CN107367456B - 一种免洗涤图像类流式荧光检测方法和系统 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种免洗涤图像类流式细胞荧光检测方法和系统，方法包括，采用预设的目标荧光染料和染色方法对目标样品进行染色，确保染色孵育后形成一定的游离荧光染料，以使得目标样品中的所有细胞，能在免洗涤图像类流式荧光检测系统下采集到用于密度函数聚类分辨分析的荧光强度值；基于显微成像系统获取染色后的目标样品的显微荧光图像；采用计算机图像识别技术提取目标样品的灰度值和像素值；基于目标样品的灰度值和像素值计算目标样品的荧光强度值，并输出目标样品的显微荧光图像和密度函数聚类分析的结果。解决了图像类流式细胞荧光检测系统下，普通染色洗涤后检测会出现的，未染色或染色微小的阴性细胞荧光强度值为零，或出现明显断崖的问题。

Description

一种免洗涤图像类流式荧光检测方法和系统

技术领域

本发明涉及细胞检测技术领域，具体涉及一种免洗涤图像类流式荧光检测方法和系统。

背景技术

流式分析技术是一种重要的细胞分析技术，其核心的原理就是，通过荧光染料对细胞或检测单元进行荧光染色，被荧光染色后的细胞被特定波长的光照射后(入射光)，会发出另一种特定波长的光(发射光)，用光电倍增管(pmt)采集发射光对应的电压脉冲信号，以该电压脉冲信号来表达该细胞特定波长的荧光强度。然后，大量采集多个细胞的大小和荧光强度值，采用密度函数，利用阴性细胞和阳性细胞的荧光强度值的差异，进行聚类分析，通过这样的方法，将具有某种荧光强度属性的细胞可以被判断为阴性，另一类荧光强度属性的细胞被判断为阳性。基于这样的方法，采用不同的荧光染料，可以开展不同种类、不同荧光通道和不同方向的流式细胞荧光分析实验。

现在，融合了显微荧光成像技术、图像识别技术和密度函数聚类分析方法的图像类流式分析方法成为了一种新的荧光细胞分析方法。这种方法是基于显微成像系统(电荷耦合元件)获取的显微荧光图像，通过计算机图像识别技术提取目标样品的灰度值和像素值来表达荧光强度，这与流式采用非常灵敏的光电倍增管直接采集电压脉冲信号有很大的不同。在这种方法下，电荷耦合元件输出的正常可分析的图像，会滤除很多干扰信号，这会导致在光电倍增管下可以被检测到的弱荧光信号，在电荷耦合元件输出图像时，可能作为干扰信号被滤除掉。

基于这样的技术基础，在图像类流式方法下，采用上述传统流式的荧光染料和染色方法，会出现以下弊端：

大量处于弱荧光或极弱荧光区域的细胞，在图像上无法呈现出显微荧光图像特征，这样，这部分细胞就的图像灰度值会集中得0或靠近0值的一个非常集中的狭小区域。这样在进行密度函数的聚类分析时，会出现明显的荧光强度断崖。因为这个断崖是电荷耦合元件成像灵敏度的下限导致的，不是样本本身的特征，因此，这样的断崖是失真的，这样分析的结果就可能是不准确的。所以，传统的流式荧光染料和染色方法，只有在样品所发出的荧光强度大于显微成像系统的成像光路的灵敏度下限时才能进行准确分析。如果出现低于成像光路灵敏度下限的弱荧光，则无法用于图像类流式分析得到正确的结果。因此，必要开发一种适合图像类流式分析的荧光染料和染色方法。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例提供一种免洗涤图像类流式荧光检测方法和系统，以实现解决现有技术中图像类流式方法下，如果被测样品荧光强度值低于成荧光成像系统的灵敏度下限时，则无法用于图像类流式分析得到正确的结果的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种免洗涤图像类流式荧光检测方法，包括：

采用预设的目标荧光染料和染色方法对目标样品进行染色，确保染色孵育后形成一定的游离荧光染料，以使得目标样品中的所有细胞，包括经过洗涤后无法在电荷耦合元件下形成荧光成像的弱荧光阴性细胞，在图像类流式荧光检测系统下采集到用于密度函数聚类分辨分析的荧光强度值；

基于显微成像系统获取染色后的目标样品的显微荧光图像；

采用计算机图像识别技术提取目标样品的灰度值和像素值；

基于所述目标样品的灰度值和像素值计算所述目标样品的荧光强度值，并输出所述目标样品的显微荧光图像和密度函数聚类分析的结果。

优选的，上述免洗涤图像类流式荧光检测方法中，采用预设的目标荧光染料对目标样品进行染色之前，还包括：

判断是否满足条件3A>B+C*D>A，即(3A-B)/C>D>(A-B)/C，如果是，则确定需要添加的目标荧光染料的染料浓度范围为(A-B)/C*X到(3A-B)/C*X之间任意一浓度值；

其中，A为显微成像系统的荧光成像灵敏度下限值，B为目标样品中细胞自发荧光强度，C为单个细胞非特异吸附染料单位量，D为单位浓度染料发出的荧光强度，X为反应体系中细胞的个数。

优选的，上述免洗涤图像类流式荧光检测方法中，采用预设的目标荧光染料对目标样品进行染色之前，还包括：

确定反映体积Y，依据反映体积Y计算得到所需添加的目标荧光染料的体积，所述Y为目标样品反应物的体积。

优选的，上述免洗涤图像类流式荧光检测方法中，所述采用计算机图像识别技术提取目标样品的灰度值和像素值之前，还包括：

对显微荧光图像中每个检测目标的显微荧光图像区域进行边缘提取和分割，得到目标样品中的各个细胞的显微荧光图像区域。

优选的，上述免洗涤图像类流式荧光检测方法中，对显微荧光图像中每个检测目标的显微荧光图像区域进行边缘提取和分割，包括：

对显微荧光图像进行高斯平滑滤波；

对平滑滤波后的显微荧光图像进行梯度边缘检测；

依据梯度边缘检测的检测结果对所述显微荧光图像进行荧光目标前景提取；

依据提取到的目标前景对所述显微荧光图像进行单个荧光区域的分割，得到每个细胞的显微荧光图像区域。

优选的，上述免洗涤图像类流式荧光检测方法中，对显微荧光图像进行高斯平滑滤波之前还包括：

采用显微荧光成像系统采集得到目标样品的明场图像；

对明场图像中的明场目标进行识别，并且对识别出的明场目标中的团块区域进行分离，得到明场图像中每个检测目标的位置、尺寸信息；

对显微荧光图像进行识别，判断所述显微荧光图像中对应明场图像中各个检测目标的位置、尺寸信息的区域是否为空，如果否，采用得到的明场图像中每个检测目标的位置、尺寸信息相对应的区域，由所述显微荧光图像中确定对应的每个检测目标的显微荧光图像区域；

如果所述显微荧光图像中对应明场图像中检测目标的位置、尺寸信息的区域为空，对显微荧光图像进行高斯平滑滤波并执行后续操作。

优选的，上述免洗涤图像类流式荧光检测方法中，对所述显微荧光图像进行聚类分析，包括：

对所述显微荧光图像中各个细胞的显微荧光图像区域内的荧光强度值进行计算。

优选的，上述免洗涤图像类流式荧光检测方法中，对所述显微荧光图像进行聚类分析还包括：根据单通道或多通道对应的各个细胞显微荧光图像区域的荧光强度值的大小对细胞进行分类。

一种免洗涤图像类流式荧光检测系统，包括：

染色系统，用于采用预设的目标荧光染料和染色方法对目标样品进行染色，确保染色孵育后形成一定的游离荧光染料，以使得目标样品中的所有细胞，包括经过洗涤后无法在电荷耦合元件下形成荧光成像的弱荧光阴性细胞，可在免洗涤图像类流式荧光检测系统下采集到可用于密度函数聚类分辨分析的荧光强度值；

显微成像系统，用于获取染色后的目标样品的显微荧光图像；

数据处理系统，用于采用计算机图像识别技术提取目标样品的灰度值和像素值；基于所述目标样品的灰度值和像素值计算所述目标样品的荧光强度值，并输出所述目标样品的显微荧光图像和密度函数聚类分析的结果。

优选的，上述免洗涤图像类流式荧光检测系统中，还可以包括：

目标荧光染料浓度计算单元，用于判断是否满足条件3A>B+C*D>A，即(3A-B)/C>D>(A-B)/C，如果是，则确定需要添加的目标荧光染料的染料浓度范围为(A-B)/C*X到(3A-B)/C*X之间任意一浓度值；

其中，A为显微成像系统的荧光成像灵敏度下限值，B为目标样品中细胞自发荧光强度，C为单个细胞非特异吸附染料单位量，D为单位浓度染料发出的荧光强度。

优选的，上述免洗涤图像类流式荧光检测系统中，还可以包括：

目标荧光染料体积计算单元，用于确定反映体积Y，依据反映体积Y计算得到所需添加的目标荧光染料的体积，所述Y为目标样品反应物的体积。

优选的，上述免洗涤图像类流式荧光检测系统中，还可以包括：

目标提取单元，用于：对显微荧光图像中每个检测目标的显微荧光图像区域进行边缘提取和分割，得到目标样品中的各个细胞的显微荧光图像区域。

优选的，上述免洗涤图像类流式荧光检测系统中，目标提取单元具体用于：

对显微荧光图像进行高斯平滑滤波；

对平滑滤波后的显微荧光图像进行梯度边缘检测；

依据梯度边缘检测的检测结果对所述显微荧光图像进行荧光目标前景提取；

依据提取到的目标前景对所述显微荧光图像进行单个荧光区域的分割，得到每个细胞的显微荧光图像区域。

优选的，上述免洗涤图像类流式荧光检测系统中，目标提取单元具体用于：

对目标样品的明场图像中的明场目标进行识别，并且对识别出的明场目标中的团块区域进行分离，得到明场图像中每个检测目标的位置、尺寸信息；

对显微荧光图像进行识别，判断所述显微荧光图像中对应明场图像中各个检测目标的位置、尺寸信息的区域是否为空，如果否，采用得到的明场图像中每个检测目标的位置、尺寸信息相对应的区域，由所述显微荧光图像中确定对应的每个检测目标的显微荧光图像区域；

如果所述显微荧光图像中对应明场图像中检测目标的位置、尺寸信息的区域为空，对显微荧光图像进行高斯平滑滤波；

对平滑滤波后的显微荧光图像进行梯度边缘检测；

依据梯度边缘检测的检测结果对所述显微荧光图像进行荧光目标前景提取；

依据提取到的目标前景对所述显微荧光图像进行单个荧光区域的分割，得到每个细胞的显微荧光图像区域。

优选的，上述免洗涤图像类流式荧光检测系统中，所述数据处理系统内配置有聚类分析单元，所述聚类分析单元包括：

荧光强度计算单元，用于对所述显微荧光图像中各个荧光点的荧光强度值进行计算。

优选的，上述免洗涤图像类流式荧光检测系统中，所述聚类分析单元，还可以包括：

子聚类分析单元，用于根据单通道或多通道对应的各个细胞显微荧光图像区域的荧光强度值的大小对细胞进行分类。

基于上述技术方案，通过采用预设类型的目标荧光染料和染色方法对所述目标样品进行染色，从而使得当进行荧光成像时所述目标样品中的细胞在显微荧光图像中所对应的荧光强度值满足进行密度函数聚类分辨分析的要求，从而防止了对显微荧光图像进行密度函数的聚类分析时，会出现明显的荧光强度断崖的问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例公开的一种免洗涤图像类流式荧光检测方法的流程示意图；

图2为本申请另一实施例公开的一种免洗涤图像类流式荧光检测方法的流程示意图；

图3为本申请又一实施例公开的一种免洗涤图像类流式荧光检测方法的流程示意图；

图4为本申请实施例公开的一种免洗涤图像类流式荧光检测系统的结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

针对于现有技术中荧光分析中存在的上述问题，本申请公开了一种免洗涤图像类流式荧光检测方法，参见图1，该方法具体可以包括：

步骤S101：对目标样品进行染色；

本步骤具体过程为：采用预设的目标荧光染料和染色方法对目标样品进行染色，本申请在荧光检测过程中，对所述目标荧光染料的荧光效果进行了一定要求，即，对目标样品进行染色后应确保染色孵育后形成一定的游离荧光染料，以使得目标样品中的所有细胞，包括经过洗涤后无法在电荷耦合元件下形成荧光成像的弱荧光阴性细胞，在免洗涤图像类流式荧光检测系统下采集到用于密度函数聚类分辨分析的荧光强度值。在染色时，可以通过上述要求确定所述目标荧光染料的浓度和体积，通过采用所述目标荧光染料对所述目标样品进行染色，使得图像类流式荧光检测系统能够检测到处于弱荧光或极弱荧光区域的细胞，进而目标样品中所有的细胞均能够在图像类流式荧光检测系统下采集到用于密度函数聚类分辨分析的荧光强度值，从而防止了在进行密度函数的聚类分析时，出现明显的荧光强度断崖的问题；

步骤S102：采集染色后的目标样品的显微荧光图像；

在本步骤中，当采用目标荧光染料和染色方法对目标样品进行染色后，直接对染色后的目标样品进行图像采集，或得未经洗涤的目标样品的显微荧光图像；

步骤S103：提取显微荧光图像的灰度值和像素值；

在本步骤中，通过采用计算机图像识别技术对所述显微荧光图像进行处理，计算得到与显微荧光图像中的各个荧光点相匹配的目标样品的灰度值和像素值；

步骤S104：计算显微荧光图像中各个荧光点的荧光强度值；

基于所述荧光点的灰度值和像素值计算所述目标样品的各个荧光点的荧光强度值；

步骤S105：对各个荧光点的荧光前度值进行密度函数聚类分析；

在本步骤中，因为不同类型的细胞被染色后所表现的荧光强度值不同，因此，为了对目标样品中的细胞种类进行分类，在本步骤中，当计算得到各个荧光点的荧光强度值后，还需要依据各个荧光点的荧光强度值进行密度函数聚类分析，其中所述聚类分析具体指的是：对所述显微荧光图像中各个细胞的显微荧光图像区域内的荧光强度值进行计算，为了保证分类的精准性，其在分析过程中还可以包括：根据单通道或多通道对应的各个细胞显微荧光图像区域的荧光强度值的大小对细胞进行分类；

步骤S106：输出所述显微荧光图像和密度函数聚类分析的分析结果。

通过上述方案可见，在本申请上述实施例公开的技术方案中，通过采用预设类型的目标荧光染料和染色方法对所述目标样品进行染色，从而使得当进行荧光成像时所述目标样品中的细胞在显微荧光图像中所对应的荧光强度值满足进行密度函数聚类分辨分析的要求，从而防止了对显微荧光图像进行密度函数的聚类分析时，会出现明显的荧光强度断崖的问题。

具体的，在选择所述目标荧光染料时，所述目标荧光染料的浓度值和体积，可以依据所述显微成像系统的灵敏度值和目标样品的体积值计算得到，具体的，在执行步骤S101之前，计算所述目标荧光染料的浓度值的具体过程可以为：

判断是否满足条件3A>B+C*D>A，如果是，则确定需要添加的目标荧光染料的染料浓度范围为(A-B)/C*X到(3A-B)/C*X之间任意一浓度值；上述公式可等效为(3A-B)/C>D>(A-B)/C；其中上述公式中各个字符所代表的含义为：其中，A为测得的显微成像系统的荧光成像灵敏度下限值，B为目标样品中细胞自发荧光强度值，C为单个细胞非特异吸附染料单位量，D为单位浓度染料发出的荧光强度；X为反应体系中细胞的个数。

显微成像系统的荧光成像灵敏度下限值可以从所述显微成像系统直接采集数据得到，当然也可以经由对所述显微成像系统的感光芯片、物镜、光源、曝光时间、成像算法等参数进行计算得到；

在确定所述目标荧光染料的体积时，可以通过反映体的体积来计算得到所述目标荧光染料的体积，例如，如果确定反映体的体积为Y，如反应体积为Y，当计算得到目标荧光染料的密度时，则目标荧光染料的体积介于：(A-B)/C*X*Y到(3A-B)/C*X*Y之间。

本申请上述实施例公开的方案中，为了能够更精确计算显微荧光图像中各个荧光点的荧光强度值，所述采用计算机图像识别技术提取目标样品的灰度值和像素值之前，还可以包括：

对显微荧光图像中每个检测目标的显微荧光图像区域进行边缘提取和分割，得到目标样品中的各个细胞的在显微荧光图像中所对应的显微荧光图像区域。

在本申请上述实施例公开的技术方案中，可以采用智能识别系统对目标样品进行荧光成像得到的显微荧光图像进行智能识别，通过对显微荧光图像中每个检测目标的显微荧光图像区域进行边缘提取和分割的方式得到每个检测目标的显微荧光图像区域，参见图2，其过程具体可以包括：

S201：对得到的显微荧光图像进行高斯平滑滤波；

在本步骤中，首先对显微荧光图像进行高斯平滑滤波，滤除显微荧光图像中的孤立噪声点，平滑图像边缘，以方便后续的边界的提取和确定；

S202：对平滑滤波后的显微荧光图像进行梯度边缘检测；

本步骤中，对滤波后的显微荧光图像进行梯度边缘的检测，主要是利用滤波后的显微荧光图像对应的灰度图像，计算出显微荧光图像的梯度特征，按照梯度边缘的强弱，从背景目标中分离出来待识别的前景目标区域；

S203：依据梯度边缘检测的检测结果对所述显微荧光图像进行荧光目标前景提取；

本步骤中，对荧光目标的前景检测区域进行目标进行提取，利用边缘的跟踪，把待识别的前景目标区域按照连通区域的属性逐一标记出来，记录边缘的位置；

S204：依据提取到的目标前景对所述显微荧光图像进行单个荧光区域的分割，得到每个检测目标的显微荧光图像区域；

步骤S203处理完成以后，必然会发现存在大量的交叠的检测目标，因此还需要对交叠的检测目标进行分离，本步骤可通过利用距离变换等一系列算法，对边缘进行标记，最终对单个检测目标进行分离得到每个检测目标的显微荧光图像区域。

在本申请另一实施例公开的技术方案中除了采用荧光成像系统采集到目标样品的显微荧光图像之外，还需要采集得到其明场图像，因此，上述步骤中，所述采用显微荧光成像系统对目标样品进行荧光成像得到显微荧光图像，具体为：采用显微荧光成像系统采集得到目标样品的显微荧光图像和明场图像，此时，参见图3，在对显微荧光图像进行高斯平滑滤波之前还可以包括：

步骤S301：通过明场识别技术对明场图像中的明场目标进行识别，并且对识别出的明场目标中的团块区域进行分离，得到明场图像中每个检测目标的位置信息以及尺寸信息；

具体的，本步骤中，针对明场拍摄的明场图像，从背景目标中分离出前景，具体的方法是对明场图像进行灰度化、亮度均一化、图像增强、二值化操作，从背景目标中提取出前景的检测目标图像；上述提取到的前景的检测目标图像会在大量的结团等情况，使得多个检测目标图像重叠在一起，必须对检测目标图像进行分离，获得单个的检测目标图像，求取单个检测目标图像的边缘，并且记录边缘信息；

步骤S302：将所述明场识别技术获取到的检测目标的位置信息以及尺寸信息与显微荧光图像中对应的区域进行对比，对显微荧光图像进行识别；判断所述显微荧光图像中对应明场图像检测到的各个检测目标的位置信息、尺寸信息的区域是否为空，如果否，执行步骤S303，如果是，执行步骤S304；

步骤S303：依据采用得到的明场图像识别技术检测到的每个检测目标的位置、尺寸信息在所述显微荧光图像中相对应的区域，由所述显微荧光图像中确定对应的每个检测目标的显微荧光图像区域；

步骤S304：如果所述显微荧光图像中对应明场图像中检测目标的位置、尺寸信息的区域为空，对所述显微荧光图像进行高斯平滑滤波并执行后续操作；

所述对显微荧光图像进行识别，具体为：针对拍摄的显微荧光图像，从背景目标中分离出荧光目标所在的区域，具体的方法是图像进行灰度化、亮度均一化、边缘增强以及图像的二值化操作，然后进行图像边缘的提取，把荧光目标所在的区域都标记存储下来；

所述明场识别具体为：是以明场图像中各个检测目标分割的区域(单个检测目标的边缘，并且记录边缘信息)为标记，利用明场图像技术的分割结果对显微荧光图像标进行分割，提取得到单个检测目标在显微荧光图像中的区域，也就是该处存在明场目标，那么在荧光目标中也标记出这个位置，使用明场目标一一对应进行荧光目标分离。

针对于上述方法，本申请还公开了一种免洗涤图像类流式荧光检测系统，所述方法与系统中的技术特征描述内容可以相互借鉴，参见图4，该系统包括：

染色系统100，其与步骤S101相对应，用于采用预设的目标荧光染料和染色方法对目标样品进行染色，确保染色孵育后形成一定的游离荧光染料，以使得目标样品中的所有细胞，包括经过洗涤后无法在电荷耦合元件下形成荧光成像的弱荧光阴性细胞，可在免洗涤图像类流式荧光检测系统下采集到可用于密度函数聚类分辨分析的荧光强度值；

显微成像系统200，其与步骤S102相对应，用于获取染色后的目标样品的显微荧光图像；

数据处理系统300，其与步骤S103-106相对应，用于采用计算机图像识别技术提取目标样品的灰度值和像素值；基于所述目标样品的灰度值和像素值计算所述目标样品的荧光强度值，并输出所述目标样品的显微荧光图像和密度函数聚类分析的结果；

所述数据处理系统内配置有聚类分析单元，聚类分析单元用于进行聚类分析，所述聚类分析单元内可以包括：荧光强度计算单元和/或子聚类分析单元，所述荧光强度计算单元，用于对所述显微荧光图像中各个荧光点的荧光强度值进行计算。所述子聚类分析单元，用于根据单通道或多通道对应的各个细胞显微荧光图像区域的荧光强度值的大小对细胞进行分类。

与上述方法步骤S201-202相对应，免洗涤图像类流式荧光检测系统，还可以包括：目标荧光染料浓度计算单元和目标荧光染料体积计算单元；

目标荧光染料浓度计算单元，用于判断是否满足条件3A>B+C*D>A，即(3A-B)/C>D>(A-B)/C，如果是，则确定需要添加的目标荧光染料的染料浓度范围为(A-B)/C*X到(3A-B)/C*X之间任意一浓度值；

其中，A为显微成像系统的荧光成像灵敏度下限值，B为目标样品中细胞自发荧光强度，C为单个细胞非特异吸附染料单位量，D为单位浓度染料发出的荧光强度。

目标荧光染料体积计算单元，用于确定反映体积Y，依据反映体积Y计算得到所需添加的目标荧光染料的体积，所述Y为目标样品反应物的体积。

与上述方法相对应，所述免洗涤图像类流式荧光检测系统，还可以包括：

目标提取单元，用于：对显微荧光图像中每个检测目标的显微荧光图像区域进行边缘提取和分割，得到目标样品中的各个细胞的显微荧光图像区域。

与步骤S201-204相对应目标提取单元的工作过程具体可以为：

对显微荧光图像进行高斯平滑滤波；

对平滑滤波后的显微荧光图像进行梯度边缘检测；

依据梯度边缘检测的检测结果对所述显微荧光图像进行荧光目标前景提取；

依据提取到的目标前景对所述显微荧光图像进行单个荧光区域的分割，得到每个细胞的显微荧光图像区域。

与步骤S301-304相对应目标提取单元的工作过程具体还可以为：

对目标样品的明场图像中的明场目标进行识别，并且对识别出的明场目标中的团块区域进行分离，得到明场图像中每个检测目标的位置、尺寸信息；

对显微荧光图像进行识别，判断所述显微荧光图像中对应明场图像中各个检测目标的位置、尺寸信息的区域是否为空，如果否，采用得到的明场图像中每个检测目标的位置、尺寸信息相对应的区域，由所述显微荧光图像中确定对应的每个检测目标的显微荧光图像区域；

如果所述显微荧光图像中对应明场图像中检测目标的位置、尺寸信息的区域为空，对显微荧光图像进行高斯平滑滤波；

对平滑滤波后的显微荧光图像进行梯度边缘检测；

依据梯度边缘检测的检测结果对所述显微荧光图像进行荧光目标前景提取；

依据提取到的目标前景对所述显微荧光图像进行单个荧光区域的分割，得到每个细胞的显微荧光图像区域。

综上，本申请实施例公开的免洗涤图像类流式荧光检测方法和系统具有以下优点：

①、免洗涤：现有荧光染料的染色方法，不管是专用于流式分析的荧光染料，还是专用于显微观察的荧光染料，为了剔除样品中游离荧光染料的干扰，都要求染色孵育后进行洗涤步骤后，再上样检测。

但本发明公开的技术方案正好利用游离荧光染料来在图像类流式仪器下作为背景荧光的物质基础，游离荧光染料不仅不能剔除，还需要通过配方和染色方法来保证样品中具有一定量的游离荧光染料，

从而保证被检测样品中所有的细胞均被染色。因此，加样后无需洗涤。这样的方法，彻底避免了因为洗涤步骤导致的以下弊端：

a步骤繁琐；

b成本高(需要增加离心机、离心管、枪头等耗材和人工)；

c难控制。离心洗涤可能导致细胞损伤、细胞与荧光染料链接脱离等不可控的风险。

②、相对于流式分析染料用于图像类流式分析，本发明使图像类流式分析的适应性提高、结果更准确。

用流式分析染料染色，进行图像类流式的分析，由于有部分低于荧光成像灵敏度下限的弱荧光的无法分辨，这会造成两个问题：

如果染色样品是强荧光，绝大部分染色细胞的荧光强度都在荧光成像灵敏度下限以上，这样采用图像类流式分析是可行的，分析结果与流式差异会很小。但如果染色样品是弱荧光，出现绝大部分染色细胞的荧光强度在荧光成像灵敏度下限附近或以下，这时进行图像类流式分析的结果会与实际值或流式的结果差异很大，导致该类型弱荧光的样本无法进行图像类流式分析。

本发明通过对游离荧光染料进行背景荧光成像，将强荧光细胞和弱荧光阴性细胞的荧光强度都提到荧光成像灵敏度下限以上进行成像，这样及解决了上述问题，使弱荧光的样品也可以进行图像类流式分析，这样大大扩展了图形类流式分析的适用面和适用性。

因此，如果仅仅用流式染料染色的方法进行图像类流式分析，在面对弱荧光的样品或实验，其结果普遍会与流式分析的结果有一定的差异，这个差异与显微荧光成像系统的灵敏度下限成正比(下限越低、差异越小)，与检测目标样品的荧光强弱成正比(样品荧光越弱，差异越大)。由于这两个因素的影响，导致图像类流式分析的结果与流式分析的结果存在非线性的、非稳定的差异。

通过本发明提供的检测方法，因为显微呈现系统的灵敏度与流式的光电倍增管灵敏度差异导致的这种差异性和不稳定性得到了解决，图像类流式分析的结果与流式分析的结果一致性和稳定性均大大提高。

为了描述的方便，描述以上系统时以功能分为各种模块分别描述。当然，在实施本申请时可以把各模块的功能在同一个或多个软件和/或硬件中实现。

本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统或系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述得比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。以上所描述的系统及系统实施例仅仅是示意性的，其中所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性劳动的情况下，即可以理解并实施。

专业人员还可以进一步意识到，结合本文中所公开的实施例描述的各示例的单元及算法步骤，能够以电子硬件、计算机软件或者二者的结合来实现，为了清楚地说明硬件和软件的可互换性，在上述说明中已经按照功能一般性地描述了各示例的组成及步骤。这些功能究竟以硬件还是软件方式来执行，取决于技术方案的特定应用和设计约束条件。专业技术人员可以对每个特定的应用来使用不同方法来实现所描述的功能，但是这种实现不应认为超出本发明的范围。

结合本文中所公开的实施例描述的方法或算法的步骤可以直接用硬件、处理器执行的软件模块，或者二者的结合来实施。软件模块可以置于随机存储器(RAM)、内存、只读存储器(ROM)、电可编程ROM、电可擦除可编程ROM、寄存器、硬盘、可移动磁盘、CD-ROM、或技术领域内所公知的任意其它形式的存储介质中。

还需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (12)

1.一种免洗涤图像类流式荧光检测方法，其特征在于，包括：

采用预设的目标荧光染料和染色方法对目标样品进行染色，确保染色孵育后形成一定的游离荧光染料，以使得目标样品中的所有细胞，包括经过洗涤后无法在电荷耦合元件下形成荧光成像的弱荧光阴性细胞，在图像类流式荧光检测系统下采集到用于密度函数聚类分辨分析的荧光强度值；

基于显微成像系统获取染色后的目标样品的显微荧光图像；

采用计算机图像识别技术提取目标样品的灰度值和像素值；

基于所述目标样品的灰度值和像素值计算所述目标样品的荧光强度值，并输出所述目标样品的显微荧光图像和密度函数聚类分析的结果；

采用预设的目标荧光染料对目标样品进行染色之前，还包括：

判断是否满足条件3A>B+C*D>A，即(3A-B)/C>D>(A-B)/C，如果是，则确定需要添加的目标荧光染料的染料浓度范围为(A-B)/C*X到(3A-B)/C*X之间任意一浓度值；

其中，A为显微成像系统的荧光成像灵敏度下限值，B为目标样品中细胞自发荧光强度，C为单个细胞非特异吸附染料单位量，D为单位浓度染料发出的荧光强度，X为反应体系中细胞的个数；

采用预设的目标荧光染料对目标样品进行染色之前，还包括：

确定反映体积Y，依据反映体积Y计算得到所需添加的目标荧光染料的体积，所述Y为目标样品反应物的体积。

2.根据权利要求1所述的免洗涤图像类流式荧光检测方法，其特征在于，所述采用计算机图像识别技术提取目标样品的灰度值和像素值之前，还包括：

对显微荧光图像中每个检测目标的显微荧光图像区域进行边缘提取和分割，得到目标样品中的各个细胞的显微荧光图像区域。

3.根据权利要求2所述的免洗涤图像类流式荧光检测方法，其特征在于，对显微荧光图像中每个检测目标的显微荧光图像区域进行边缘提取和分割，包括：

对显微荧光图像进行高斯平滑滤波；

对平滑滤波后的显微荧光图像进行梯度边缘检测；

依据梯度边缘检测的检测结果对所述显微荧光图像进行荧光目标前景提取；

依据提取到的目标前景对所述显微荧光图像进行单个荧光区域的分割，得到每个细胞的显微荧光图像区域。

4.根据权利要求3所述的免洗涤图像类流式荧光检测方法，其特征在于，

对显微荧光图像进行高斯平滑滤波之前还包括：

采用显微荧光成像系统采集得到目标样品的明场图像；

对明场图像中的明场目标进行识别，并且对识别出的明场目标中的团块区域进行分离，得到明场图像中每个检测目标的位置、尺寸信息；

对显微荧光图像进行识别，判断所述显微荧光图像中对应明场图像中各个检测目标的位置、尺寸信息的区域是否为空，如果否，采用得到的明场图像中每个检测目标的位置、尺寸信息相对应的区域，由所述显微荧光图像中确定对应的每个检测目标的显微荧光图像区域；

如果所述显微荧光图像中对应明场图像中检测目标的位置、尺寸信息的区域为空，对显微荧光图像进行高斯平滑滤波并执行后续操作。

5.根据权利要求1所述的免洗涤图像类流式荧光检测方法，其特征在于，对所述显微荧光图像进行聚类分析，包括：

对所述显微荧光图像中各个细胞的显微荧光图像区域内的荧光强度值进行计算。

6.根据权利要求5所述的免洗涤图像类流式荧光检测方法，其特征在于，对所述显微荧光图像进行聚类分析还包括：根据单通道或多通道对应的各个细胞显微荧光图像区域的荧光强度值的大小对细胞进行分类。

7.一种免洗涤图像类流式荧光检测系统，其特征在于，包括：

染色系统，用于采用预设的目标荧光染料和染色方法对目标样品进行染色，确保染色孵育后形成一定的游离荧光染料，以使得目标样品中的所有细胞，包括经过洗涤后无法在电荷耦合元件下形成荧光成像的弱荧光阴性细胞，可在免洗涤图像类流式荧光检测系统下采集到可用于密度函数聚类分辨分析的荧光强度值；

显微成像系统，用于获取染色后的目标样品的显微荧光图像；

数据处理系统，用于采用计算机图像识别技术提取目标样品的灰度值和像素值；基于所述目标样品的灰度值和像素值计算所述目标样品的荧光强度值，并输出所述目标样品的显微荧光图像和密度函数聚类分析的结果；

目标荧光染料浓度计算单元，用于判断是否满足条件3A>B+C*D>A，即(3A-B)/C>D>(A-B)/C，如果是，则确定需要添加的目标荧光染料的染料浓度范围为(A-B)/C*X到(3A-B)/C*X之间任意一浓度值；

其中，A为显微成像系统的荧光成像灵敏度下限值，B为目标样品中细胞自发荧光强度，C为单个细胞非特异吸附染料单位量，D为单位浓度染料发出的荧光强度；

目标荧光染料体积计算单元，用于确定反映体积Y，依据反映体积Y计算得到所需添加的目标荧光染料的体积，所述Y为目标样品反应物的体积。

8.根据权利要求7所述的免洗涤图像类流式荧光检测系统，其特征在于，还包括：

目标提取单元，用于：对显微荧光图像中每个检测目标的显微荧光图像区域进行边缘提取和分割，得到目标样品中的各个细胞的显微荧光图像区域。

9.根据权利要求8所述的免洗涤图像类流式荧光检测系统，其特征在于，目标提取单元具体用于：

对显微荧光图像进行高斯平滑滤波；

对平滑滤波后的显微荧光图像进行梯度边缘检测；

依据梯度边缘检测的检测结果对所述显微荧光图像进行荧光目标前景提取；

依据提取到的目标前景对所述显微荧光图像进行单个荧光区域的分割，得到每个细胞的显微荧光图像区域。

10.根据权利要求8所述的免洗涤图像类流式荧光检测系统，其特征在于，目标提取单元具体用于：

对目标样品的明场图像中的明场目标进行识别，并且对识别出的明场目标中的团块区域进行分离，得到明场图像中每个检测目标的位置、尺寸信息；

对显微荧光图像进行识别，判断所述显微荧光图像中对应明场图像中各个检测目标的位置、尺寸信息的区域是否为空，如果否，采用得到的明场图像中每个检测目标的位置、尺寸信息相对应的区域，由所述显微荧光图像中确定对应的每个检测目标的显微荧光图像区域；

如果所述显微荧光图像中对应明场图像中检测目标的位置、尺寸信息的区域为空，对显微荧光图像进行高斯平滑滤波；

对平滑滤波后的显微荧光图像进行梯度边缘检测；

依据梯度边缘检测的检测结果对所述显微荧光图像进行荧光目标前景提取；

依据提取到的目标前景对所述显微荧光图像进行单个荧光区域的分割，得到每个细胞的显微荧光图像区域。

11.根据权利要求7所述的免洗涤图像类流式荧光检测系统，其特征在于，所述数据处理系统内配置有聚类分析单元，所述聚类分析单元包括：

荧光强度计算单元，用于对所述显微荧光图像中各个荧光点的荧光强度值进行计算。

12.根据权利要求11所述的免洗涤图像类流式荧光检测系统，其特征在于，所述聚类分析单元，还包括：

子聚类分析单元，用于根据单通道或多通道对应的各个细胞显微荧光图像区域的荧光强度值的大小对细胞进行分类。

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