CN114638832A - 一种基于分水岭算法的dpcr液滴荧光检测方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法，包括如下步骤：根据轮廓比值系数的大小判断出有效液滴；通过高清摄像机采集有效液滴的荧光图像，采用模糊推理法将荧光图像与明场图像的特征融合，提取出荧光轮廓信息并生成掩膜图像；通过掩膜图像的映射分离出所有的单个荧光液滴图像，对单个荧光液滴图像去除亮斑、划痕及荧光通道串扰形成的假阳性液滴，提取出所有荧光液滴图像的积分值，积分值乘以荧光系数得到每一个液滴的荧光强度值；通过积分域值线划分出阳性与阴性液滴，并通过阳性液滴的泊松分布算出浓度值。本发明能够有效的去除荧光液滴中的假阳干扰、噪声干扰及背景图像的干扰，提高DPCR浓度计算的准确度。

Description

一种基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法
技术领域
本申请涉及DPCR检测技术领域，特别是涉及一种基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法。
背景技术
针对QPCR只能实现相对定量，因此需要借助标准品生成的一个标准曲线才能实现。但是由于PCR扩增效率差异，使得相同的样品扩增结果存在很大的差异，所以QPCR实现定量检测输出十分困难。对于早期肿瘤、癌症的发现，样品定量的结果对疾病的判断有重要参考意义。因此，DPCR在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信息累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板可以进行定量分析。
清华大学医学院生物医学工程系郭永实验室在《分析学家》（Analyst）在线以封底（back cover）发表题为《一种双荧光四分类微液滴数字PCR数据的准确、可靠和自动分类方法——密度分水岭算法》的研究论文，该论文首次提出了使用密度这一变量做为液滴数据聚合的依据，再使用分水岭算法对形成的密度数据进行分割，从而实现对四类荧光数据聚类并最终实现液滴的计数。但是，如果荧光液滴形成的簇数量比较少，自然对应的密度是变低的，在低密度的情况下，簇之间的密度变化是很微小、不明显的，这个时候再基于分水岭的分割算法是不能区分微小数据之间的变化的，也就是无法达到分类效果，计算出浓度的偏差更大。
申请公布号为CN108004135A的中国发明，公开了一种基于Inkjet全自动在线液滴数字PCR装置，提出了一种通过激光诱导的荧光检测系统。但是由于微弱的荧光信息对激光的响应不一定存在，也是检测不到微弱荧光信息，以及对于干扰的荧光信号也不能进行辩别，导致计算出来的样品浓度值偏差很大，不能做为定量分析使用。
发明内容
基于此，有必要针对现有技术中DPCR浓度计算的结果偏差很大的问题，提出一种基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法。
为了实现上述目的，本申请实施例提供了一种基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法，包括如下步骤：
将采集到的液滴图像融合成边缘增强图像，所述边缘增强图像的像素与采集到的液滴图像叠加得到轮廓增强图像；
对轮廓增强图像进行OTSU模式下的二值化处理，对二值化处理后的图像进行形态学开运算处理；
对形态学开运算处理后的图像进行距离变换，将距离变换后的图像的最大像素值X倍作为分割阈值，采用二值化算法对距离变换后的图像进行数据分离得到二值图像，采用分水岭算法对二值图像进行前景、背景的分离，提取出前景图像；
采用findContours函数检索前景图像的所有轮廓，去除干扰轮廓及分离黏连轮廓后，重构嵌套轮廓的整个层次；
根据轮廓比值系数的大小判断出有效液滴；
通过高清摄像机采集有效液滴的荧光图像，采用模糊推理法将荧光图像与明场图像的特征融合，提取出荧光轮廓信息并生成掩膜图像；
通过掩膜图像的映射分离出所有的单个荧光液滴图像，对单个荧光液滴图像去除亮斑、划痕及荧光通道串扰形成的假阳性液滴，提取出所有荧光液滴图像的积分值，积分值乘以荧光系数得到每一个液滴的荧光强度值；
通过积分域值线划分出阳性与阴性液滴，并通过阳性液滴的泊松分布算出浓度值。
优选地，所述将采集到的液滴图像融合成边缘增强图像，所述边缘增强图像的像素与采集到的液滴图像叠加得到轮廓增强图像包括如下步骤：
通过高清摄像机采集液滴图像的22个点位，每个点位采集一个明场和四路荧光图像，将采集到的液滴图像保存在指定的文件夹下，并按照X与Y的规则命名每一个通道的图像；
根据金字塔图像缩放模式定义图像的缩放系数，通过循环模式按命名规则读入图像，并对读入的图像按照缩放系数进行缩放处理；
对缩放后的图像进行高斯滤波处理，所述高斯滤波处理时的内核为3x3的高斯矩阵；
对高斯滤波处理后的图像，采用Sobel算子分别计算X方向、Y方向的求解梯度，并进行线性变换成八位无符号的整型图像；
对所述整型图像再融合形成不连续的边缘增强图像，将所述边缘增强图像的像素与采集到的初始液滴图像叠加得到轮廓增强图像。
优选地，所述液滴图像是大小为5472x3648、单通道的24位深度的黑白图像。
优选地，所述金字塔图像缩放模式定义图像的缩放系数包括：
定义金字塔最大尺寸为1200，金字塔最小尺寸为800；
通过定义好的金字塔大小，确定图像的长与宽的比值，根据所述比值定义缩放图像的系数。
优选地，所述对轮廓增强图像进行OTSU模式下的二值化处理，对二值化处理后的图像进行形态学开运算处理包括如下步骤：
先设定轮廓增强图像的像素灰度级，计算每个灰度级的像素数目点占整幅图像的比例，遍历全部灰度级[0，255]寻找合适的阈值，根据所述阈值进行二值化处理；
对二值化处理后的图像一次进行腐蚀、膨胀处理，所述腐蚀和膨胀处理的运算矩阵大小都为5x5。
优选地，所述对形态学开运算处理后的图像进行距离变换，将距离变换后的图像的最大像素值X倍作为分割阈值，采用二值化算法对距离变换后的图像进行数据分离得到二值图像，采用分水岭算法对二值图像进行前景、背景的分离，提取出前景图像包括如下步骤：
计算形态学开运算处理后的图像的每一个象素点与最近零象素点的距离，并根据所述距离变换图像；
将距离变换后的图像的最大像素值X倍作为分割阈值，对距离变换后的图像进行0和255的数据分离，从而得到完整的二值图像；
从距离变换后的图像中提取种子点，根据所述种子点标记最大连通域，采用分水岭算法合并种子点和不确定区域，从而完成前景、背景的分离，并提取出前景图像。
优选地，所述每一个象素点与最近零象素点的距离计算方式为：对零象素，函数设置0距离；对其它象素，寻找由基本位移构成的最短路径。
优选地，根据所述种子点标记最大连通域的方法为：大于1为内部区域，标记1为背景区域，标记0为未知区域。
优选地，所述采用findContours函数检索前景图像的所有轮廓，去除干扰轮廓及分离黏连轮廓后，重构嵌套轮廓的整个层次包括如下步骤：
使用findContours函数检索前景图像的所有轮廓，定义轮廓的检索模式为CV_CHAIN_APPROX_SIMPLE，即仅保存轮廓的拐点信息，把所有轮廓拐点处的点保存入contours向量内，拐点与拐点之间直线段上的信息点不予保留，只保存端点；
通过轮廓长度判别小轮廓、大轮廓的干扰，并小轮廓、大轮廓从轮廓序列中去除，并跟两轮廓中心点之间的距离值判定是否存重叠轮廓，并去除重叠轮廓；
提取大轮廓分析，以任一一点为起点进行圆形轮廓跟踪，当跟踪轮廓点进行拐弯的时候定义为黏连轮廓切点，将黏连轮廓分离。
优选地，根据轮廓比值系数的大小判断出有效液滴包括如下步骤：
分别计算轮廓的弧长、面积和垂直边界最小矩形的数据；
计算基于半径的周长与轮廓的弧长之间的比值形成的周长差异比值，计算基于半径的面积与轮廓的面积之间的比值形成的面积差异比值，计算基于圆形的长宽高与轮廓垂直边界最小矩形的数据之间的比值形成的边长差异比值；
分别将周长差异比值、面积差异比值、边长差异比值乘以相对应的权重值，并进行线性组合得到最终的比值系数，根据所述比值系数判断出有效液滴。
本发明所提供的一种基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法具有如下优点和有益效果：
有效的解决黏连液滴及对阳性液滴辨识效果不明显的问题，实现了对荧光液滴的精准分割；
通过对荧光图像积分的方法可以更准地确定荧光阳性液滴与阴性液滴阈值分割线，无需过多的人为干预；
通过液滴分离算法可以对每一个荧光液滴图像进行单独分析，能够有效的去除荧光液滴中的假阳干扰、噪声干扰及背景图像的干扰，提高DPCR浓度计算的准确度。
附图说明
图1为本申请基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法较佳实施例的流程示意图。
具体实施方式
为了便于理解本申请，下面将参照相关附图对本申请进行更全面的描述。附图中给出了本申请的首选实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容更加透彻全面。
需要说明的是，当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件并与之结合为一体，或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“安装”以及类似的表述只是为了说明的目的。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“及／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在一个实施例中，如图1所示，提供了一种基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法，包括如下步骤：
S100、将采集到的液滴图像融合成边缘增强图像，所述边缘增强图像的像素与采集到的液滴图像叠加得到轮廓增强图像；
S200、对轮廓增强图像进行OTSU模式下的二值化处理，对二值化处理后的图像进行形态学开运算处理；
S300、对形态学开运算处理后的图像进行距离变换，将距离变换后的图像的最大像素值X倍作为分割阈值，采用二值化算法对距离变换后的图像进行数据分离得到二值图像，采用分水岭算法对二值图像进行前景、背景的分离，提取出前景图像；
S400、采用findContours函数检索前景图像的所有轮廓，去除干扰轮廓及分离黏连轮廓后，重构嵌套轮廓的整个层次；
S500、根据轮廓比值系数的大小判断出有效液滴；
S600、通过高清摄像机采集有效液滴的荧光图像，采用模糊推理法将荧光图像与明场图像的特征融合，提取出荧光轮廓信息并生成掩膜图像；
S700、通过掩膜图像的映射分离出所有的单个荧光液滴图像，对单个荧光液滴图像去除亮斑、划痕及荧光通道串扰形成的假阳性液滴，提取出所有荧光液滴图像的积分值，积分值乘以荧光系数得到每一个液滴的荧光强度值；
S800、通过积分域值线划分出阳性与阴性液滴，并通过阳性液滴的泊松分布算出浓度值。
具体实施时，S100、所述将采集到的液滴图像融合成边缘增强图像，所述边缘增强图像的像素与采集到的液滴图像叠加得到轮廓增强图像包括如下步骤：
通过高清摄像机采集液滴图像的22个点位，每个点位采集一个明场和四路荧光图像，将采集到的液滴图像保存在指定的文件夹下，并按照X与Y的规则命名每一个通道的图像；
根据金字塔图像缩放模式定义图像的缩放系数，通过循环模式按命名规则读入图像，并对读入的图像按照缩放系数进行缩放处理；
对缩放后的图像进行高斯滤波处理，所述高斯滤波处理时的内核为3x3的高斯矩阵；
对高斯滤波处理后的图像，采用Sobel算子分别计算X方向、Y方向的求解梯度，并进行线性变换成八位无符号的整型图像；
对所述整型图像再融合形成不连续的边缘增强图像，将所述边缘增强图像的像素与采集到的初始液滴图像叠加得到轮廓增强图像。
所述液滴图像是大小为5472x3648、单通道的24位深度的黑白图像，采集到图像的总数量为110张。
该金字塔图像缩放模式定义图像的缩放系数包括：定义金字塔最大尺寸为1200，金字塔最小尺寸为800；通过定义好的金字塔大小，确定图像的长与宽的比值，根据所述比值定义缩放图像的系数
当然，在S600与S700之间还包括有S900、对整个荧光图像进行数据转换，将三通道转换为16位景深的单通道图像，使用积分算子对16位景深的荧光图像进行积分。
具体实施时，S200、所述对轮廓增强图像进行OTSU模式下的二值化处理，对二值化处理后的图像进行形态学开运算处理包括如下步骤：
先设定轮廓增强图像的像素灰度级，计算每个灰度级的像素数目点占整幅图像的比例，遍历全部灰度级[0，255]寻找合适的阈值，根据所述阈值进行二值化处理；
对二值化处理后的图像一次进行腐蚀、膨胀处理，所述腐蚀和膨胀处理的运算矩阵大小都为5x5。
具体实施时，S300、所述对形态学开运算处理后的图像进行距离变换，将距离变换后的图像的最大像素值X倍作为分割阈值，采用二值化算法对距离变换后的图像进行数据分离得到二值图像，采用分水岭算法对二值图像进行前景、背景的分离，提取出前景图像包括如下步骤：
计算形态学开运算处理后的图像的每一个象素点与最近零象素点的距离，并根据所述距离变换图像；
将距离变换后的图像的最大像素值X倍作为分割阈值，对距离变换后的图像进行0和255的数据分离，从而得到完整的二值图像；
从距离变换后的图像中提取种子点，根据所述种子点标记最大连通域，采用分水岭算法合并种子点和不确定区域，从而完成前景、背景的分离，并提取出前景图像。
具体实施时，所述每一个象素点与最近零象素点的距离计算方式为：对零象素，函数设置0距离；对其它象素，寻找由基本位移构成的最短路径，该基本位移包括水平、垂直、对角线。根据所述种子点标记最大连通域的方法为：大于1为内部区域，标记1为背景区域，标记0为未知区域。
具体实施时，S400、所述采用findContours函数检索前景图像的所有轮廓，去除干扰轮廓及分离黏连轮廓后，重构嵌套轮廓的整个层次包括如下步骤：
使用findContours函数检索前景图像的所有轮廓，定义轮廓的检索模式为CV_CHAIN_APPROX_SIMPLE，即仅保存轮廓的拐点信息，把所有轮廓拐点处的点保存入contours向量内，拐点与拐点之间直线段上的信息点不予保留，只保存端点，对于水平，垂直或者斜向的线段，只保存端点；
通过轮廓长度判别小轮廓、大轮廓的干扰，并小轮廓、大轮廓从轮廓序列中去除，并跟两轮廓中心点之间的距离值判定是否存重叠轮廓，并去除重叠轮廓；
提取大轮廓分析，以任一一点为起点进行圆形轮廓跟踪，当跟踪轮廓点进行拐弯的时候定义为黏连轮廓切点，将黏连轮廓分离。
具体实施时，S500、根据轮廓比值系数的大小判断出有效液滴包括如下步骤：
分别计算轮廓的弧长、面积和垂直边界最小矩形的数据；
计算基于半径的周长与轮廓的弧长之间的比值形成的周长差异比值，计算基于半径的面积与轮廓的面积之间的比值形成的面积差异比值，计算基于圆形的长宽高与轮廓垂直边界最小矩形的数据之间的比值形成的边长差异比值；
分别将周长差异比值、面积差异比值、边长差异比值乘以相对应的权重值，并进行线性组合得到最终的比值系数，根据所述比值系数判断出有效液滴，最终实现在可见光谱的照射情况下，实现对液滴的计数。
通过高清摄像机采集有效液滴的荧光图像，使用模糊推理法荧光图像与明场图像特征融合实现对荧光轮廓信息读取，并生成掩膜图像。通过荧光液滴掩膜图像的映射，分离出所有的单个荧光液滴图像。对单个荧光图像去除亮斑、划痕及荧光通道串扰形成的假阳性液滴。再对整幅荧光图像进行数据转换，把原来的三通道转换为16位景深的单通道图像，使用积分算子对16位景深的荧光图像进行积分。通过分离出来的液滴掩膜提取出每一个液滴的积分值，再计算积分图值，液滴的积分值乘以荧光系数曲线得出每一个液滴的荧光强度值。通过积分域值线划分出阳性与阴性液滴，实现阳性与阴性液滴的计数，最终通过阳性液滴的泊松分布算出浓度值。
综上，本申请提供的一种基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法，有效的解决黏连液滴及对阳性液滴辨识效果不明显的问题，实现了对荧光液滴的精准分割；通过对荧光图像积分的方法可以更准地确定荧光阳性液滴与阴性液滴阈值分割线，无需过多的人为干预；通过液滴分离算法可以对每一个荧光液滴图像进行单独分析，能够有效的去除荧光液滴中的假阳干扰、噪声干扰及背景图像的干扰，提高DPCR浓度计算的准确度。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
将采集到的液滴图像融合成边缘增强图像，所述边缘增强图像的像素与采集到的液滴图像叠加得到轮廓增强图像；
对轮廓增强图像进行OTSU模式下的二值化处理，对二值化处理后的图像进行形态学开运算处理；
对形态学开运算处理后的图像进行距离变换，将距离变换后的图像的最大像素值X倍作为分割阈值，采用二值化算法对距离变换后的图像进行数据分离得到二值图像，采用分水岭算法对二值图像进行前景、背景的分离，提取出前景图像；
采用findContours函数检索前景图像的所有轮廓，去除干扰轮廓及分离黏连轮廓后，重构嵌套轮廓的整个层次；
根据轮廓比值系数的大小判断出有效液滴；
通过高清摄像机采集有效液滴的荧光图像，采用模糊推理法将荧光图像与明场图像的特征融合，提取出荧光轮廓信息并生成掩膜图像；
通过掩膜图像的映射分离出所有的单个荧光液滴图像，对单个荧光液滴图像去除亮斑、划痕及荧光通道串扰形成的假阳性液滴，提取出所有荧光液滴图像的积分值，积分值乘以荧光系数得到每一个液滴的荧光强度值；
通过积分域值线划分出阳性与阴性液滴，并通过阳性液滴的泊松分布算出浓度值。
2.根据权利要求1所述的基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法，其特征在于，所述将采集到的液滴图像融合成边缘增强图像，所述边缘增强图像的像素与采集到的液滴图像叠加得到轮廓增强图像包括如下步骤：
通过高清摄像机采集液滴图像的22个点位，每个点位采集一个明场和四路荧光图像，将采集到的液滴图像保存在指定的文件夹下，并按照X与Y的规则命名每一个通道的图像；
根据金字塔图像缩放模式定义图像的缩放系数，通过循环模式按命名规则读入图像，并对读入的图像按照缩放系数进行缩放处理；
对缩放后的图像进行高斯滤波处理，所述高斯滤波处理时的内核为3x3的高斯矩阵；
对高斯滤波处理后的图像，采用Sobel算子分别计算X方向、Y方向的求解梯度，并进行线性变换成八位无符号的整型图像；
对所述整型图像再融合形成不连续的边缘增强图像，将所述边缘增强图像的像素与采集到的初始液滴图像叠加得到轮廓增强图像。
3.根据权利要求2所述的基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法，其特征在于，所述液滴图像是大小为5472x3648、单通道的24位深度的黑白图像。
4.根据权利要求2所述的基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法，其特征在于，所述金字塔图像缩放模式定义图像的缩放系数包括：
定义金字塔最大尺寸为1200，金字塔最小尺寸为800；
通过定义好的金字塔大小，确定图像的长与宽的比值，根据所述比值定义缩放图像的系数。
5.根据权利要求1所述的基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法，其特征在于，所述对轮廓增强图像进行OTSU模式下的二值化处理，对二值化处理后的图像进行形态学开运算处理包括如下步骤：
先设定轮廓增强图像的像素灰度级，计算每个灰度级的像素数目点占整幅图像的比例，遍历全部灰度级[0，255]寻找合适的阈值，根据所述阈值进行二值化处理；
对二值化处理后的图像一次进行腐蚀、膨胀处理，所述腐蚀和膨胀处理的运算矩阵大小都为5x5。
6.根据权利要求1所述的基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法，其特征在于，所述对形态学开运算处理后的图像进行距离变换，将距离变换后的图像的最大像素值X倍作为分割阈值，采用二值化算法对距离变换后的图像进行数据分离得到二值图像，采用分水岭算法对二值图像进行前景、背景的分离，提取出前景图像包括如下步骤：
计算形态学开运算处理后的图像的每一个象素点与最近零象素点的距离，并根据所述距离变换图像；
将距离变换后的图像的最大像素值X倍作为分割阈值，对距离变换后的图像进行0和255的数据分离，从而得到完整的二值图像；
从距离变换后的图像中提取种子点，根据所述种子点标记最大连通域，采用分水岭算法合并种子点和不确定区域，从而完成前景、背景的分离，并提取出前景图像。
7.根据权利要求6所述的基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法，其特征在于，所述每一个象素点与最近零象素点的距离计算方式为：对零象素，函数设置0距离；对其它象素，寻找由基本位移构成的最短路径。
8.根据权利要求6所述的基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法，其特征在于，根据所述种子点标记最大连通域的方法为：大于1为内部区域，标记1为背景区域，标记0为未知区域。
9.根据权利要求1所述的基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法，其特征在于，所述采用findContours函数检索前景图像的所有轮廓，去除干扰轮廓及分离黏连轮廓后，重构嵌套轮廓的整个层次包括如下步骤：
使用findContours函数检索前景图像的所有轮廓，定义轮廓的检索模式为CV_CHAIN_APPROX_SIMPLE，即仅保存轮廓的拐点信息，把所有轮廓拐点处的点保存入contours向量内，拐点与拐点之间直线段上的信息点不予保留，只保存端点；
通过轮廓长度判别小轮廓、大轮廓的干扰，并小轮廓、大轮廓从轮廓序列中去除，并跟两轮廓中心点之间的距离值判定是否存重叠轮廓，并去除重叠轮廓；
提取大轮廓分析，以任一一点为起点进行圆形轮廓跟踪，当跟踪轮廓点进行拐弯的时候定义为黏连轮廓切点，将黏连轮廓分离。
10.根据权利要求9所述的基于分水岭算法的DPCR液滴荧光检测方法，其特征在于，根据轮廓比值系数的大小判断出有效液滴包括如下步骤：
分别计算轮廓的弧长、面积和垂直边界最小矩形的数据；
计算基于半径的周长与轮廓的弧长之间的比值形成的周长差异比值，计算基于半径的面积与轮廓的面积之间的比值形成的面积差异比值，计算基于圆形的长宽高与轮廓垂直边界最小矩形的数据之间的比值形成的边长差异比值；
分别将周长差异比值、面积差异比值、边长差异比值乘以相对应的权重值，并进行线性组合得到最终的比值系数，根据所述比值系数判断出有效液滴。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115715994A (zh) * 2022-11-18 2023-02-28 深圳大学 一种图像激发超微注射方法、系统及设备
CN117455922A (zh) * 2023-12-26 2024-01-26 墨卓生物科技(浙江)有限公司 一种基于液滴运动图像的自动计数分析方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102622587A (zh) * 2012-03-08 2012-08-01 哈尔滨工程大学 基于多尺度二阶微分结构模型及改进分水岭算法的手背静脉识别方法
US20150159224A1 (en) * 2013-11-13 2015-06-11 Huidan ZHANG Ultrasensitive detection and characterization of clustered kras mutations using peptide nucleic acid clamp pcr in drop-based microfluidics
CN106596489A (zh) * 2016-12-19 2017-04-26 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法
CN107254511A (zh) * 2017-04-27 2017-10-17 臻准生物科技（上海）有限公司 一种数字pcr芯片信号读取方法
CN107844683A (zh) * 2017-10-17 2018-03-27 华东医药（杭州）基因科技有限公司 一种数字pcr液滴浓度的计算方法
CN109903296A (zh) * 2019-02-15 2019-06-18 领航基因科技（杭州）有限公司 一种基于LBP-Adaboost算法的数字PCR液滴检测方法
CN110738676A (zh) * 2019-09-17 2020-01-31 湖南大学 一种结合RGBD数据的GrabCut自动分割算法
CN111462143A (zh) * 2020-03-22 2020-07-28 华中科技大学 一种基于分水岭算法的虫体识别计数方法和系统
CN113469103A (zh) * 2021-07-14 2021-10-01 郑州大学 一种pcr液滴图像检测技术系统及其使用方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102622587A (zh) * 2012-03-08 2012-08-01 哈尔滨工程大学 基于多尺度二阶微分结构模型及改进分水岭算法的手背静脉识别方法
US20150159224A1 (en) * 2013-11-13 2015-06-11 Huidan ZHANG Ultrasensitive detection and characterization of clustered kras mutations using peptide nucleic acid clamp pcr in drop-based microfluidics
CN106596489A (zh) * 2016-12-19 2017-04-26 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法
CN107254511A (zh) * 2017-04-27 2017-10-17 臻准生物科技（上海）有限公司 一种数字pcr芯片信号读取方法
CN107844683A (zh) * 2017-10-17 2018-03-27 华东医药（杭州）基因科技有限公司 一种数字pcr液滴浓度的计算方法
CN109903296A (zh) * 2019-02-15 2019-06-18 领航基因科技（杭州）有限公司 一种基于LBP-Adaboost算法的数字PCR液滴检测方法
CN110738676A (zh) * 2019-09-17 2020-01-31 湖南大学 一种结合RGBD数据的GrabCut自动分割算法
CN111462143A (zh) * 2020-03-22 2020-07-28 华中科技大学 一种基于分水岭算法的虫体识别计数方法和系统
CN113469103A (zh) * 2021-07-14 2021-10-01 郑州大学 一种pcr液滴图像检测技术系统及其使用方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KANG CAO ET AL.: "Fluorescence initiated single droplet sorting（FISDS）platform_based on digital microfluidic", 《2016 IEEE SENSORS》 *
张嘉文 等: "基于计算机视觉的液滴图像拼接与识别算法研究", 《中国生物医学工程学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115715994A (zh) * 2022-11-18 2023-02-28 深圳大学 一种图像激发超微注射方法、系统及设备
CN115715994B (zh) * 2022-11-18 2023-11-21 深圳大学 一种图像激发超微注射方法、系统及设备
CN117455922A (zh) * 2023-12-26 2024-01-26 墨卓生物科技(浙江)有限公司 一种基于液滴运动图像的自动计数分析方法
CN117455922B (zh) * 2023-12-26 2024-04-05 墨卓生物科技(浙江)有限公司 一种基于液滴运动图像的自动计数分析方法

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