CN107254511A - 一种数字pcr芯片信号读取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种数字PCR芯片信号读取方法，包括：将反应溶液加入若干个反应芯片中；对各反应芯片进行扩增；获取各反应芯片的荧光试剂图像；对各荧光试剂图像进行归一化处理；读取各反应芯片中的有效孔数目，获得总有效孔数目；读取各反应芯片中位孔内部的荧光强度，并建立荧光直方图；根据所述荧光直方图设置各反应芯片的阳性判定阈值，获取总阳性位点数目；根据总阳性位点数目和总有效孔数目的比值，计算待测样本溶液的浓度。本发明的扩增系统与检测系统能够和现有微孔芯片式数字PCR技术完全兼容，通过多次成像的方式获取多张扩增后的芯片荧光图像，对扩增芯片图像进行直方图、散点图分析获得高通量的数字PCR检测结果，提高检测精度。
Description
技术领域
本发明涉及数字PCR生物检测领域，特别是涉及一种数字PCR芯片信号读取方法。
背景技术
在进行核酸定量分析检测时，核酸样品常应用聚合酶链反应(Ploymerase ChainReaction，PCR)扩增以方便检测。1992年由Higuchi等提出的实时荧光定量PCR(Real-timePCR，qPCR)技术[Polymerase chain reaction(PCR)amplification and human leukocyteantigen(HLA)-DQ alpha oligonucleotide typing on biological evidence samples：casework experience，Journal of Forensic Sciences 37(3)：700-26·June 1992]，已发展成为一种最普遍应用的定量分析技术，广泛应用于临床疾病诊断、检验检疫、食品安全等领域。qPCR的分析结果高度依赖循环阈值(Cycle threshold，Ct值)，而Ct值又由PCR效率决定。当样本中检测靶标纯度、浓度很低时，会显著降低qPCR的反应效率和成功率。qPCR是一种相对定量的检测技术，当前主要应用在待测样本需要相对定量的场合，在检测低频稀有突变、微小表达差异(小于1.5倍)、微量核酸样本时，qPCR通常无法成功。qPCR通常是利用移液枪将反应体系分布在96或384孔板中，经过后续扩增与荧光信号检测完成实验。单个孔的反应体积一般在微升级别，受到移液枪和其他相关系统精度的限制，在少量样本的分析中面临挑战。Fludigm的微流控芯片可将每个反应液滴体积降至纳升级别，显著降低了检测限度。然而该芯片制备过程复杂，成本高昂，且对于常见分析，微升级别的反应体系已经能满足其分析精度要求。
Vogelstein等人于1999年提出的数字PCR(digital PCR，dPCR)技术[B.Vogelstein and Kenneth W.Kinzler,Digital PCR,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America,1999,96(16):9236-9241]近年来迅猛发展。dPCR将一份样品分配到几万甚至百万个独立反应单元中，每个反应单元包含至多1个目标分子，分配效率达到了分子水平。然后在每个反应单元中分别进行PCR扩增反应，扩增结束后根据监测到的荧光信号进行统计学分析，得到原样品的浓度。dPCR不依赖于Ct值，不受扩增效率的影响，因此具有很好的准确度和重现性，可以实现绝对定量分析。因其检测结果准确可靠，且检测限度极低，故广泛应用在基因不稳定性分析、肿瘤早期诊断、产前诊断等领域。
dPCR的核心是液滴分割技术，当前主要通过微流控形成微液滴和微孔芯片实现。首先将样本分割成大量微小液滴，分割结束后进行PCR反应，然后利用仪器读取所有液滴中的荧光信号，通过荧光信号的强度判断阳性反应和阴性反应，最后根据阳性反应液滴数在总反应液滴数中的比例计算出原始样本中标记DNA分子的浓度。而dPCR的分液数目直接决定了dPCR的检测精度。微流控dPCR借助复杂的液体流道实现液滴的定量分割，扩增后逐个分析液滴的荧光信号，液滴数量可以达到百万个，其缺点在于微孔道易堵塞，微液滴不稳定，在PCR热循环反应过程中液滴易发生融合、破损，此外，微液滴dPCR的信号采用串行的读取方式，检测耗时长，芯片成本高。芯片法的优势是可实现大量液滴的一步获取和分析，但受限于检测光学系统的有效视场，单次分析的微孔数目一般不超过20000个[中国发明专利，申请号：201380022560.0]。
综上所述，受限于目前的数字PCR液滴分割技术，采用微孔芯片法进行液滴分割的数字PCR方式，单次检测数目有限，精度较低。开发高通量数字PCR芯片荧光信号读取和分析方法具有重要意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种数字PCR芯片信号读取方法，用于解决现有技术中数字PCR检测中分液量限制引起检测精度低的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种数字PCR芯片信号读取方法，所述数字PCR芯片信号读取方法至少包括：
步骤S1：将反应溶液加入若干个反应芯片中，所述反应芯片的数量不少于2个；
步骤S2：将各反应芯片加入PCR扩增仪中进行扩增；
步骤S3：将各反应芯片放置于荧光成像系统中，获取各反应芯片的荧光试剂图像；
步骤S4：对各反应芯片的荧光试剂图像进行归一化处理；
步骤S5：根据各反应芯片的荧光试剂图像读取各反应芯片中的有效孔数目，并将有效孔数目进行累加以获得总有效孔数目；
步骤S6：根据各反应芯片的荧光试剂图像读取各反应芯片中位孔内部的荧光强度，并建立荧光直方图；
步骤S7：根据所述荧光直方图设置各反应芯片的阳性判定阈值，获取各反应芯片中阳性位点的数目，对阳性位点的数目进行累加以得到总阳性位点数目；
步骤S8：根据总阳性位点数目和总有效孔数目的比值，利用泊松方程计算所述反应溶液中的待测样本溶液的浓度。
优选地，所述反应溶液平行地加入各反应芯片中。
更优选地，所述反应溶液加入到各反应芯片中的方法包括刷入、打印或者微流控方式。
优选地，各反应芯片的扩增周期为20～40个周期。
优选地，所述荧光试剂图像包括：ROX荧光试剂图像，FAM荧光试剂图像或VIC荧光试剂图像。
更优选地，所述归一化处理进一步包括以下步骤：
步骤S41：读取实际拍摄的荧光试剂图像L；
步骤S42：拍摄相同积分时间条件下所述荧光试剂图像的暗场图像D；
步骤S43：拍摄相同积分时间条件下所述荧光试剂图像的平场图像F；
步骤S44：拍摄0积分时间下所述荧光试剂图像的偏置图像B；
步骤S45：校准所述荧光试剂图像，得到校准后的荧光试剂图像J，满足如下关系式：
J(x,y)＝[L(x,y)-D(x,y)]/[F(x,y)-B(x,y)]，
其中，J(x,y)为校准后的荧光试剂图像在坐标(x,y)处的灰度值，L(x,y)为实际拍摄的荧光试剂图像在坐标(x,y)处的灰度值，D(x,y)为相同积分时间条件下的荧光试剂图像的暗场图像在坐标(x,y)处的灰度值，F(x,y)为相同积分时间条件下的荧光试剂图像的平场图像在坐标(x,y)处的灰度值，B(x,y)为0积分时间条件下的荧光试剂图像的偏置图像在坐标(x,y)处的灰度值；
步骤S46：对校准后的荧光试剂图像J进行灰度分析，进而获取归一化处理后的荧光试剂图像J'，满足如下关系式：
其中，R＝2n，n为拍摄荧光试剂图像的探测器的模数转换单元输出的有效位数，J(x,y)为归一化处理后的荧光试剂图像在坐标(x,y)处的灰度值。
更优选地，步骤S5进一步包括：
步骤S51：读取ROX荧光试剂图像；
步骤S52：对所述ROX荧光试剂图像进行不少于三次的膨胀处理；
步骤S53：获取膨胀图像之后，检测所述膨胀图像内最大连通区域；
步骤S54：读取所述ROX荧光试剂图像中与所述膨胀图像内最大连通区域所对应的连通区域；
步骤S55：对所述ROX荧光试剂图像中对应区域内的灰度值进行边缘检测算法，并对图像中的反应孔进行拟合，获取ROX阳性孔位置中心坐标和阳性孔数目；
步骤S56：将各反应芯片中ROX阳性孔数目进行累加，总有效孔数目满足如下关系式：
Dtotal＝D1+D2+D3+......+DN，
其中，Dtotal为总有效孔数目，D1～DN分别为各个反应芯片的阳性孔数目，N为所述反应芯片的数量。
更优选地，步骤S6进一步包括：
步骤S61：读取归一化处理后的FAM荧光试剂图像或归一化处理后的VIC荧光试剂图像；
步骤S62：根据步骤S5中获取的对应反应芯片的ROX阳性孔位置中心坐标，读取归一化处理后的FAM荧光试剂图像或归一化处理后的VIC荧光试剂图像在该对应坐标下的灰度值；
步骤S63：将所有反应芯片中的FAM荧光强度值或VIC荧光强度值分别绘制成FAM荧光直方图或VIC荧光直方图。
更优选地，步骤S6进一步包括：
步骤S61：读取归一化处理后的FAM荧光试剂图像或归一化处理后的VIC荧光试剂图像；
步骤S62：根据步骤S5中获取的对应反应芯片的ROX阳性孔位置中心坐标，读取归一化处理后的FAM荧光试剂图像或归一化处理后的VIC荧光试剂图像在该对应坐标下的灰度值及其周围坐标下的灰度值，分别满足如下关系：
其中，S(x,y)为ROX阳性孔位置中心坐标对应的归一化处理后的FAM荧光试剂图像或归一化处理后的VIC荧光试剂图像中的灰度值，S(x-1,y)、S(x-1,y-1)、S(x-1,y+1)、S(x,y-1)、S(x,y+1)、S(x+1,y-1)、S(x+1,y)、S(x+1,y+1)为周围坐标对应的归一化处理后的FAM荧光试剂图像或归一化处理后的VIC荧光试剂图像中的灰度值；
步骤S63：将所有反应芯片中的FAM荧光强度值或VIC荧光强度值分别绘制成FAM荧光直方图或VIC荧光直方图。
更优选地，步骤S7进一步包括：选定所述FAM荧光直方图或所述VIC荧光直方图的尖峰对应的灰度值的平均值为所述阳性判定阈值，若荧光强度高于所述阳性判定阈值，则认为是阳性反应；若荧光强度低于所述阳性判定阈值，则认为是阴性反应；以此获取总阳性位点数目。
更优选地，反应溶液中的待测样本溶液的浓度满足如下关系式：
其中，Dtotal为总有效孔数目，POS为总阳性位点数目。
如上所述，本发明的数字PCR芯片信号读取方法，具有以下有益效果：
本发明的数字PCR芯片信号读取方法的扩增系统与检测系统能够和现有微孔芯片式数字PCR技术完全兼容，通过多次成像的方式获取多张扩增后的芯片荧光图像，对扩增芯片图像进行直方图、散点图分析获得高通量的数字PCR检测结果，提高检测精度。
附图说明
图1显示为本发明的数字PCR芯片信号读取方法的流程示意图。
图2显示为本发明的ROX荧光试剂图像。
图3显示为本发明的FAM荧光试剂图像。
图4显示为本发明的VIC荧光试剂图像。
图5显示为本发明的ROX通道拟合的反应孔示意图。
图6显示为本发明的归一化处理后的FAM荧光试剂图像。
图7显示为本发明的FAM荧光直方图。
图8显示为本发明的VIC荧光直方图。
元件标号说明
S1～S7 步骤
S41～S46 步骤
S51～S56 步骤
S61～S63 步骤
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
请参阅图1～图8。需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。
实施例一
如图1所示，本实施例提供一种数字PCR芯片信号读取方法，所述数字PCR芯片信号读取方法具体包括以下步骤：
步骤S1：将反应溶液加入若干个反应芯片中，并利用矿物油将涂布好的各反应芯片进行油封，然后为各反应芯片加上透明盖子进行封装。所述反应芯片的数量不少于2个。
具体地，在本实施例中，选取16个数字PCR反应芯片。所述数字PCR芯片是指可将PCR反应体系分隔固定的平面微孔结构，所述微孔结构为任意几何形状的闭孔或通孔，所述数字PCR芯片的材质包括但不限于硅基，玻璃，塑料和金属，再此不一一列举。
具体地，在本实施例中，所述反应溶液平行地加入各反应芯片中。更具体地，配置反应溶液，所述反应溶液的量为所有反应芯片的总进液量，假设单个反应芯片的进液量为15ul，则16个反应芯片的总进液量为240ul，因此直接配置240ul的反应溶液，所述反应溶液包括但不限于待测样本溶液、溴酚蓝(mastermix)、探针或引物，将所述反应溶液分别加入到各反应芯片中，以此实现平行地加入。所述反应溶液加入到各反应芯片中的方法包括刷入、打印或者微流控方式，在本实施例中，采用微流控方式。
步骤S2：将各反应芯片加入PCR扩增仪中进行扩增。
具体地，将封装好的各反应芯片放置进入PCR扩增仪中，所述PCR扩增仪可以是现有技术中任意一种，再此不做具体限定。按照设定的PCR扩增条件进行反应，PCR扩增周期一般为20～40个周期。
步骤S3：将各反应芯片放置于荧光成像系统中，获取各反应芯片的荧光试剂图像。
具体地，采用不同的荧光试剂获取每张反应芯片的多张图像，所述荧光试剂包括但不限于ROX(罗红霉素)、SYBR(不对称花青染料)、TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)、TesasRed(德州红)、Cy5(菁染料)、FAM(6－羧基荧光素)、TET(四氯荧光素)、VIC(绿色荧光蛋白)、JOE(2，7－二甲基－4，5－二氯－6－羧基荧光素)、HEX(六氯－6－甲基荧光素)。所述荧光试剂图像的数量不少于2张。在本实施例中，每个反应芯片包括两种荧光试剂图像，分别对应于ROX荧光试剂图像和FAM荧光试剂图像。如图2所示为ROX荧光试剂图像，在本实施例中，采用555nm～585nm波长的光照射所述反应芯片，利用图像传感器采集610nm～650nm波长的光获取所述ROX荧光试剂图像。如图3所示为FAM荧光试剂图像，在本实施例中，采用500nm～535nm波长的光照射所述反应芯片，利用图像传感器采集560nm～580nm波长的光获取所述FAM荧光试剂图像。
步骤S4：对各反应芯片的荧光试剂图像进行归一化处理。
具体地，需要进行归一化处理的荧光试剂图像包括所述FAM荧光试剂图像。所述ROX荧光试剂图像可以进行归一化处理，以获得更好的识别效果；也可以不进行归一化处理，对最终的结果影响不大。在本实施例中，所述ROX荧光试剂图像及所述FAM荧光试剂图像均执行图像归一化处理。所述图像的归一化处理包括以下步骤：
步骤S41：读取实际拍摄的荧光试剂图像L；
步骤S42：拍摄相同积分时间条件下所述荧光试剂图像的暗场图像D(DarkFrame)；
步骤S43：拍摄相同积分时间条件下所述荧光试剂图像的平场图像F(FlatFrame)；
步骤S44：拍摄0积分时间下所述荧光试剂图像的偏置图像B(BIAS Frame)；
步骤S45：校准所述荧光试剂图像，得到校准后的荧光试剂图像J，满足如下关系式：
J(x,y)＝[L(x,y)-D(x,y)]/[F(x,y)-B(x,y)]，
其中，J(x,y)为校准后的荧光试剂图像在坐标(x,y)处的灰度值，L(x,y)为实际拍摄的荧光试剂图像在坐标(x,y)处的灰度值，D(x,y)为相同积分时间条件下的荧光试剂图像的暗场图像在坐标(x,y)处的灰度值，F(x,y)为相同积分时间条件下的荧光试剂图像的平场图像在坐标(x,y)处的灰度值，B(x,y)为0积分时间条件下的荧光试剂图像的偏置图像在坐标(x,y)处的灰度值；
步骤S46：对校准后的荧光试剂图像J进行灰度分析，进而获取归一化处理后的荧光试剂图像J'，满足如下关系式：
其中，R＝2n，n为拍摄荧光试剂图像的探测器的模数转换单元(ADC)输出的有效位数，J'(x,y)为归一化处理后的荧光试剂图像在坐标(x,y)处的灰度值。
步骤S5：根据反应芯片的荧光试剂图像读取各反应芯片中的有效孔数目，并将有效孔数目进行累加得到总有效孔数目Dtotal。
具体地，包括以下步骤：
步骤S51：在本实施例中，读取ROX荧光成像通道下的16张经过归一化处理后的ROX荧光试剂图像J'ROX。在实际应用中，也可直接读取实际拍摄的所述ROX荧光试剂图像LROX，在此不一一赘述。
步骤S52：对归一化处理后的ROX荧光试剂图像J'ROX进行三次或者三次以上(即不少于三次)的膨胀处理。在本实施例中，一种可实施的膨胀算法具体实现matlab代码如下：
步骤S53：获取膨胀图像之后，检测所述膨胀图像内最大连通区域；
步骤S54：读取归一化处理后的ROX荧光试剂图像J'ROX中与所述膨胀图像内最大连通区域所对应的连通区域；
步骤S55：对归一化处理后的ROX荧光试剂图像J'ROX中对应区域内的灰度值进行边缘检测算法，并采用包括但不限于圆形、菱形、正六边形等形状对图像中的反应孔进行拟合，获取ROX阳性孔位置中心坐标和阳性孔数目Dn；如图5所示，在本实施例中，采用圆形对归一化处理后的ROX荧光试剂图像J'ROX中的反应孔进行拟合，圆圈中心坐标即为中心坐标。
步骤S56：将多个反应芯片中ROX阳性孔数目进行累加，总有效孔数目满足如下关系式：
Dtotal＝D1+D2+D3+......+DN
在本实施例中，所述反应芯片的数量为16个，N取值16。
步骤S6：根据反应芯片的荧光试剂图像读取所有反应芯片中的位孔内部荧光强度，并形成荧光直方图。
具体地，包括以下步骤：
步骤S61：对于特定一张反应芯片，读取其对应的归一化处理后的FAM荧光试剂图像J'FAM，如图6所示为归一化处理后的FAM荧光试剂图像J'FAM；
步骤S62：根据步骤S5中获取的对应反应芯片的ROX阳性孔位置中心坐标，读取归一化处理后的FAM荧光试剂图像J'FAM在该对应坐标下的灰度值；
步骤S63：将所有16个反应芯片中的FAM荧光强度值绘制成FAM荧光直方图，如图7所示，其中，x轴为灰度值，y轴为对应x轴灰度值的像素数量。
步骤S7：根据所述FAM荧光直方图设置各反应芯片的阳性判定阈值，获取阳性位点数目，并将阳性位点数目进行累加。
具体地，一般而言，对于一个有效的FAM荧光直方图，会出现两个尖峰；选定两个尖峰的X轴坐标的平均值为阳性判定阈值(设两个尖峰的X轴坐标为X1和X2，则所述反应阈值为如果荧光强度高于所述阳性判定阈值，则认为是阳性反应，如果荧光强度低于所述阳性判定阈值，则认为是阴性反应，可获得各芯片对应的FAM通道阳性反应数目PosFAM、及FAM通道阴性反应数目NegFAM。阳性反应数目即为阳性位点数目，将阳性位点数目进行累加以获得总FAM通道阳性位点数目POSFAMtotal。
步骤S8：根据总FAM通道阳性位点数目POSFAMtotal和总有效孔数目Dtotal的比值，利用泊松方程计算所述反应溶液中的待测样本溶液的浓度，满足如下关系式：
实施例二
本实施例提供一种数字PCR芯片信号读取方法，所述数字PCR芯片信号读取方法与实施例一基本相同，不同之处在于，用VIC荧光试剂图像替换所述FAM荧光试剂图像，以针对不同的检测对象。
具体地，在步骤S3中，获取的荧光试剂图像包括ROX荧光试剂图像和VIC荧光试剂图像。如图4所示为VIC荧光试剂图像，在本实施例中，采用450nm～490nm波长的光照射所述反应芯片，利用图像传感器采集515nm～530nm波长的光获取所述VIC荧光试剂图像。
具体地，在步骤S4中，对所述ROX荧光试剂图像和VIC荧光试剂图像均进行归一化处理，归一化处理的具体步骤与实施例一一致，在此不一一赘述。
具体地，在步骤S6中，读取特定反应芯片对应的归一化处理后的VIC荧光试剂图像J'VIC；根据步骤S5中获取的对应反应芯片的ROX阳性孔位置中心坐标，读取归一化处理后的VIC荧光试剂图像J′VIC在该对应坐标下的灰度值；将所有16个反应芯片中的VIC荧光强度值绘制成VIC荧光直方图，如图8所示，其中，x轴为灰度值，y轴为对应x轴灰度值的像素数量。
具体地，在步骤S7中，选定VIC荧光直方图中两个尖峰的X轴坐标的平均值为阳性判定阈值(在本实施例中，设两个尖峰的X轴坐标为X3和X4，则所述反应阈值为如果荧光强度高于所述阳性判定阈值，则认为是阳性反应，如果荧光强度低于所述阳性判定阈值，则认为是阴性反应，可获得各芯片对应的VIC通道阳性反应数目PosVIC及VIC通道阴性反应数目NegVIC。将阳性位点数目进行累加以获得总VIC通道阳性位点数目POSVICtotal。
具体地，在步骤S8中，根据总VIC通道阳性位点数目POSVICtotal和总有效孔数目Dtotal的比值，利用泊松方程计算所述反应溶液中的待测样本溶液的浓度，满足如下关系式：
实施例三
本实施例提供一种数字PCR芯片信号读取方法，所述数字PCR芯片信号读取方法与实施例一、二基本相同，不同之处在于，步骤S62中，读取的灰度值为对应坐标像素及对应坐标周围像素的荧光试剂图像灰度平均值。
具体地，步骤S62：根据步骤S5中获取的对应反应芯片的ROX阳性孔位置中心坐标，读取归一化处理后的FAM荧光试剂图像J′FAM或归一化处理后的VIC荧光试剂图像J'VIC在该对应坐标下的灰度值及对应坐标周围坐标的灰度值，并计算灰度平均值。在本实施例中，获取对应坐标周围9个像素，分别对应上、下、左、右、左上、左下、右上、右下8个方向，假设反应芯片的ROX阳性孔位置中心坐标为(x，y)，则读取归一化处理后的FAM荧光试剂图像J′FAM或归一化处理后的VIC荧光试剂图像J'VIC中对应的灰度值为S(x,y)，灰度平均值为：
其他步骤的方法一致，在此不一一赘述。
本发明的数字PCR芯片荧光信号读取方法通过多张芯片图像融合的算法可以在不改变现有芯片微孔数量的基础上提高dPCR分液数目，从而最终提升dPCR的检测精度。
综上所述，本发明提供一种数字PCR芯片信号读取方法，包括：将反应溶液加入若干个反应芯片中；将各反应芯片加入PCR扩增仪中进行扩增；将各反应芯片放置于荧光成像系统中，获取各反应芯片的荧光试剂图像；对各反应芯片的荧光试剂图像进行归一化处理；根据各反应芯片的荧光试剂图像读取各反应芯片中的有效孔数目，并将有效孔数目进行累加以获得总有效孔数目；根据各反应芯片的荧光试剂图像读取各反应芯片中位孔内部的荧光强度，并建立荧光直方图；根据所述荧光直方图设置各反应芯片的阳性判定阈值，获取各反应芯片中阳性位点的数目，对阳性位点的数目进行累加以得到总阳性位点数目；根据总阳性位点数目和总有效孔数目的比值，利用泊松方程计算所述反应溶液中的待测样本溶液的浓度。本发明的数字PCR芯片信号读取方法的扩增系统与检测系统能够和现有微孔芯片式数字PCR技术完全兼容，通过多次成像的方式获取多张扩增后的芯片荧光图像，对扩增芯片图像进行直方图、散点图分析获得高通量的数字PCR检测结果，提高检测精度。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (11)
1.一种数字PCR芯片信号读取方法，其特征在于，所述数字PCR芯片信号读取方法至少包括：
步骤S1：将反应溶液加入若干个反应芯片中，所述反应芯片的数量不少于2个；
步骤S2：将各反应芯片加入PCR扩增仪中进行扩增；
步骤S3：将各反应芯片放置于荧光成像系统中，获取各反应芯片的荧光试剂图像；
步骤S4：对各反应芯片的荧光试剂图像进行归一化处理；
步骤S5：根据各反应芯片的荧光试剂图像读取各反应芯片中的有效孔数目，并将有效孔数目进行累加以获得总有效孔数目；
步骤S6：根据各反应芯片的荧光试剂图像读取各反应芯片中位孔内部的荧光强度，并建立荧光直方图；
步骤S7：根据所述荧光直方图设置各反应芯片的阳性判定阈值，获取各反应芯片中阳性位点的数目，对阳性位点的数目进行累加以得到总阳性位点数目；
步骤S8：根据总阳性位点数目和总有效孔数目的比值，利用泊松方程计算所述反应溶液中的待测样本溶液的浓度。
2.根据权利要求1所述的数字PCR芯片信号读取方法，其特征在于：所述反应溶液平行地加入各反应芯片中。
3.根据权利要求1或2所述的数字PCR芯片信号读取方法，其特征在于：所述反应溶液加入到各反应芯片中的方法包括刷入、打印或者微流控方式。
4.根据权利要求1所述的数字PCR芯片信号读取方法，其特征在于：各反应芯片的扩增周期为20～40个周期。
5.根据权利要求1所述的数字PCR芯片信号读取方法，其特征在于：所述荧光试剂图像包括：ROX荧光试剂图像，FAM荧光试剂图像或VIC荧光试剂图像。
6.根据权利要求5所述的数字PCR芯片信号读取方法，其特征在于：所述归一化处理进一步包括以下步骤：
步骤S41：读取实际拍摄的荧光试剂图像L；
步骤S42：拍摄相同积分时间条件下所述荧光试剂图像的暗场图像D；
步骤S43：拍摄相同积分时间条件下所述荧光试剂图像的平场图像F；
步骤S44：拍摄0积分时间下所述荧光试剂图像的偏置图像B；
步骤S45：校准所述荧光试剂图像，得到校准后的荧光试剂图像J，满足如下关系式：
J(x,y)＝[L(x,y)-D(x,y)]/[F(x,y)-B(x,y)]，
其中，J(x,y)为校准后的荧光试剂图像在坐标(x,y)处的灰度值，L(x,y)为实际拍摄的荧光试剂图像在坐标(x,y)处的灰度值，D(x,y)为相同积分时间条件下的荧光试剂图像的暗场图像在坐标(x,y)处的灰度值，F(x,y)为相同积分时间条件下的荧光试剂图像的平场图像在坐标(x,y)处的灰度值，B(x,y)为0积分时间条件下的荧光试剂图像的偏置图像在坐标(x,y)处的灰度值；
步骤S46：对校准后的荧光试剂图像J进行灰度分析，进而获取归一化处理后的荧光试剂图像J'，满足如下关系式：
其中，R＝2n，n为拍摄荧光试剂图像的探测器的模数转换单元输出的有效位数，J'(x,y)为归一化处理后的荧光试剂图像在坐标(x,y)处的灰度值。
7.根据权利要求5所述的数字PCR芯片信号读取方法，其特征在于：步骤S5进一步包括：
步骤S51：读取ROX荧光试剂图像；
步骤S52：对所述ROX荧光试剂图像进行不少于三次的膨胀处理；
步骤S53：获取膨胀图像之后，检测所述膨胀图像内最大连通区域；
步骤S54：读取所述ROX荧光试剂图像中与所述膨胀图像内最大连通区域所对应的连通区域；
步骤S55：对所述ROX荧光试剂图像中对应区域内的灰度值进行边缘检测算法，并对图像中的反应孔进行拟合，获取ROX阳性孔位置中心坐标和阳性孔数目；
步骤S56：将各反应芯片中ROX阳性孔数目进行累加，总有效孔数目满足如下关系式：
Dtotal＝D1+D2+D3+......+DN，
其中，Dtotal为总有效孔数目，D1～DN分别为各个反应芯片的阳性孔数目，N为所述反应芯片的数量。
8.根据权利要求7所述的数字PCR芯片信号读取方法，其特征在于：步骤S6进一步包括：
步骤S61：读取归一化处理后的FAM荧光试剂图像或归一化处理后的VIC荧光试剂图像；
步骤S62：根据步骤S5中获取的对应反应芯片的ROX阳性孔位置中心坐标，读取归一化处理后的FAM荧光试剂图像或归一化处理后的VIC荧光试剂图像在该对应坐标下的灰度值；
步骤S63：将所有反应芯片中的FAM荧光强度值或VIC荧光强度值分别绘制成FAM荧光直方图或VIC荧光直方图。
9.根据权利要求7所述的数字PCR芯片信号读取方法，其特征在于：步骤S6进一步包括：
步骤S61：读取归一化处理后的FAM荧光试剂图像或归一化处理后的VIC荧光试剂图像；
步骤S62：根据步骤S5中获取的对应反应芯片的ROX阳性孔位置中心坐标，读取归一化处理后的FAM荧光试剂图像或归一化处理后的VIC荧光试剂图像在该对应坐标下的灰度值及其周围坐标下的灰度值，分别满足如下关系：
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其中，S(x,y)为ROX阳性孔位置中心坐标对应的归一化处理后的FAM荧光试剂图像或归一化处理后的VIC荧光试剂图像中的灰度值，S(x-1,y)、S(x-1,y-1)、S(x-1,y+1)、S(x,y-1)、S(x,y+1)、S(x+1,y-1)、S(x+1,y)、S(x+1,y+1)为周围坐标对应的归一化处理后的FAM荧光试剂图像或归一化处理后的VIC荧光试剂图像中的灰度值；
步骤S63：将所有反应芯片中的FAM荧光强度值或VIC荧光强度值分别绘制成FAM荧光直方图或VIC荧光直方图。
10.根据权利要求8或9所述的数字PCR芯片信号读取方法，其特征在于：步骤S7进一步包括：选定所述FAM荧光直方图或所述VIC荧光直方图的尖峰对应的灰度值的平均值为所述阳性判定阈值，若荧光强度高于所述阳性判定阈值，则认为是阳性反应；若荧光强度低于所述阳性判定阈值，则认为是阴性反应；以此获取总阳性位点数目。
11.根据权利要求10所述的数字PCR芯片信号读取方法，其特征在于：反应溶液中的待测样本溶液的浓度满足如下关系式：
其中，Dtotal为总有效孔数目，POS为总阳性位点数目。
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Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108712826A (zh) * | 2018-08-09 | 2018-10-26 | 深圳凯世光研股份有限公司 | 一种PCB板Mark点识别装置及其识别方法 |
| CN108841939A (zh) * | 2018-06-21 | 2018-11-20 | 北京致雨生物科技有限公司 | 多重数字pcr浓度测量方法及微滴式数字pcr系统 |
| CN110176277A (zh) * | 2019-06-06 | 2019-08-27 | 福州大学 | 一套基于图像识别技术的智能qPCR仪检测系统 |
| TWI704230B (zh) * | 2018-04-12 | 2020-09-11 | 奎克生技光電股份有限公司 | 數字定量pcr的核酸樣品測量方法 |
| CN112652360A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-04-13 | 苏州缔因安生物科技有限公司 | 一种数字pcr荧光信号获取方法、装置、设备及存储介质 |
| CN112813152A (zh) * | 2021-04-02 | 2021-05-18 | 深圳市博瑞生物科技有限公司 | 一种基于图像识别的数字pcr液滴荧光检测方法 |
| CN113462760A (zh) * | 2020-03-12 | 2021-10-01 | 京东方科技集团股份有限公司 | 生物芯片的检测方法、装置及设备 |
| CN113846149A (zh) * | 2021-09-28 | 2021-12-28 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 一种微孔阵列芯片的数字pcr实时分析方法 |
| CN114549528A (zh) * | 2022-04-26 | 2022-05-27 | 浙江大学 | 一种微液滴数字pcr液滴检测方法及系统 |
| CN114638832A (zh) * | 2022-05-19 | 2022-06-17 | 深圳市中科先见医疗科技有限公司 | 一种基于分水岭算法的dpcr液滴荧光检测方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103578088A (zh) * | 2013-11-20 | 2014-02-12 | 中国人民解放军海军大连舰艇学院 | 一种星空图像处理方法 |
| CN103688530A (zh) * | 2011-05-17 | 2014-03-26 | 沃思测量技术股份有限公司 | 用于生成和评估图像的方法 |
| CN104411408A (zh) * | 2012-03-16 | 2015-03-11 | 生命技术公司 | 用于生物反应的系统和方法 |
| CN105590079A (zh) * | 2015-12-23 | 2016-05-18 | 上海百傲科技股份有限公司 | 一种多张生物芯片透射信号连续自动识读的方法及设备 |
| WO2016149639A1 (en) * | 2015-03-19 | 2016-09-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Devices and methods for high-throughput single cell and biomolecule analysis and retrieval in a microfluidic chip |
-
2017
- 2017-04-27 CN CN201710288166.1A patent/CN107254511A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103688530A (zh) * | 2011-05-17 | 2014-03-26 | 沃思测量技术股份有限公司 | 用于生成和评估图像的方法 |
| CN104411408A (zh) * | 2012-03-16 | 2015-03-11 | 生命技术公司 | 用于生物反应的系统和方法 |
| CN103578088A (zh) * | 2013-11-20 | 2014-02-12 | 中国人民解放军海军大连舰艇学院 | 一种星空图像处理方法 |
| WO2016149639A1 (en) * | 2015-03-19 | 2016-09-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Devices and methods for high-throughput single cell and biomolecule analysis and retrieval in a microfluidic chip |
| CN105590079A (zh) * | 2015-12-23 | 2016-05-18 | 上海百傲科技股份有限公司 | 一种多张生物芯片透射信号连续自动识读的方法及设备 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LIFE TECHNOLOGIES-MAN0008161: "QuantStudioTM 3D AnalysisSuiteTM Software", 《LIFE TECHNOLOGIES》 * |
| 萧浪涛: "《生物信息学》", 30 September 2006 * |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI704230B (zh) * | 2018-04-12 | 2020-09-11 | 奎克生技光電股份有限公司 | 數字定量pcr的核酸樣品測量方法 |
| CN108841939A (zh) * | 2018-06-21 | 2018-11-20 | 北京致雨生物科技有限公司 | 多重数字pcr浓度测量方法及微滴式数字pcr系统 |
| CN108712826A (zh) * | 2018-08-09 | 2018-10-26 | 深圳凯世光研股份有限公司 | 一种PCB板Mark点识别装置及其识别方法 |
| CN108712826B (zh) * | 2018-08-09 | 2023-12-01 | 深圳凯世光研股份有限公司 | 一种PCB板Mark点识别装置及其识别方法 |
| CN110176277A (zh) * | 2019-06-06 | 2019-08-27 | 福州大学 | 一套基于图像识别技术的智能qPCR仪检测系统 |
| CN113462760A (zh) * | 2020-03-12 | 2021-10-01 | 京东方科技集团股份有限公司 | 生物芯片的检测方法、装置及设备 |
| CN112652360A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-04-13 | 苏州缔因安生物科技有限公司 | 一种数字pcr荧光信号获取方法、装置、设备及存储介质 |
| CN112813152A (zh) * | 2021-04-02 | 2021-05-18 | 深圳市博瑞生物科技有限公司 | 一种基于图像识别的数字pcr液滴荧光检测方法 |
| CN112813152B (zh) * | 2021-04-02 | 2021-10-15 | 深圳市博瑞生物科技有限公司 | 一种基于图像识别的数字pcr液滴荧光检测方法 |
| CN113846149A (zh) * | 2021-09-28 | 2021-12-28 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 一种微孔阵列芯片的数字pcr实时分析方法 |
| CN114549528A (zh) * | 2022-04-26 | 2022-05-27 | 浙江大学 | 一种微液滴数字pcr液滴检测方法及系统 |
| CN114549528B (zh) * | 2022-04-26 | 2022-08-05 | 浙江大学 | 一种微液滴数字pcr液滴检测方法及系统 |
| CN114638832A (zh) * | 2022-05-19 | 2022-06-17 | 深圳市中科先见医疗科技有限公司 | 一种基于分水岭算法的dpcr液滴荧光检测方法 |
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