CN114693539A - 一种基于荧光图片的pcr数据处理与曲线拟合方法及pcr仪器 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法及PCR仪器，该方法包括以下步骤：获取图像数据，图像数据包括循环次数数据与图像灰度数据；基于公式(1)对图像数据进行拟合，得到拟合曲线。PCR仪器包括光学激发单元、PCR荧光采集单元、处理器及可读存储介质，其中，PCR荧光采集单元用于采集来自样品的荧光信号并生成图片，处理器与光学激发单元、PCR荧光采集单元及可读存储介质均相连，可读存储介质中存储有可在处理器上运行的计算机程序，处理器在执行计算机程序时实现上述方法。本发明采用公式(1)对图像数据进行拟合，得到拟合曲线，其应用了PCR的指数扩增原理，具有结果判断更准确、灵敏度更高、检测稳定性更强、不易受外界干扰等特点。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，涉及一种基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法及PCR仪器。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。其中，Ct值(Cycle threshold，循环阈值)是指每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
PCR仪器通常包括光学激发单元及荧光采集单元，在PCR反应进行过程中，光学激发单元产生激发光，并通过LED透镜直接照射样品，样品被激发后产生的荧光信号通过滤光片和透镜抵达荧光采集单元(例如CCD摄像机)，并被抓取图像，软件处理图像得到PCR曲线数据，通过拟合算法处理，形成PCR曲线。采用不同的拟合算法，呈现的PCR曲线也不相同。
因此，如何提供一种基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法及PCR仪器，以使得PCR反应结果判断灵敏度更高、稳定性更强、不易受外界干扰、阴阳性结果判定更迅速，成为本领域技术人员亟待解决的一个重要技术问题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法及PCR仪器，用于解决现有技术中PCR反应结果判断耗时、抗外界干扰能力差、以及灵敏度低的缺点。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法，包括以下步骤：
获取图像数据，所述图像数据包括循环次数数据与图像灰度数据；
基于公式(1)对所述图像数据进行拟合，得到拟合曲线；
其中，y为灰度值，x为循环次数，y0为最小灰度值，a为最大灰度值，x0为起峰点对应的循环次数，b为预设斜率值。
可选地，所述图像数据的获得包括对原始数据进行曲线噪声去除处理。
可选地，所述原始数据的获得包括以下步骤：
在PCR反应的每个循环中采集多张图片；
对所述图片对应于PCR反应腔的有效区域进行识别以提取出对应于PCR反应腔的有效区域的图片或像素值；
对提取出的对应于PCR反应腔的有效区域的图片或像素值求取像素灰度平均值；
对每个循环的多张所述图片的所述像素灰度平均值进一步求平均值。
可选地，在进行所述识别之前，对采集的图片进行图像去噪声处理。
可选地，所述图像去噪声处理采用的方法包括算术均值滤波、高斯滤波、中值滤波、双边滤波及BM3D算法滤波中的一种或多种。
可选地，对所述图片对应于PCR反应腔的区域进行识别的方法包括图像匹配算法、局部区域机器学习聚类算法中的一种或两种。
可选地，所述曲线噪声去除处理采用的方法包括临近平均值法、FFT滤波器法、低通滤波器法及Savitzky-Golay平滑滤噪法中的一种或多种。
可选地，所述临近平均值法包括6点平滑处理、3点平滑处理及5点平滑处理中的一种。
可选地，所述图像数据的获得还包括对进行所述曲线噪声去除处理后的数据进行线性矫正。
可选地，所述线性矫正包括逆gamma矫正。
可选地，所述预设斜率值的获得包括以下步骤：
获取多组试验图像数据；
基于公式(2)分别对多组所述试验图像数据进行拟合，并采用最小二乘法求解出待定斜率值，其中，b0为待定斜率值；
对基于多组所述试验图像数据求解出的多个待定斜率值求平均值，作为所述预设斜率值。
可选地，基于至少50组所述试验图像数据得到所述预设斜率值。
本发明还提供一种PCR仪器，包括：
光学激发单元，用于出射激发光于样品表面；
PCR荧光采集单元，用于采集来自所述样品的荧光信号并生成图片；
处理器，与所述光学激发单元及所述PCR荧光采集单元相连；
可读存储介质，与所述处理器相连，所述可读存储介质中存储有可在所述处理器上运行的计算机程序，所述处理器在执行所述计算机程序时实现如上任意一项所述的基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法。
可选地，所述光学激发单元包括蓝光LED组件及黄光LED组件。
可选地，所述蓝光的波长范围是450nm-490nm，所述黄光的波长范围是555nm-585nm。
如上所述，本发明的基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法及PCR仪器采用公式(1)对图像数据进行拟合，得到拟合曲线，其应用了PCR的指数扩增原理，具有结果判断更准确、灵敏度更高、检测稳定性更强、不易受外界干扰等特点。
附图说明
图1显示为实施例一中所述基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法的一种流程图。
图2显示为一种处理前的原始数据曲线图。
图3显示为通过本发明的基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法处理之后得到的PCR曲线图。
图4显示为图2与图3的曲线合并后的示意图。
图5显示为本发明的PCR仪器的结构框图。
元件标号说明
1 光学激发单元
2 PCR荧光采集单元
3 处理器
4 可读存储介质
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
请参阅图1至图5。需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。
实施例一
本实施例中提供一种基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法，包括以下步骤：
S1：获取图像数据，所述图像数据包括循环次数数据与图像灰度数据；
S2：基于公式(1)对所述图像数据进行拟合，得到拟合曲线；
其中，y为灰度值，x为循环次数，y0为最小灰度值，a为最大灰度值，x0为起峰点对应的循环次数，b为预设斜率值。
具体的，所述图像数据可以是原始数据，也可以是在原始数据的基础上经过一些算法处理之后得到。
作为示例，所述原始数据的获得可包括以下步骤：
A)、在PCR反应的每个循环中采集多张图片，例如2-3张图片。
B)、对所采集的荧光图片进行光场矫正与图像去噪声处理。
作为示例，所述图像去噪声处理采用的方法包括但不限于算术均值滤波、高斯滤波、中值滤波、双边滤波及BM3D算法滤波中的一种或多种。
C)、对所述图片对应于PCR反应腔的有效区域进行识别以提取出对应于PCR反应腔的有效区域的图片或像素值；
作为示例，对所述图片对应于PCR反应腔的区域进行识别的方法包括但不限于图像匹配算法、局部区域机器学习聚类算法中的一种或两种。
D)、对上一步提取出的对应于PCR反应腔的有效区域的图片或像素值求取像素灰度平均值；
E)、对每个循环的多张所述图片的所述像素灰度平均值进一步求平均值。
需要指出的是，上述获得原始数据的方法中，各步骤中的参数可根据需要进行调整，例如采集图片的数量可以更多，部分图片可舍弃不用等，此处不应过分限制本发明的保护范围。
作为示例，所述图像数据的获得包括对原始数据进行曲线噪声去除处理。
作为示例，基于电路、相机、灯源的稳定性等因素，所述曲线噪声去除处理可选用临近平均值法(如6点平滑处理、3点平滑处理、5点平滑处理等)、FFT滤波器法、低通滤波器法、及Savitzky-Golay平滑滤噪法中的一种或多种组合。本实施例中以6点平滑处理为例，可简单理解为每一点变为其相邻6个点的平均值。
作为示例，所述图像数据的获得还包括对进行所述曲线噪声去除处理后的数据进行线性矫正，其中，影响线性的因素有多种，例如相机的gamma处理是其中一种。本实施例中，所述线性矫正包括逆gamma矫正，用以矫正相机的非线性响应，可看作相机校准。
作为示例，所述最小灰度值y0、所述最大灰度值a及所述起峰点对应的循环次数x0可由平滑处理后的数据中得出。其中，起峰点的确定过程如下：对于平滑处理后的曲线(点图)，逐个比较后一点的灰度值与前一点的灰度值的大小，超过预设范围即可认定为是起峰点。本实施例中，所述起峰点对应的循环次数x0为整数，因为实际操作实验都是整数。
具体的，相对于所述最小灰度值y0、所述最大灰度值a及所述起峰点对应的循环次数x0为动态的参数，所述预设斜率值b为定值。所述预设斜率值b的物理意义是曲线爬升期的斜率，其作为初始评估值，是基于大量的试验原始数据优化得出的，其中，针对同一类测试，需要先分析试验原始数据，得到这个值的大概情况，然后预设好写进程序算法里。对于不同类型的测试，预设斜率值b的数值会有所不同，例如针对一种核酸的检测，所述预设斜率值b可以取值2.5，针对另一种核酸的检测，所述预设斜率值b可以取值为4.5。
作为示例，所述预设斜率值b的获得包括以下步骤：
I、获取多组试验图像数据；
II、基于公式(2)分别对多组所述试验图像数据进行拟合，并采用最小二乘法求解出待定斜率值，其中，b0为待定斜率值；
III、对基于多组所述试验图像数据求解出的多个待定斜率值求平均值，作为所述预设斜率值。
作为示例，基于至少50组所述试验图像数据得到所述预设斜率值。本实施例中，基于100组试验图像数据得到预设斜率值b为2.5，也就是说，拟合了100次后，发现b总在2.5左右，因此将初始评估值定在2.5。
作为示例，请参阅图1，显示为本实施例中所述PCR曲线拟合方法的一种流程图，其基于原始数据依次进行去噪处理、相机线性矫正，并在动态计算得到最小灰度值y0、最大灰度值a及起峰点对应的循环次数x0之后，基于所述公式(1)进行曲线拟合，得到PCR曲线，其中，原始数据的获得包括依次进行如下流程：荧光图片采集、图像去噪声处理、有效区域识别、求取像素灰度平均值、每个循环的多张图片的像素灰度平均值进一步求平均值。
作为示例，在线性矫正步骤之后，可包括根据临界值范围计算标准差(StandardDeviation，简称SD)的步骤。虽然计算标准差与PCR曲线拟合不直接相关，但可用于后续PCR阈值计算，以求取PCR反应的CT值，即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
请参阅图2至图4，其中，图2显示为一种处理前的原始数据曲线图，图3显示为通过本发明的PCR曲线拟合方法处理之后得到的PCR曲线图，图4显示为图2与图3的曲线合并后的示意图。可见，本发明拟合得到的PCR曲线能够与实际结果相符，具有更强的检测稳定性不易受外界干扰。
实施例二
本实施例中提供一种PCR仪器，请参阅图5，显示为该PCR仪器的结构框图，包括光学激发单元1、PCR荧光采集单元2、处理器3及可读存储介质4，其中，所述光学激发单元1用于出射激发光于样品表面，所述PCR荧光采集单元2用于采集来自所述样品的荧光信号并生成图片，所述处理器3与所述光学激发单元1及所述PCR荧光采集单元2相连，所述可读存储介质4与所述处理器3相连，所述可读存储介质4中存储有可在所述处理器3上运行的计算机程序，所述处理器3在执行所述计算机程序时实现如实施例一中所述的基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法。
作为示例，所述光学激发单元1包括蓝光LED组件及黄光LED组件，所述蓝光LED组件包括蓝光LED灯及设于所述蓝光LED灯出光面前方的蓝光准直部件，所述黄光LED组件包括黄光LED灯及设于所述黄光LED灯出光面前方的黄光准直部件，所述蓝光准直部件及所述黄光准直部件可采用准直透镜、反光杯等，所述蓝光准直部件及所述黄光准直部件前方可均设有滤波片。
作为示例，所述蓝光的波长范围是450nm-490nm，所述黄光的波长范围是555nm-585nm。
作为示例，所述PCR荧光采集单元2包括但不限于CCD(Charge Coupled Device，电荷耦合器件)相机、CMOS相机、光电倍增管及雪崩光电二极管(英文全称Avalanche PhotoDiode，简称APD)，其中，所述光电倍增管可以是硅光电倍增管(英文全称Siliconphotomultiplier，简称SiPM)。
作为示例，所述PCR仪器还可包括显示器，所述显示器与所述处理器3相连，用于显示荧光图像数据、PCR曲线等，并可显示操作界面。
综上所述，本发明的基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法及PCR仪器采用公式(1)对图像数据进行拟合，得到拟合曲线，其应用了PCR的指数扩增原理，具有结果判断更准确、灵敏度更高、检测稳定性更强、不易受外界干扰等特点。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (15)
1.一种基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取图像数据，所述图像数据包括循环次数数据与图像灰度数据；
基于公式(1)对所述图像数据进行拟合，得到拟合曲线；
其中，y为灰度值，x为循环次数，y0为最小灰度值，a为最大灰度值，x0为起峰点对应的循环次数，b为预设斜率值。
2.根据权利要求1所述的基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法，其特征在于：所述图像数据的获得包括对原始数据进行曲线噪声去除处理。
3.根据权利要求2所述的基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法，其特征在于，所述原始数据的获得包括以下步骤：
在PCR反应的每个循环中采集多张图片；
对所述图片对应于PCR反应腔的有效区域进行识别以提取出对应于PCR反应腔的有效区域的图片或像素值；
对提取出的对应于PCR反应腔的有效区域的图片或像素值求取像素灰度平均值；
对每个循环的多张所述图片的所述像素灰度平均值进一步求平均值。
4.根据权利要求3所述的基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法，其特征在于：在进行所述识别之前，对采集的图片进行图像去噪声处理。
5.根据权利要求4所述的基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法，其特征在于：所述图像去噪声处理采用的方法包括算术均值滤波、高斯滤波、中值滤波、双边滤波及BM3D算法滤波中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述的基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法，其特征在于：对所述图片对应于PCR反应腔的区域进行识别的方法包括图像匹配算法、局部区域机器学习聚类算法中的一种或两种。
7.根据权利要求3所述的基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法，其特征在于：所述曲线噪声去除处理采用的方法包括临近平均值法、FFT滤波器法、低通滤波器法及Savitzky-Golay平滑滤噪法中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法，其特征在于：所述临近平均值法包括6点平滑处理、3点平滑处理及5点平滑处理中的一种。
9.根据权利要求2所述的基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法，其特征在于：所述图像数据的获得还包括对进行所述曲线噪声去除处理后的数据进行线性矫正。
10.根据权利要求9所述的基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法，其特征在于：所述线性矫正包括逆gamma矫正。
11.根据权利要求1所述的基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法，其特征在于，所述预设斜率值的获得包括以下步骤：
获取多组试验图像数据；
基于公式(2)分别对多组所述试验图像数据进行拟合，并采用最小二乘法求解出待定斜率值，其中，b0为待定斜率值；
对基于多组所述试验图像数据求解出的多个待定斜率值求平均值，作为所述预设斜率值。
12.根据权利要求11所述的基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法，其特征在于：基于至少50组所述试验图像数据得到所述预设斜率值。
13.一种PCR仪器，其特征在于，包括：
光学激发单元，用于出射激发光于样品表面；
PCR荧光采集单元，用于采集来自所述样品的荧光信号并生成图片；
处理器，与所述光学激发单元及所述PCR荧光采集单元相连；
可读存储介质，与所述处理器相连，所述可读存储介质中存储有可在所述处理器上运行的计算机程序，所述处理器在执行所述计算机程序时实现如权利要求1-8任意一项所述的基于荧光图片的PCR数据处理与曲线拟合方法。
14.根据权利要求13所述的PCR仪器，其特征在于：所述光学激发单元包括蓝光LED组件及黄光LED组件。
15.根据权利要求13所述的PCR仪器，其特征在于：所述蓝光的波长范围是450nm-490nm；所述黄光的波长范围是555nm-585nm。
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2020
- 2020-12-31 CN CN202011633931.7A patent/CN114693539A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116705163A (zh) * | 2023-05-31 | 2023-09-05 | 扬州市疾病预防控制中心 | 一种实时荧光pcr数据管理系统 |
| CN116705163B (zh) * | 2023-05-31 | 2024-01-26 | 扬州市疾病预防控制中心 | 一种实时荧光pcr数据管理系统 |
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