂的DNA指纹图谱。
上文所述的检测可为毛细管电泳检测。
上文所述方法中，用上文所述的引物对组合物中的每一引物对分别进行PCR扩增，制定的热循环周期数可为35次，制定的每一次热循环周期的各时相可为94℃变性30s、55℃退火30s和72℃延伸30s。
上文所述方法中，用上文所述的引物对组合物中的每一引物对分别进行PCR扩增，PCR体系中除了引物对不同外，其它组分及其配比可完全相同。
利用上文中任一所述的方法得到的蜜蜂DNA指纹图谱也属于本发明的保护范围。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了下述P1-P9的中的任一种应用：
P1、上文所述的引物对组合物在获取蜜蜂DNA指纹图谱中的应用；
P2、上文所述的引物对组合物在鉴定保种蜜蜂中的应用；
P3、上文所述的引物对组合物在动态监测和/或追踪种畜的保存效果中的应用；
P4、上文所述的引物对组合物在鉴定蜜蜂品种的遗传多样性和亲缘关系中的应用；
P5、上文所述的引物对组合物在蜜蜂育种中的应用；
P6、上文所述的试剂或试剂盒在鉴定保种蜜蜂中的应用；
P7、上文所述的试剂或试剂盒在动态监测和/或追踪种畜的保存效果中的应用；
P8、上文所述的试剂或试剂盒在鉴定蜜蜂品种的遗传多样性和亲缘关系中的应用；
P9、上文所述的试剂或试剂盒在蜜蜂育种中的应用。
上文所述蜜蜂可为欧洲黑蜂。
本发明从蜜蜂最新遗传图谱(AmeMap3)16个连锁群的2008个STRs位点中找到其侧翼DNA序列[19]，通过大规模的引物人工设计、标准化的PCR体系构建、统一的PCR条件设置以及高分辨的微流体胶介质分离获得8次生物学重复的PCR产物毛细管电泳谱图和色谱图，最后通过解析PCR产物谱式确立可利用STRs位点的5项技术参数，筛选出89对诊断性STRs位点的PCR引物，最大程度地提供蜜蜂STRs位点固有的遗传背景信息。此89对诊断性STRs位点的PCR引物可用于获得蜜蜂的DNA指纹图谱等遗传信息，鉴定保种蜜蜂的纯度，监测物种保护效果的稳定性和连续性，大大提高了STRs标记技术鉴定保种蜜蜂的可靠性和实用性。
附图说明
图1为蜜蜂遗传图谱连锁群III(III染色体DNA)第30位次STRs位点的PCR引物人工设计DNA序列质谱图，纵坐标为峰强度，横坐标为荷质比。A为正向PCR引物；B为反向PCR引物。
图2为单个蜜蜂样本的1个STRs位点(第30位次STRs位点)PCR产物毛细管电泳谱图(A)和色谱图(B～D)。最大、最小分子量内标(从上至下)是呈现强荧光着色密度的最上、最下2个条带(A)，最小、最大分子量内标(从左至右)是呈现高丰度的最左、最右端2个峰(B～D)，它们规定STRs位点的PCR产物谱式的测定范围。色谱图中数字分别代表被分离DNA的绝对质量(浓度)测定值(B)、相对质量百分比(纯度)测定值(C)和序列长度测定值(D)
图3为8次生物学重复(即，8个不同欧洲黑蜂(Apis mellifera mellifera L.)个体样本)的1个STRs位点(第30位次STRs位点)的PCR产物毛细管电泳谱图(A)和重叠色谱图(B～D)。呈现强荧光着色密度的谱图中间位置8个同形、异形条带是不完全等长序列的PCR扩增子(A)，呈现高丰度的谱图中间位置8个叠加峰是不完全等长序列的PCR扩增子(B～D)。
图4-图92为8次生物学重复(即，8个不同欧洲黑蜂个体样本)的编号1-89共89个STRs位点的PCR产物毛细管电泳谱图。点样孔从左到右的8个样本分别为A9、B9、C9、D9、E9、F9、G9和H9。
图93为蜜蜂遗传图谱I～XVI连锁群89个STRs位点中的第1-第31个STRs位点的PCR产物计量(Quantitative)、计数(Qualitative)指标测定值统计结果。横标目从左至右依次为STRs位点排列序号(No.)、PCR引物对(Primer pairs)、8次生物学重复的STRs位点PCR产物组成型谱式及其PCR扩增子多态性谱式(Pattern)以及STRs位点所属的遗传图谱I～XVI连锁群(Linkage group)。其中，计量指标包括PCR产物总组分质量(Conc.)、PCR扩增子绝对质量(Conc.)和扩增子相对质量(Purity)，计数指标包括PCR产物的总色谱峰数量(TotalP.)、PCR扩增子滑脱产物的色谱峰数量(Stutter P.)、PCR扩增子的序列长度测定值峰(Size P)和序列长度测定值类型数量(Polymorphism)。
图94为蜜蜂遗传图谱I～XVI连锁群89个STRs位点中的第32-第62个STRs位点的PCR产物计量、计数指标测定值统计结果。
图95为蜜蜂遗传图谱I～XVI连锁群89个STRs位点中的第63-第89个STRs位点的PCR产物计量、计数指标测定值统计结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，可按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
微量组织粉碎仪(型号：TissueLyser II)，高速冷冻离型机(型号：TOMY MAX-30)，水浴锅(型号：DK-8D)，纯水仪(型号：EASY pure II)，2D混匀仪(型号：MixMate)，荧光定量仪(型号：Qubit3.0)，真空离心浓缩仪(型号：ConcentratorPlus)，核酸纯化仪(型号：QIAcube)，移液工作站(型号：epMotion 5070)，PCR热循环仪(型号：Veriti 96well)，毛细管电泳系统(型号：LCGXII)，隔膜泵(型号：DTC-41)，生物安全柜(型号：BSC-1500A2),真空干燥箱(VOS-90A)，恒温热水槽(型号：DK-8D)，冰箱(型号：BCD-201ML)。
医用剪刀(规格：10cm)，单道移液器(规格：1～2.5μL、1～10μL、1～50μL、1～100μL、1～200μL、1～1mL和1～5mL)，多道移液器(规格：5～50μL)，一次性离心管(规格：1.5mL和2mL),一次性PCR板(规格：96×0.25mL)，PCR板封口膜(规格：PCT-TS)，移液尖(规格：10μL、200μL、1mL和5mL)，生物大分子分离芯片(规格：HT DNA Extended Range LabChip)，自动分液移液尖(规格：96×50μL)，宽口径纯化核酸移液尖(规格：1000μL WIDE BORE)，细口径纯化核酸移液尖(规格：1000μL)，抽滤瓶(规格：2000mL)。
蛋白酶K(规格：50mg)，dNTP Mix预混液(规格：10mM)，高保真DNA聚合酶(规格：5U/μL)，DNA提取试剂盒(规格：DNeasy Blood&Tissue Kit)，微流体介质电泳试剂盒(规格：HTDNA 1K Reagent Kit)，微流体胶电泳芯片(规格：HT DNA Extended Range LabChip)，DNA定量试剂盒(规格：Qubit HS Assay Kit 5000assays)，三羟甲基氨基甲烷盐酸(规格：分析纯)、乙二胺四乙酸二钠(规格：分析纯)、十二烷基硫酸钠(规格：分析纯)，浓盐酸(规格：分析纯)，氢氧化钠(规格：分析纯),异丙醇(规格：分析纯)。
下述实施例中的8个样本为8只欧洲黑蜂(来源于吉林国家蜜蜂种质资源库)。
实施例1、保种蜜蜂诊断性STRs位点的PCR引物的获得
1.PCR引物合成
从蜜蜂遗传图谱(AmeMap3)16个连锁群的2008个STRs位点中找到其侧翼DNA序列(参考文献19)，于2016年委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成2008对STRs位点的PCR引物上下游序列。
以1个STRs位点的PCR引物为例，说明PCR引物的质量。蜜蜂遗传图谱连锁群III(III染色体DNA)第30位次STRs位点的PCR引物核酸质谱图显示，公司合成的DNA序列在分子质量测定范围内呈现唯一的1个峰(图1)。表明PCR引物序列的人工合成制品纯度为质谱级，PCR引物质量合格。
2.蜜蜂DNA提取
2.1.DNA提取
使用蜜蜂(Apis mellifera)品种欧洲黑蜂(来源于吉林的国家蜜蜂种质资源库)用于DNA提取。具体步骤为，弃掉蜜蜂(♂)腹部组织，剪碎剩余组织，加1mL组织裂解液(包括1M三羟甲基氨基甲烷盐酸，0.5M乙二胺四乙酸二钠，0.5M氯化钠，1％十二烷基硫酸钠)，混匀20min，加20μL蛋白酶K(10mg/mL)，过夜消化(6～8h)，离心(13000×g)10min，收集上清液，加600μL异丙醇，混匀2min，－20℃静置1h，离心(13000×g)10min，弃上清液而留沉淀，按照DNA提取试剂盒(美国QIAGEN公司DNeasy Blood&Tissue Kit)的操作步骤，在每个样品管中加ATL溶液等试剂，在相应的仪器中加入AW1溶液等试剂和亲和层析离心小柱等耗材，选择(试剂盒对应的)应用程序，提取和纯化DNA，收集DNA提取物200μL。
2.2.调整DNA工作液密度
按照DNA荧光定量试剂盒(美国INVITROGEN公司Qubit HS Assay Kit5000assays)的操作步骤，在避光环境下定量DNA提取物的密度，调整DNA工作液密度至45～55ng/μL范围，分装后－20℃保存。
3.PCR扩增
3.1.确定兼容性PCR体系
选择固定的PCR体系(20μL)：正、反向PCR引物终末浓度(200nmol/L)，dNTP Mix预混液终末浓度(0.25mmol/L)，MgCl2终末浓度(2.5mmol/L)，Buffer终末稀释度(1×)，DNA聚合酶活力(0.8U)，模板DNA质量数(45～55ng)。
3.2.组配PCR反应物
按照PCR板一次性全承载96个PCR体系的“8个DNA样本×12对PCR引物”通量布局设计，将每一个PCR体系各反应物组份组配为3组不同的预混液Mix-I、MixII和Mix-III：
Mix-I(8μL)包括2.5mmoL/L的dNTP Mix预混液2μL、25mmoL/L的MgCl2溶液2μL和5×Buffer溶液4μL。
Mix-II(8μL)包括水6.84μL、5U/μL的DNA聚合酶0.16μL和模板DNA溶液1μL。
Mix-III(4μL)包括2μmoL/L的正、反向PCR引物溶液各2μL。
3.3.批量构建PCR体系
使用自动分液仪(德国Eppendorf公司epMotion5070)在PCR板内一次性批量构建96个PCR体系。其中，每一个PCR反应井中加Mix-I预混液8μL，每一行PCR反应井中加Mix-II预混液8μL，每一列PCR反应井中加Mix-III预混液4μL。
3.4.确定兼容性PCR条件并进行PCR扩增
选择通用的PCR条件：94℃预变性3min、35次热循环周期(每一次热循环周期的各时相为94℃变性30s、55℃退火30s和72℃延伸30s)。
3.5.稀释PCR产物
在PCR产物中加80μL纯水。
3.6.毛细管电泳分离PCR产物
按照微流体介质电泳试剂盒(美国PE公司HT DNA 1K Reagent Kit)和微流体胶电泳芯片(美国PE公司HT DNA Extended Range LabChip)的操作步骤，在芯片3#等4个盛液井中加微流体胶70μL以及在芯片4#盛液井中加内标液100μL，在毛细管电泳系统(美国Caliper life sciences公司LCGXII)样品槽放入PCR产物稀释液、10％DNA marker溶液100μL和纯水750μL，进行毛细管电泳。在毛细管电泳分离每一个STRs位点的PCR产物过程中，STRs位点在同一批次实验中实施8次生物学重复。
4.可利用STRs位点分析
4.1.确定可利用STRs位点
每一个PCR产物经过分离后显示为数字化的DNA荧光着色条带和DNA丰度色谱峰，以及PCR扩增子的大小和丰度在内标范围内的定性、定量数据。依据人、果蝇等代表性模式生物诊断性STRs位点的PCR扩增子的丰度和大小，解析8个样本在2008个STRs位点的PCR产物组成型谱式和多态性谱式，形成获取可利用STRs位点的筛选参数。据此，去除不同时符合上述条件的低质量STRs位点PCR产物，视为不可利用STRs位点；保留同时符合上述条件的高质量STRs位点PCR产物，视为可利用STRs位点。筛选条件如下：
第一，扩增子绝对质量测定值大于等于(≥)0.7ng/μL。
第二，扩增子相对质量百分比(纯度)大于等于(≥)50％。
第三，扩增子峰面积与任一扩增子滑脱产物峰面积之比大于等于(≥)10。
第四，扩增子滑脱产物峰数量小于等于(≤)2。
第五，扩增子长度测定值大于等于(≥)100(bp)同时小于等于(≤)500(bp)。
经过筛选，共得到89个可利用STRs位点(图93-图95)，和其对应的89对PCR引物(图93-图95和序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.178)。89个STRs位点在蜜蜂遗传图谱16个连锁群I～XVI不同位次的信息，及其对应引物的PCR产物的毛细管电泳测定数据和PCR扩增子色谱测定数据如图93-图95所示。在89对PCR引物中，每对PCR引物单独进行PCR，每对PCR引物的PCR体系除引物对不同外具有相同的反应物组分，具体见3.1.的PCR体系。
4.1.1.STRs位点的PCR产物组成型谱式分析
以1个蜜蜂样本的1个STRs位点的PCR产物为例，说明STRs位点的PCR产物组成型谱式。首先，蜜蜂遗传图谱连锁群III(III染色体DNA)第30位次STRs位点的PCR产物毛细管电泳谱图显示(图2中A所示)，在DNA marker(特别是100～500bp)长度范围内，呈现强荧光着色密度的谱图中间位置1个条带是STRs位点的PCR扩增子，而呈现弱荧光着色密度的谱图中间位置所在范围1个或多个条带是STRs位点的1个或多个PCR扩增子滑脱产物；在DNAmarker(25bp)最小长度位置以外，呈现弱荧光着色密度的1个或2个条带是PCR引物对的自身非特异性扩增产物。其次，该STRs位点的PCR产物色谱图显示(图2中B～D所示)，呈现高丰度的谱图中间位置1个峰是STRs位点的PCR扩增子，呈现低丰度的谱图中间位置所在范围1个或多个峰是STRs位点的1个或多个PCR扩增子滑脱产物；呈现低丰度的最左端位置1个或2个条带是PCR引物对的自身非特异性PCR扩增产物。此蜜蜂样本的其他88个STRs位点的PCR产物毛细管电泳谱图和色谱图均显示同类型的PCR产物组成型谱式(图4～图92)。
4.1.2.STRs位点的PCR扩增子长度多态性谱式分析
以8次生物学重复(同一个亚种的8个不同个体样本)的1个STRs位点的8个PCR产物为例，说明STRs位点的PCR扩增子长度多态性谱式。
首先，蜜蜂遗传图谱连锁群III(III染色体DNA)第30位次STRs位点的8个PCR产物毛细管电泳谱图显示(图2中A所示)，在DNA marker(100～200bp)长度范围内，呈现强荧光着色密度的谱图中间位置8个同形、异形条带是不完全相同序列长度的PCR扩增子。其次，该STRs位点的8个PCR产物重叠色谱图显示(图3中B～D所示)，呈现高丰度的谱图中间位置8个叠加峰是不完全相同序列长度的PCR扩增子。同理，8次生物学重复的其他88个STRs位点的8个PCR产物毛细管电泳谱图(图4～图95)和8个重叠色谱图(受页面篇幅限制未列出)均显示同类型的PCR扩增子长度多态性谱式。
4.2判别诊断性STRs等位基因
STRs位点的核心序列组成和重复频率决定了其PCR扩增子长度多态性谱式，依据蜜蜂最新遗传图谱STRs位点的核心序列信息计数扩增子长度类型，注释可利用STRs位点的等位基因数量(图93-图95)。
上述结果表明，该89对PCR引物在蜜蜂亚种欧洲黑蜂STRs位点进行DNA体外复制时进行高特异性扩增，扩增的每一个STRs位点在不同个体之间存在多态性，绘制的蜜蜂DNA指纹图谱可以用来鉴定保种蜜蜂的纯度，监测保种效果的稳定性，从而大大提高了STRs标记技术鉴定保种蜜蜂的可靠性和实用性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 吉林省养蜂科学研究所（吉林省蜂产品质量管理监督站、吉林省蜜蜂遗传资源基因保护中心）
<120> 从蜜蜂遗传图谱获取的保种蜜蜂诊断性STRs位点的PCR引物及其应用
<130> GNCSQ210201
<160> 178
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
gatcattcgt attctcggga gaa 23
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
cccataccgt gcagcgtc 18
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
ggagtaataa tctcgcacga gag 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
atgcagattc atatatgcgt tca 23
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
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<400> 7
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<212> DNA
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<211> 21
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<400> 13
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<212> DNA
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<211> 18
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<400> 16
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cagtatcgac gtagtcagta agc 23
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<212> DNA
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<400> 19
gcaagccgaa gcgaatgt 18
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 20
tttctcgact cattcgcatc tc 22
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 21
tcaactcgcc tccggctc 18
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 22
aagcatcgat cgctcgttac c 21
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<212> DNA
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<400> 23
cgataccttc cactcaactg tcaatc 26
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<212> DNA
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<400> 26
tgctcgctaa attgcgagtg 20
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gtatgcggtc aaacgaaggc 20
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<211> 20
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<400> 28
cctcgttctc ctcgcacttg 20
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<211> 22
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<211> 22
<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 31
gactcgcgtg cgntaaacg 19
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
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<400> 32
ttatctgccc gactccacg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 33
catccccgaa gcggatat 18
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<212> DNA
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<400> 37
gttccgcgag aatggcat 18
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<211> 19
<212> DNA
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<400> 38
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<212> DNA
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<400> 44
tccggcgtcg tccacttg 18
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<212> DNA
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<400> 45
catgtaaatt gccgaccgtg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 46
tcgatcggac gaataacaag c 21
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<400> 48
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<400> 49
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 52
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<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 53
tccggaaata tatccgtcgc 20
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 54
ggtaatggct gcattcgca 19
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 55
accgaaacga gcacattcc 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 56
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<211> 18
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<211> 20
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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agtgaaaata cgacaaagca tcg 23
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<211> 18
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<211> 19
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<211> 21
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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cgctcgcggt ggatttcatt t 21
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<211> 21
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<210> 78
<211> 19
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 78
ttgtcacaat tccgcttga 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 79
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<211> 20
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<211> 21
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 82
gaggagcaat ccttttctct 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 102
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 107
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 109
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 110
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<210> 118
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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ttgaagtaat taagaagaaa aggaaatga 29
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 119
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 120
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 122
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 123
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 124
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 125
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<211> 19
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 126
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 128
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 129
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<211> 18
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 130
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 131
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 132
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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tgtagatgac ttaatgagaa acac 24
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 134
atgtaatttt gaagaatgat gaacttg 27
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 135
ttcgtcggta agaataaccg at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 136
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 141
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 142
tgcttctcca ccgaatgtct 20
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 143
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 145
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 146
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<211> 18
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 147
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<211> 18
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 148
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<210> 149
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 149
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 150
gcacgtttca acatttccgt 20
<210> 151
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 151
aacggagaat gacgaggc 18
<210> 152
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 152
agagaagaat tgtacaaggt tcg 23
<210> 153
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 153
cgcatggtat cccttcgg 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 154
gcattgtacg cagccgtg 18
<210> 155
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 155
tctcttgccg acaccaccg 19
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 156
cagtccctaa gcgaatcgtt acg 23
<210> 157
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 157
ccttcttcga caccgtatca tc 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 158
cgccaattag attcgtagga atc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 159
ttcgacaacg agcaatgtcc 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 160
caagcgattg gtttcacgg 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 161
cgaaggcaga gtatcgtagg g 21
<210> 162
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 162
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 164
ttgcgagatg acaggttgt 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 165
cgtgtcgcga gtacacgg 18
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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cgtatcgtaa cgtgtcactt tcc 23
<210> 167
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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ttgcccattt acgaatagtg c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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caaactacaa atatgcattg tgatct 26
<210> 169
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 169
cgttactcac tagtcgcg 18
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<211> 19
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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acgtgtgtat acgtgcaag 19
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<211> 20
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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cgaagggtta tggcgttatg 20
<210> 172
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 172
ctcctcgagc gcgctata 18
<210> 173
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 173
aagaggaaac tccttcatcc g 21
<210> 174
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 174
gtcgccatcg acggagtc 18
<210> 175
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 175
tcggaattct gaagatgatt ttg 23
<210> 176
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 176
ttaaacaaag ttacgcgcga a 21
<210> 177
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 177
tccgtatcag aacgtcgtat cg 22
<210> 178
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 178
ggcgttacga cgataagggt a 21

Claims (9)

1.获取蜜蜂DNA指纹图谱的引物对组合物，由下述89种引物对组成：
A1）由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的编号为1的引物对；
A2）由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成的编号为2的引物对；
A3）由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA组成的编号为3的引物对；
A4）由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA组成的编号为4的引物对；
A5）由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA组成的编号为5的引物对；
A6）由SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的两条单链DNA组成的编号为6的引物对；
A7）由SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的两条单链DNA组成的编号为7的引物对；
A8）由SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示的两条单链DNA组成的编号为8的引物对；
A9）由SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的两条单链DNA组成的编号为9的引物对；
A10）由SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示的两条单链DNA组成的编号为10的引物对；
A11）由SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示的两条单链DNA组成的编号为11的引物对；
A12）由SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示的两条单链DNA组成的编号为12的引物对；
A13）由SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示的两条单链DNA组成的编号为13的引物对；
A14）由SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所示的两条单链DNA组成的编号为14的引物对；
A15）由SEQ ID No.29和SEQ ID No.30所示的两条单链DNA组成的编号为15的引物对；
A16）由SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示的两条单链DNA组成的编号为16的引物对；
A17）由SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示的两条单链DNA组成的编号为17的引物对；
A18）由SEQ ID No.35和SEQ ID No.36所示的两条单链DNA组成的编号为18的引物对；
A19）由SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示的两条单链DNA组成的编号为19的引物对；
A20）由SEQ ID No.39和SEQ ID No.40所示的两条单链DNA组成的编号为20的引物对；
A21）由SEQ ID No.41和SEQ ID No.42所示的两条单链DNA组成的编号为21的引物对；
A22）由SEQ ID No.43和SEQ ID No.44所示的两条单链DNA组成的编号为22的引物对；
A23）由SEQ ID No.45和SEQ ID No.46所示的两条单链DNA组成的编号为23的引物对；
A24）由SEQ ID No.47和SEQ ID No.48所示的两条单链DNA组成的编号为24的引物对；
A25）由SEQ ID No.49和SEQ ID No.50所示的两条单链DNA组成的编号为25的引物对；
A26）由SEQ ID No.51和SEQ ID No.52所示的两条单链DNA组成的编号为26的引物对；
A27）由SEQ ID No.53和SEQ ID No.54所示的两条单链DNA组成的编号为27的引物对；
A28）由SEQ ID No.55和SEQ ID No.56所示的两条单链DNA组成的编号为28的引物对；
A29）由SEQ ID No.57和SEQ ID No.58所示的两条单链DNA组成的编号为29的引物对；
A30）由SEQ ID No.59和SEQ ID No.60所示的两条单链DNA组成的编号为30的引物对；
A31）由SEQ ID No.61和SEQ ID No.62所示的两条单链DNA组成的编号为31的引物对；
A32）由SEQ ID No.63和SEQ ID No.64所示的两条单链DNA组成的编号为32的引物对；
A33）由SEQ ID No.65和SEQ ID No.66所示的两条单链DNA组成的编号为33的引物对；
A34）由SEQ ID No.67和SEQ ID No.68所示的两条单链DNA组成的编号为34的引物对；
A35）由SEQ ID No.69和SEQ ID No.70所示的两条单链DNA组成的编号为35的引物对；
A36）由SEQ ID No.71和SEQ ID No.72所示的两条单链DNA组成的编号为36的引物对；
A37）由SEQ ID No.73和SEQ ID No.74所示的两条单链DNA组成的编号为37的引物对；
A38）由SEQ ID No.75和SEQ ID No.76所示的两条单链DNA组成的编号为38的引物对；
A39）由SEQ ID No.77和SEQ ID No.78所示的两条单链DNA组成的编号为39的引物对；
A40）由SEQ ID No.79和SEQ ID No.80所示的两条单链DNA组成的编号为40的引物对；
A41）由SEQ ID No.81和SEQ ID No.82所示的两条单链DNA组成的编号为41的引物对；
A42）由SEQ ID No.83和SEQ ID No.84所示的两条单链DNA组成的编号为42的引物对；
A43）由SEQ ID No.85和SEQ ID No.86所示的两条单链DNA组成的编号为43的引物对；
A44）由SEQ ID No.87和SEQ ID No.88所示的两条单链DNA组成的编号为44的引物对；
A45）由SEQ ID No.89和SEQ ID No.90所示的两条单链DNA组成的编号为45的引物对；
A46）由SEQ ID No.91和SEQ ID No.92所示的两条单链DNA组成的编号为46的引物对；
A47）由SEQ ID No.93和SEQ ID No.94所示的两条单链DNA组成的编号为47的引物对；
A48）由SEQ ID No.95和SEQ ID No.96所示的两条单链DNA组成的编号为48的引物对；
A49）由SEQ ID No.97和SEQ ID No.98所示的两条单链DNA组成的编号为49的引物对；
A50）由SEQ ID No.99和SEQ ID No.100所示的两条单链DNA组成的编号为50的引物对；
A51）由SEQ ID No.101和SEQ ID No.102所示的两条单链DNA组成的编号为51的引物对；
A52）由SEQ ID No.103和SEQ ID No.104所示的两条单链DNA组成的编号为52的引物对；
A53）由SEQ ID No.105和SEQ ID No.106所示的两条单链DNA组成的编号为53的引物对；
A54）由SEQ ID No.107和SEQ ID No.108所示的两条单链DNA组成的编号为54的引物对；
A55）由SEQ ID No.109和SEQ ID No.110所示的两条单链DNA组成的编号为55的引物对；
A56）由SEQ ID No.111和SEQ ID No.112所示的两条单链DNA组成的编号为56的引物对；
A57）由SEQ ID No.113和SEQ ID No.114所示的两条单链DNA组成的编号为57的引物对；
A58）由SEQ ID No.115和SEQ ID No.116所示的两条单链DNA组成的编号为58的引物对；
A59）由SEQ ID No.117和SEQ ID No.118所示的两条单链DNA组成的编号为59的引物对；
A60）由SEQ ID No.119和SEQ ID No.120所示的两条单链DNA组成的编号为60的引物对；
A61）由SEQ ID No.121和SEQ ID No.122所示的两条单链DNA组成的编号为61的引物对；
A62）由SEQ ID No.123和SEQ ID No.124所示的两条单链DNA组成的编号为62的引物对；
A63）由SEQ ID No.125和SEQ ID No.126所示的两条单链DNA组成的编号为63的引物对；
A64）由SEQ ID No.127和SEQ ID No.128所示的两条单链DNA组成的编号为64的引物对；
A65）由SEQ ID No.129和SEQ ID No.130所示的两条单链DNA组成的编号为65的引物对；
A66）由SEQ ID No.131和SEQ ID No.132所示的两条单链DNA组成的编号为66的引物对；
A67）由SEQ ID No.133和SEQ ID No.134所示的两条单链DNA组成的编号为67的引物对；
A68）由SEQ ID No.135和SEQ ID No.136所示的两条单链DNA组成的编号为68的引物对；
A69）由SEQ ID No.137和SEQ ID No.138所示的两条单链DNA组成的编号为69的引物对；
A70）由SEQ ID No.139和SEQ ID No.140所示的两条单链DNA组成的编号为70的引物对；
A71）由SEQ ID No.141和SEQ ID No.142所示的两条单链DNA组成的编号为71的引物对；
A72）由SEQ ID No.143和SEQ ID No.144所示的两条单链DNA组成的编号为72的引物对；
A73）由SEQ ID No.145和SEQ ID No.146所示的两条单链DNA组成的编号为73的引物对；
A74）由SEQ ID No.147和SEQ ID No.148所示的两条单链DNA组成的编号为74的引物对；
A75）由SEQ ID No.149和SEQ ID No.150所示的两条单链DNA组成的编号为75的引物对；
A76）由SEQ ID No.151和SEQ ID No.152所示的两条单链DNA组成的编号为76的引物对；
A77）由SEQ ID No.153和SEQ ID No.154所示的两条单链DNA组成的编号为77的引物对；
A78）由SEQ ID No.155和SEQ ID No.156所示的两条单链DNA组成的编号为78的引物对；
A79）由SEQ ID No.157和SEQ ID No.158所示的两条单链DNA组成的编号为79的引物对；
A80）由SEQ ID No.159和SEQ ID No.160所示的两条单链DNA组成的编号为80的引物对；
A81）由SEQ ID No.161和SEQ ID No.162所示的两条单链DNA组成的编号为81的引物对；
A82）由SEQ ID No.163和SEQ ID No.164所示的两条单链DNA组成的编号为82的引物对；
A83）由SEQ ID No.165和SEQ ID No.166所示的两条单链DNA组成的编号为83的引物对；
A84）由SEQ ID No.167和SEQ ID No.168所示的两条单链DNA组成的编号为84的引物对；
A85）由SEQ ID No.169和SEQ ID No.170所示的两条单链DNA组成的编号为85的引物对；
A86）由SEQ ID No.171和SEQ ID No.172所示的两条单链DNA组成的编号为86的引物对；
A87）由SEQ ID No.173和SEQ ID No.174所示的两条单链DNA组成的编号为87的引物对；
A88）由SEQ ID No.175和SEQ ID No.176所示的两条单链DNA组成的编号为88的引物对；
A89）由SEQ ID No.177和SEQ ID No.178所示的两条单链DNA组成的编号为89的引物对。
2.根据权利要求1所述的引物对组合物，其特征在于：所述89种引物对的摩尔比相同。
3.获取蜜蜂DNA指纹图谱的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒含有权利要求1所述的获取蜜蜂DNA指纹图谱的引物对组合物。
4.一种获取蜜蜂DNA指纹图谱的方法，包括：
1）以蜜蜂的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物对组合物中的每一引物对分别进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
2）将1）中得到的所述PCR扩增产物进行检测，得到所述蜜蜂的DNA指纹图谱。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述检测为毛细管电泳检测。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述方法中，用权利要求1所述的引物对组合物中的每一引物对分别进行PCR扩增，制定的热循环周期数为35次，制定的每一次热循环周期的各时相为94 ℃变性30s、55 ℃退火30s和72 ℃延伸30s。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述方法中，用权利要求1所述的引物对组合物中的每一引物对分别进行PCR扩增，PCR体系中除了引物对不同外，其它组分及其配比完全相同。
8.利用权利要求4-7中任一所述的方法得到的蜜蜂DNA指纹图谱。
9.下述P1-P7中的任一种应用：
P1、权利要求1中所述的引物对组合物在获取蜜蜂DNA指纹图谱中的应用；
P2、权利要求1中所述的引物对组合物在鉴定保种蜜蜂中的应用；
P3、权利要求1中所述的引物对组合物在动态监测和/或追踪保种蜜蜂的保存效果中的应用；
P4、权利要求1中所述的引物对组合物在鉴定蜜蜂品种的遗传多样性和亲缘关系中的应用；
P5、权利要求3所述的试剂或试剂盒在鉴定保种蜜蜂中的应用；
P6、权利要求3所述的试剂或试剂盒在动态监测和/或追踪保种蜜蜂的保存效果中的应用；
P7、权利要求3所述的试剂或试剂盒在鉴定蜜蜂品种的遗传多样性和亲缘关系中的应用。
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