CN112813152A - 一种基于图像识别的数字pcr液滴荧光检测方法 - Google Patents

一种基于图像识别的数字pcr液滴荧光检测方法 Download PDF

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明公开一种基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法，该方法首先将油与含有荧光染料的样本液注入芯片，以生成几万或几十万个液滴单层平铺于芯片内，然后将芯片通过升降温装置进行PCR扩增反应，随后对扩增后的芯片进行拍照，以图像处理的方法获取液滴的位置参数，并基于该位置参数计算每个液滴的荧光均值，对比流式检测方案，可保证液滴的平稳性，且可降低液滴遭受污染的风险，同时，还提高了检测速度。

Description

一种基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法
技术领域
本发明涉及微滴式数字PCR技术领域，尤其涉及一种基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法。
背景技术
PCR又称聚合酶链式反应，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、快速、简便、易自动化等许多优点，能将目的基因或某一DNA片段，数小时内扩增至百万乃至千万倍，在临床诊断、法医学调查、生物技术等领域有着广泛而重要的应用。
随着检测要求的不断提高，传统PCR系统难以精确的测定基因拷贝数，无法对基因突变定性和定量，而数字PCR即Digital PCR的问世很好地解决了这个问题。数字PCR通过将一个样本分为几千到几十万份，分配到不同的反应单元，每个单元最多包含一个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。数字PCR不依赖扩增曲线的循环阈值，不受扩增效率的影响，能够直接读出DNA分子的个数，是一种核酸分子绝对定量技术。
数字PCR仪现如今又分为微孔式和微滴式，其核心原理都是将含有核酸模板的标准PCR反应体系平均分配成几千至几十万个PCR反应单元，使每个反应单元中尽可能含有最多一个模板分子，再进行单分子模板PCR反应，通过读取荧光信号的有无进行计数，最后通过统计学泊松分布进行绝对定量，而在对液滴荧光进行检测计算时，其采用流式检测技术，其需要将液滴一个个推到激光点上照射从而激发出荧光值，检测存在难以控制、液滴稳定性差、且检测时间较长等不足之处。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法，该方法首先将油与含有荧光染料的样本液注入芯片，以生成几万或几十万个液滴单层平铺于芯片内，然后将芯片通过升降温装置进行PCR扩增反应，随后对扩增后的芯片进行拍照，以图像处理的方法获取液滴的位置参数，并基于该位置参数计算每个液滴的荧光均值，对比流式检测方案，可保证液滴的平稳性，且可降低液滴遭受污染的风险，同时，还提高了检测速度。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法，包括以下步骤：
S1：获取已生成液滴并完成PCR反应的芯片；
S2：获取芯片的明场或暗场照片，以及不同荧光通道的照片；
S3：对获取的明场或暗场照片，以及不同荧光通道的照片进行预处理；
S4：基于预处理后的明场或暗场照片，获取每个液滴的位置参数并在照片内标识每个液滴；
S5：基于S4获取的每个液滴的位置参数，将每个液滴的位置映射于各个荧光通道照片内的对应液滴上；
S6：基于每个液滴的位置参数，计算每个荧光通道照片内的相应液滴的荧光均值；
S7：基于每个液滴的荧光均值，筛选出阴性和阳性液滴。
进一步地，所述S1具体包括以下步骤：
S11：将油与含有荧光染料的样本液注入芯片，以生成几万或几十万个液滴单层平铺于芯片内；
S12：将芯片通过升降温装置进行PCR反应。
进一步地，所述S2具体包括以下步骤：
S21：通过LED灯照射芯片，并使用相机对芯片拍照，以获取芯片的明场或暗场照片；
S22：在不移动芯片的情况下，通过激光照射芯片，并使用相机对芯片拍照，以获取芯片的不同荧光通道的照片。
进一步地，所述S3具体包括以下步骤：
S31：对照片进行灰度化处理，以将照片转换成单通道的灰度图像；
S32：基于灰度化处理后的照片，采用高斯滤波算法对其进行滤波降噪处理；
S33：对照片进行直方图均衡化处理。
进一步地，所述S4具体包括以下步骤：
S41：通过模板匹配算法获取明场或暗场照片内的每个液滴的位置参数，其中位置参数包括液滴中心坐标、液滴半径；
S42：基于S41获取的每个液滴的位置参数，将照片内的每个液滴进行标识。
进一步地，所述S5包括以下步骤：
S51：基于S41获取的每个液滴的位置参数，找到在荧光通道照片内与之相对应的液滴的位置；
S52：在荧光通道照片内对每个液滴做标识。
进一步地，所述S6包括以下步骤：
S61：基于每个液滴的位置参数，计算荧光通道照片内的每个液滴的体积；
S62：依据以下公式，获取每个液滴内的所有像素点；
(m-x)2+(n-y)2≤r2，
其中，(m,n)为像素点坐标，(x,y)为液滴的中心坐标，r为液滴的半径；
S63：计算每个液滴在图像上的所有像素亮度值之和
Figure BDA0003005755850000031
其中，i＝0，Λn为液滴内所有像素的点数，k为液滴内某一像素点的亮度值；
S64：计算每个液滴的荧光均值
Figure BDA0003005755850000032
进一步地，所述S7包括以下步骤：
S71：依据每个液滴的荧光均值，画出液滴-荧光散点图；
S72：在液滴-荧光散点图上画出分类线，并以该分类线为界限筛选出阴性和阳性液滴。
采用上述方案，本发明的有益效果是：
该方法首先将油与含有荧光染料的样本液注入芯片，以生成几万或几十万个液滴单层平铺于芯片内，然后将芯片通过升降温装置进行PCR扩增反应，随后对扩增后的芯片进行拍照，以图像处理的方法获取液滴的位置参数，并基于该位置参数计算每个液滴的荧光均值，对比流式检测方案，可保证液滴的平稳性，且可降低液滴遭受污染的风险，同时，还提高了检测速度。
附图说明
图1为本发明的流程性框图；
图2为本发明其中一实施例中，芯片的明场照片图；
图3为本发明其中一实施例中，芯片的暗场照片图；
图4为本发明其中一实施例中，芯片的荧光照片图；
图5为本发明其中一实施例中，在芯片的明场照片上识别出液滴的示意图；
图6为本发明其中一实施例中，在芯片的暗场照片上识别出液滴的示意图；
图7为本发明其中一实施例中，将液滴映射到芯片荧光照片上的示意图；
图8为本发明其中一实施例中，液滴-荧光散点一维图；
图9为本发明其中一实施例中，液滴-荧光散点二维图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。
参照图1至9所示，本发明提供一种基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法，包括以下步骤：
S1：获取已生成液滴并完成PCR反应的芯片；
S2：获取芯片的明场或暗场照片，以及不同荧光通道的照片；
S3：对获取的明场或暗场照片，以及不同荧光通道的照片进行预处理；
S4：基于预处理后的明场或暗场照片，获取每个液滴的位置参数并在照片内标识每个液滴；
S5：基于S4获取的每个液滴的位置参数，将每个液滴的位置映射于各个荧光通道照片内的对应液滴上；
S6：基于每个液滴的位置参数，计算每个荧光通道照片内的相应液滴的荧光均值；
S7：基于每个液滴的荧光均值，筛选出阴性和阳性液滴。
其中，所述S1具体包括以下步骤：
S11：将油与含有荧光染料的样本液注入芯片，以生成几万或几十万个液滴单层平铺于芯片内；
S12：将芯片通过升降温装置进行PCR反应。
所述S2具体包括以下步骤：
S21：通过LED灯照射芯片，并使用相机对芯片拍照，以获取芯片的明场或暗场照片；
S22：在不移动芯片的情况下，通过激光照射芯片，并使用相机对芯片拍照，以获取芯片的不同荧光通道的照片。
所述S3具体包括以下步骤：
S31：对照片进行灰度化处理，以将照片转换成单通道的灰度图像；
S32：基于灰度化处理后的照片，采用高斯滤波算法对其进行滤波降噪处理；
S33：对照片进行直方图均衡化处理。
所述S4具体包括以下步骤：
S41：通过模板匹配算法获取明场或暗场照片内的每个液滴的位置参数，其中位置参数包括液滴中心坐标、液滴半径；
S42：基于S41获取的每个液滴的位置参数，将照片内的每个液滴进行标识。
所述S5包括以下步骤：
S51：基于S41获取的每个液滴的位置参数，找到在荧光通道照片内与之相对应的液滴的位置；
S52：在荧光通道照片内对每个液滴做标识。
所述S6包括以下步骤：
S61：基于每个液滴的位置参数，计算荧光通道照片内的每个液滴的体积；
S62：依据以下公式，获取每个液滴内的所有像素点；
(m-x)2+(n-y)2≤r2，
其中，(m,n)为像素点坐标，(x,y)为液滴的中心坐标，r为液滴的半径；
S63：计算每个液滴在图像上的所有像素亮度值之和
Figure BDA0003005755850000051
其中，i＝0，Λn为液滴内所有像素的点数，k为液滴内某一像素点的亮度值；
S64：计算每个液滴的荧光均值
Figure BDA0003005755850000052
所述S7包括以下步骤：
S71：依据每个液滴的荧光均值，画出液滴-荧光散点图；
S72：在液滴-荧光散点图上画出分类线，并以该分类线为界限筛选出阴性和阳性液滴。
本发明工作原理：
继续参照图1至9所示，该方法是通过相机在不同的灯照环境下对芯片拍照，进而获取液滴的明场(或暗场)以及不同荧光通道的照片，进而基于图像识别技术，检测出液滴的数量并计算出单个液滴的大小和荧光均值，具体地：
首先将油与含有荧光染料的样本液注入芯片(荧光染料能使每个液滴激发出荧光，此时拍摄的照片为荧光照片)，以生成几万或几十万个液滴单层平铺于芯片内，随后，将芯片通过升降温装置进行PCR扩增反应；随后，将芯片放入荧光检测装置，保持芯片的位置不动，依次使用LED灯、激光以相应时长去照射芯片，然后使用相机对芯片拍照，可分别获取芯片的明场(或暗场)照片(如图2至3所示)和各个荧光通道照片(如图4所示)，其中，明场(或暗场)照片保存着每个液滴的大小和位置信息，各个荧光通道的照片保存着液滴的荧光信息；随后，为保证图像识别的精确度，需要对获取的照片进行预处理，预处理包括灰度化处理、滤波降噪处理和直方图均衡化处理，其中灰度化处理是将照片转换成单通道的灰度图像，对于明场照片，可采用以下公式将其转换成灰度图像，其中，R、G、B分别代表彩色图像的红色、绿色和蓝色的通道信号。
I＝0.299×R+0.587×G+0.114×B，
而对于荧光通道照片，可依据荧光信号的波长范围，选择彩色图像中的固定通道作为灰度图像；滤波降噪处理则是采用高斯滤波算法，其是用一个模板(或称卷积、掩模)扫描图像中的每一个像素，用模板确定的领域内的像素的加权平均灰度值去替代模板中心像素点的值，所用公式为：
Figure BDA0003005755850000061
其中，A是振幅，(ux,uy)是中心点坐标，σx,σy是方差。
至于直方图均衡化处理，则首先要计算输入图像的直方图H，随后将直方图归一化处理(直方图组距的和为255)，随后，采用下式计算直方图积分，最后将H'作为查询表进行图像变换。
H'(i)＝∑0≤j≤iH(i)，
在对照片进行预处理后，可通过模板匹配算法获取明场或暗场照片内的每个液滴的位置参数，其中位置参数包括液滴中心坐标、液滴半径，具体地，可首先创建一个匹配模板，具体根据液滴的大小设定阈值，随后，在明场(或暗场)照片上匹配模板，匹配到的即为液滴，进而得到液滴的位置信息，并在照片内对每个液滴进行标识(如图5至6所示，采用十字架对液滴中心标识)；随后，依据在明场(或暗场)照片上获取的每个液滴的中心坐标和液滴半径，在各个荧光通道照片内找出与之对应的液滴的位置，并做标识(如图7所示)；随后，依据每个液滴的位置参数，计算荧光通道照片内的每个液滴的体积：
Figure BDA0003005755850000071
其中，π＝3.14。
随后，通过下式获取每个液滴内的所有像素点：
(m-x)2+(n-y)2≤r2，
其中，(m,n)为像素点坐标，(x,y)为液滴的中心坐标，r为液滴的半径。
然后，再计算每个液滴在图像上的所有像素亮度值之和
Figure BDA0003005755850000072
其中，i＝0，Λn为液滴内所有像素的点数，k为液滴内某一像素点的亮度值，随后，即可计算每个液滴的荧光均值
Figure BDA0003005755850000073
最后，如图8至9所示，可依据每个液滴的荧光均值，画出液滴-荧光散点图，然后，人工或者软件自动画出分类线，低于分类线阈值的为阴性液滴，反之则为阳性液滴。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：获取已生成液滴并完成PCR反应的芯片；
S2：获取芯片的明场或暗场照片，以及不同荧光通道的照片；
S3：对获取的明场或暗场照片，以及不同荧光通道的照片进行预处理；
S4：基于预处理后的明场或暗场照片，获取每个液滴的位置参数并在照片内标识每个液滴；
S5：基于S4获取的每个液滴的位置参数，将每个液滴的位置映射于各个荧光通道照片内的对应液滴上；
S6：基于每个液滴的位置参数，计算每个荧光通道照片内的相应液滴的荧光均值；
S7：基于每个液滴的荧光均值，筛选出阴性和阳性液滴。
2.根据权利要求1所述的基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法，其特征在于，所述S1具体包括以下步骤：
S11：将油与含有荧光染料的样本液注入芯片，以生成几万或几十万个液滴单层平铺于芯片内；
S12：将芯片通过升降温装置进行PCR反应。
3.根据权利要求1所述的基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法，其特征在于，所述S2具体包括以下步骤：
S21：通过LED灯照射芯片，并使用相机对芯片拍照，以获取芯片的明场或暗场照片；
S22：在不移动芯片的情况下，通过激光照射芯片，并使用相机对芯片拍照，以获取芯片的不同荧光通道的照片。
4.根据权利要求1所述的基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法，其特征在于，所述S3具体包括以下步骤：
S31：对照片进行灰度化处理，以将照片转换成单通道的灰度图像；
S32：基于灰度化处理后的照片，采用高斯滤波算法对其进行滤波降噪处理；
S33：对照片进行直方图均衡化处理。
5.根据权利要求1所述的基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法，其特征在于，所述S4具体包括以下步骤：
S41：通过模板匹配算法获取明场或暗场照片内的每个液滴的位置参数，其中，位置参数包括液滴中心坐标、液滴半径；
S42：基于S41获取的每个液滴的位置参数，将照片内的每个液滴进行标识。
6.根据权利要求5所述的基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法，其特征在于，所述S5包括以下步骤：
S51：基于S41获取的每个液滴的位置参数，找到在荧光通道照片内与之相对应的液滴的位置；
S52：在荧光通道照片内对每个液滴做标识。
7.根据权利要求6所述的基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法，其特征在于，所述S6包括以下步骤：
S61：基于每个液滴的位置参数，计算荧光通道照片内的每个液滴的体积；
S62：依据以下公式，获取每个液滴内的所有像素点；
(m-x)2+(n-y)2≤r2，
其中，(m,n)为像素点坐标，(x,y)为液滴的中心坐标，r为液滴的半径；
S63：计算每个液滴在图像上的所有像素亮度值之和
Figure FDA0003005755840000031
其中，i＝0，Λn为液滴内所有像素的点数，k为液滴内某一像素点的亮度值；
S64：计算每个液滴的荧光均值
Figure FDA0003005755840000032
8.根据权利要求1所述的基于图像识别的数字PCR液滴荧光检测方法，其特征在于，所述S7包括以下步骤：
S71：依据每个液滴的荧光均值，画出液滴-荧光散点图；
S72：在液滴-荧光散点图上画出分类线，并以该分类线为界限筛选出阴性和阳性液滴。
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