CN112790189B - 一种器官灌注及保存溶液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种器官灌注及保存溶液及其应用，灌注及保存溶液以超支化聚甘油作为渗透压调节剂，以对乙酰氨基酚和伊拉米肽作为抗氧化剂，且不含羟乙基淀粉。本发明所述灌注及保存溶液通过同时添加超支化聚甘油、对乙酰氨基酚和伊拉米肽，不仅有效提高了流动性、抗氧化性，且能够对缺血再灌注损伤中的线粒体进行保护，具有延长器官保存、运输时间，提升器官质量的优点。

Description

一种器官灌注及保存溶液及其应用

技术领域

本发明涉及器官移植技术领域，具体涉及一种器官灌注及保存溶液及其应用。

背景技术

目前，移植是针对于器官衰竭的首选治疗方式。研究表明，供器官获取、保存及移植后缺血-再灌注损伤是影响移植预后的重要因素。所以，研发改进器官保护液十分重要。目前市面上已有多种器官保存液，如Collins液、威斯康星大学保存液(University ofWisconsin solution，UW液)、组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐液(histidine-tryptophan-ketoglutarate solution，HTK液)等。这些器官保存液促进了器官静态冷保存技术的迅速发展，使器官保存在一定程度上摆脱了时间和地域的限制。静态冷保存技术仍是器官保护中最常使用的技术，为全球大多数器官移植中心所广泛应用。但是，由于死亡捐献已成为我国器官移植供器官的主要来源，捐献器官本身可能存在功能受损以及较长时间的热缺血、冷缺血，导致损伤更为严重，明显影响移植预后。因此，如何改善供器官的质量显得尤为重要。近年来，新兴的机械灌注再次应用于器官保存与修复领域，使某些过去认为不可利用的器官得以重新利用，并取得了良好的临床效果。机械灌注中灌注液的研究是机械灌注研究中的核心环节之一，所以开发有效针对机械灌注器官保存液十分关键。

目前机械灌注液主要包括以下几种：

1.KPS-1：

其是目前公认的标准肾脏机械灌注液。与UW类似，KPS-1增加了葡萄糖、甘露醇、核糖及HEPES缓冲液，减少了棉子糖、乳糖醛酸盐及硫酸盐，用腺嘌呤代替了UW液中的腺苷。与UW液一样使用5％羟乙基淀粉维持渗透压，通过别嘌醇及谷胱甘肽对抗氧自由基，通过磷酸盐抑制组织酸中毒。

2.HTK液:

HTK液即custodiol液，基本组成为组氨酸、色氨酸及酮戊二酸。组氨酸作为缓冲对，色氨酸及酮戊二酸能促进缺血/再灌注期间三磷酸腺苷的产生，保护细胞的完整性，减轻细胞水肿。HTK液还具有粘滞度低，可以快速均匀灌注器官的优点。HTK液因为低钾可以减少钙超载造成的细胞损伤。甘露醇可以有效减少细胞水肿的风险，谷胱甘肽清除氧自由基。

3.IGL-1液：

IGL-1利用聚乙二醇代替UW液中的羟乙基淀粉。聚乙二醇能黏附到细胞和组织表面，起到免疫伪装的作用，从而改变供体器官的免疫原性，能起到一定减轻移植后排斥反应的作用。

4.Celsior液：

Celsior液以乳糖醛酸作为渗透压成分，但使用组氨酸缓冲系统。Celsior液其他重要成分还包括甘露醇、谷胱甘肽和谷氨酸。Celsior液是高钠低钾的细胞外液型保存液，其低钾限制电压依赖性钙通道的开放，从而限制钙离子进入细胞内。高钠限制钙内流，避免平滑肌细胞膜的去极化。Celsior液不含胶体成分，黏滞度低，具有快速均匀灌注的优点。

5.HCA-Ⅱ液：

HCA-Ⅱ主要特点为:(1)离子浓度为细胞内液型(高钾低钠)；(2)以10:1的组氨酸/组氨酸盐酸替代甘露醇；(3)加入右旋糖酐40(DEX-40)，黏稠度低于羟乙基淀粉；(4)加入具有清除氧自由基作用的川芎嗪，同时具有抗血小板聚集及扩张小动脉改善微循环的作用。

然而，现有技术中这些机械灌注液体仍存在以下技术缺陷，如：(1)粘滞系数仍普遍高，尤其在低温时流动性较差，灌注时阻力大，不能对肾微血管进行很好灌注；(2)抗移植物损伤(缺血再灌注损伤)能力仍较差，器官保存时间受限制；(3)溶液中某些成分对移植物有一定损伤作用，如入羟乙基淀粉作为胶体可能引起凝血障碍、急性肾损伤等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种器官灌注及保存溶液，以解决现有机械灌注液流动性较差、易导致器官损伤的问题，具有延长器官保存、运输时间，提升器官质量的优点。

本发明通过下述技术方案实现：

一种器官灌注及保存溶液，灌注及保存溶液以超支化聚甘油作为渗透压调节剂，以对乙酰氨基酚和伊拉米肽作为抗氧化剂，且不含羟乙基淀粉。

本发明所述伊拉米肽为elamipeptide/SS-31，elamipeptide/ss-31是由StealthBioTherapeutics公司合成的一种蛋白，用于治疗线粒体疾病。

在本发明所述的灌注及保存溶液中，采用超支化聚甘油成分作为调节渗透压的物质，相较于传统调节渗透压的5％羟乙基淀粉在低温时流动性更好，粘性低，能在低温机械灌注时保持很好的灌注度，且能将移植物内血液清理干净，利于移植物存活。

在本发明所述的灌注及保存溶液中，加入了抗氧化效果更好的对乙酰氨基酚和伊拉米肽，不仅相较于传统机械灌注液中抗氧化性更好，能显著保护移植物功能，且伊拉米肽对移植物细胞中线粒体功能保护，提升移植物在保存中的质量，使得本发明所述灌注及保存溶液对缺血再灌注损伤中的线粒体进行保护，更有效的抑制了移植物损伤，保护移植物活性。

综上，本发明所述灌注及保存溶液通过同时添加超支化聚甘油、对乙酰氨基酚和伊拉米肽，不仅有效提高了流动性、抗氧化性，且能够对缺血再灌注损伤中的线粒体进行保护，具有延长器官保存、运输时间，提升器官质量的优点。

进一步地，以1L溶液计，灌注及保存溶液中含有对乙酰氨基酚4-6mM、伊拉米肽5mM，所述超支化聚甘油的用量为将灌注及保存溶液的渗透压至调节310mOsm/L。

进一步地，包括以下组分：

乳糖醛酸、磷酸二氢钾、腺嘌呤、还原型谷胱甘肽、对乙酰氨基酚、伊拉米肽、别嘌呤醇、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸镁、磷酸钾、地塞米松和超支化聚甘油。

本发明所述灌注及保存溶液中，以乳糖醛酸、磷酸二氢钾作为缓冲对；以腺嘌呤、还原型谷胱甘肽、对乙酰氨基酚、伊拉米肽、别嘌呤醇实现清除氧自由基、抗氧化、抗线粒体功能失常；以葡萄糖酸钠、葡萄糖酸镁和磷酸钾模拟细胞外环境，所述地塞米松具有抗炎、抗水肿的作用，以超支化聚甘油调节渗透压。

本发明通过将上述各个组分进行组合，不仅有效提高了流动性、抗氧化性，且能够对缺血再灌注损伤中的线粒体进行保护，具有延长器官保存、运输时间，提升器官质量的优点。

进一步地，以1L溶液计，灌注及保存溶液包括以下组分：

乳糖醛酸95-105mM、磷酸二氢钾24-26mM、腺嘌呤4-6mM、还原型谷胱甘肽4-6mM、对乙酰氨基酚4-6mM、伊拉米肽5mM、别嘌呤醇0.5-1.5mM、葡萄糖酸钠75-85mM、葡萄糖酸镁4-6mM、磷酸钾20-25mM、地塞米松16mg/L和超支化聚甘油，所述超支化聚甘油的用量为将灌注及保存溶液的渗透压至调节310mOsm/L。

进一步地，由以下组分组成：

乳糖醛酸、磷酸二氢钾、腺嘌呤、还原型谷胱甘肽、对乙酰氨基酚、伊拉米肽、别嘌呤醇、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸镁、磷酸钾、地塞米松、超支化聚甘油和注射用水。

进一步地，以1L溶液计，灌注及保存溶液由以下组分组成：

乳糖醛酸95-105mM、磷酸二氢钾24-26mM、腺嘌呤4-6mM、还原型谷胱甘肽4-6mM、对乙酰氨基酚4-6mM、伊拉米肽5mM、别嘌呤醇0.5-1.5mM、葡萄糖酸钠75-85mM、葡萄糖酸镁4-6mM、磷酸钾20-25mM、地塞米松16mg/L、超支化聚甘油和注射用水，所述超支化聚甘油的用量为将灌注及保存溶液的渗透压至调节310mOsm/L。

进一步地，灌注及保存溶液的pH值为7.15±0.10。

一种器官灌注及保存溶液的应用，将灌注及保存溶液用于器官移植。

进一步地，将灌注及保存溶液用于器官保存和器官灌注。

进一步地，将灌注及保存溶液用于肾脏灌注。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明采用超支化聚甘油成分作为调节渗透压的物质，相较于传统调节渗透压的5％羟乙基淀粉在低温时流动性更好，粘性低，能在低温机械灌注时保持很好的灌注度，且能将移植物内血液清理干净，利于移植物存活。

2、本发明相较于传统机械灌注液中抗氧化性好，加入更为有效的对乙酰氨基酚和伊拉米肽，对缺血再灌注损伤中的线粒体进行保护，更有效的抑制了移植物损伤，保护移植物活性。

3、本发明去除了原溶液中对移植物损伤的5％羟乙基淀粉等物质，减轻移植物在保存和运输中损伤。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为不同器官保存液保存HepG-2细胞，0天、1天、2天、3天后上清液中乳酸脱氢酶含量对比图；

图2为不同器官保存液保存HepG-2细胞，0天、1天、2天、3天后Trypan Blue染色看细胞存活对比图；

图3为不同器官保存液保存HepG-2细胞，0天、1天、2天、3天后流式细胞学看细胞坏死和凋亡对比图；

图4为不同器官灌注液灌注猪肾脏灌注速度差异对比图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1：

一种器官灌注及保存溶液，以1L溶液计，灌注及保存溶液由以下组分组成：

乳糖醛酸95mM、磷酸二氢钾24mM、腺嘌呤4mM、还原型谷胱甘肽4mM、对乙酰氨基酚4mM、伊拉米肽5mM、别嘌呤醇0.5mM、葡萄糖酸钠75mM、葡萄糖酸镁4mM、磷酸钾20mM、地塞米松16mg/L、超支化聚甘油和注射用水，所述超支化聚甘油的用量为将灌注及保存溶液的渗透压至调节310mOsm/L，灌注及保存溶液的pH值利用盐酸/氢氧化钠调节为7.15±0.10。

本实施例所述灌注及保存溶液的制备过程如下：

依次将所有成分加入一定量的注射用水中，并利用盐酸/氢氧化钠调节其酸碱度与渗透压，其中，pH值为7.15±0.10，渗透压至调节至310mOsm/L，用注射用水定容至1L。

实施例2：

一种器官灌注及保存溶液，以1L溶液计，灌注及保存溶液由以下组分组成：

乳糖醛酸105mM、磷酸二氢钾26mM、腺嘌呤6mM、还原型谷胱甘肽6mM、对乙酰氨基酚6mM、伊拉米肽5mM、别嘌呤醇1.5mM、葡萄糖酸钠85mM、葡萄糖酸镁-6mM、磷酸钾25mM、地塞米松16mg/L、超支化聚甘油和注射用水，所述超支化聚甘油的用量为将灌注及保存溶液的渗透压至调节310mOsm/L，灌注及保存溶液的pH值为7.15±0.10。

实施例3：

一种器官灌注及保存溶液，以1L溶液计，灌注及保存溶液由以下组分组成：

乳糖醛酸100mM、磷酸二氢钾25mM、腺嘌呤5mM、还原型谷胱甘肽5mM、对乙酰氨基酚5mM、伊拉米肽5mM、别嘌呤醇1.0mM、葡萄糖酸钠80mM、葡萄糖酸镁5mM、磷酸钾20mM、地塞米松16mg/L、超支化聚甘油和注射用水，所述超支化聚甘油的用量为将灌注及保存溶液的渗透压至调节310mOsm/L，灌注及保存溶液的pH值为7.15±0.10。

对比例1：

本对比例以KPS-1保存液作为对照，具体地：

氯化钙0.5mM；4-羟乙基哌嗪乙磺酸10mM；磷酸钾25mM；甘露醇30mM；葡萄糖10mM；葡萄糖酸钠80mM；葡萄糖酸镁5mM；半镁盐核糖5mM；羟乙基淀粉50g/L；谷胱甘肽3mM；腺嘌呤5mM；注射用水定容至1L。

本对比例以CN 112056307 A中的实施例1的保存液作为对照，具体地：

一种脐带保存液，以1L保存溶液计，包括：超支化聚甘油18mmol，乳糖醛酸100mmol，磷酸二氢钾25mmol，硫酸镁5mmol，腺苷5mmol，谷胱甘肽还原型3mmol，地塞米松8mg，别嘌呤醇1mmol，蔗糖60mmol，右旋糖酐-40 50g，异博定20mg，氢氧化钠(50mmol/L)5ml和氢氧化钾(50mmol/L)20ml。

本对比例中的保存液pH约为7.45，渗透压约为310mOSM/L。

对比例2：

本对比例以HPG器官保存液作为对照，具体地：

HPG器官保存液：乳糖醛酸100mM；氢氧化钾100mM；磷酸二氢钾25mM；硫酸镁5mM；腺苷5mM；谷胱甘肽3mM；别嘌呤醇1mM；超支化聚甘油30g/L(调节渗透压至320mOsm/L)；盐酸/氢氧化钠调节pH值为7.4。

实验一：

用HepG-2细胞作为实验细胞，将等量细胞放入5ml生理盐(saline)水、5ml KPS-1溶液(对比例1)、5mlHPG器官保存液(对比例2)和5ml实施例3(New perfusion solution)保存液中，在0天、1天、2天、3天取其上清液，进行乳酸脱氢酶检测、流式细胞学检测、细胞活性测试，测试结果分别如1-图3所示。其中，乳酸脱氢酶检测计算存活细胞方式为：(LDH-背景)/LDH释放总量。

实验二：

采用猪肾脏作为实验器官，在4摄氏度状况下，对肾脏进行灌注。灌注液为KPS-1溶液(对比例1)、HPG器官保存液(对比例2)和实施例3保存液。计算灌注速率。在静态冷保存1天后对肾脏器官进行组织切片，判定损伤情况。

结果如图4所示，相较于KPS-1与HPG溶液，本发明保存液在1天、2天以及3天细胞保存与KPS-1器官灌注液与HPG器官保存液上有着更好的抗损伤优势，在流动性上优势显著。

肾脏灌注后组织病理学评分如表1所示：

表1

	KPS-1	HPG	New perfusion solution
				小管扩张	3±0.5	3±0.4	3±0.3
上皮扁平化	2±0.55	2±0.3	2±0.1
				上皮碎裂	1±0.1	1±0.1	1±0.1
小管碎片	0±0.5	0±0.3	0±0.3
				小管空泡化	0±0.7	0±0.7	0±0.6
组织内红细胞	2±0.55	1±0.55	1±0.55
				肾小球萎缩	1±0.5	1±0.4	1±0.2

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种器官灌注及保存溶液，其特征在于，灌注及保存溶液以超支化聚甘油作为渗透压调节剂，以对乙酰氨基酚和伊拉米肽作为抗氧化剂，且不含羟乙基淀粉；

以1L溶液计，灌注及保存溶液由以下组分组成：

乳糖醛酸95-105mM、磷酸二氢钾24-26mM、腺嘌呤4-6mM、还原型谷胱甘肽4-6mM、对乙酰氨基酚4-6mM、伊拉米肽5mM、别嘌呤醇0.5-1.5mM、葡萄糖酸钠75-85mM、葡萄糖酸镁4-6mM、磷酸钾20-25mM、地塞米松16mg/L、超支化聚甘油和注射用水，所述超支化聚甘油的用量为将灌注及保存溶液的渗透压至调节310mOsm/L。

2.根据权利要求1所述的一种器官灌注及保存溶液，其特征在于，灌注及保存溶液的pH值为7.15±0.10。

3.如权利要求1-2任一项所述的一种器官灌注及保存溶液的应用，其特征在于，将灌注及保存溶液用于器官移植。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将灌注及保存溶液用于器官保存和器官灌注。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将灌注及保存溶液用于肾脏灌注。

Images