CN112778247A - 一种精氨酸抗坏血酸酯及制备方法及其在慢性创伤修复中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种精氨酸抗坏血酸酯及制备方法及其在慢性创伤修复中的应用。该精氨酸抗坏血酸酯的结构式如式(I)所示，其制备方法包括如下步骤：将精氨酸、抗坏血酸和甲苯磺酸一水合物加入到溶剂中，加热至110±5℃进行酯化反应，制得精氨酸抗坏血酸酯。本发明制得的精氨酸抗坏血酸酯保留了精氨酸和抗坏血酸的活性基团，分子中以酯键的形式键合，酯键可被酶水解，从而具有精氨酸和抗坏血酸的双重作用，可以改善细胞内环境，在创伤部位协同发挥作用，对皮肤切口创面修复尤其是慢性创伤修复具有显著作用。

Description

一种精氨酸抗坏血酸酯及制备方法及其在慢性创伤修复中的 应用

技术领域

本发明属于生物活性分子和生物医药技术领域，特别涉及一种精氨酸抗坏血酸酯及制备方法及其在慢性创伤修复中的应用。

背景技术

人体物理性及化学性创伤是临床治疗上最常见的病例之一。对于正常的切伤或烧伤伤口，其愈合过程需要经历四个阶段，分别是止血阶段、炎症反应、增殖阶段和组织重塑。在伤口的深度和面积在可正常恢复的范围内并且是在正常的生理环境时，在愈合过程中，一般在一个月内完成这四个阶段并且恢复原来的生理功能。然而，尽管正常的伤口已经对患者的依从性和经济带来了巨大的挑战和损失，对于恶化的慢性伤口而言，更可能会使治疗过程更加复杂并且恢复时间延长。其中，随着社会和经济的发展，导致了饮食结构的改变，尤其是高油高糖的饮食致使糖尿病发病率的提高。2010年，全球约有2.3亿人患有糖尿病。预计2025年全球糖尿病患者人数将增至3.33亿人，2030年将增至4.3亿人。从而引起的糖尿病伤口，例如糖尿病足以及外伤，是一种典型的慢性创伤伤口。

此类慢性伤口与正常伤口最大的不同是糖分高，从而导致在伤口处的代谢产生更多的活性氧自由基(ROS)。这种情况下，高血糖、高ROS会导致创伤部位分泌更多促炎因子以及对基质金属蛋白酶的损伤，过量的ROS可直接或间接(通过蛋白水解激活)修饰和/或降解ECM蛋白，并导致真皮成纤维细胞和角质形成细胞功能受损。而且此时的组织微环境还会引起细菌的定植，从而严重延长炎症的进程，增加了临床截肢的风险。目前，在抗氧化层面上，已发现多种生物材料以及生物活性物质都具有抗氧化性并在创伤修复方面有所应用，例如维生素C，维生素E，另外转铁蛋白和铁蛋白也有ROS清除功能。

其中对于伤口处炎症反应的调节中，一氧化氮(nitric oxide，NO)是一种非常重要的内源性炎症因子，是一种天然抗菌药物，在伤口修复中无耐药性。然而，由于周围微环境中高浓度的ROS，糖尿病伤口微环境中NO水平也会严重不足，导致再上皮化水平、胶原形成和伤口断裂强度降低。目前也已经有了关于利用NO改善慢性创伤修复的策略，包括从内源的生成或者外源性的供应等角度提高NO水平，但是并不是针对根本原因解决问题，到时此策略的产出受限。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种精氨酸抗坏血酸酯。

本发明的另一目的在于提供所述精氨酸抗坏血酸酯的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述精氨酸抗坏血酸酯的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种精氨酸抗坏血酸酯(Arg-Vc-S)，由一个抗坏血酸分子与两个精氨酸通过酯键的形式键合而成，其结构式如式(I)所示：

所述的精氨酸抗坏血酸酯的制备方法，为以精氨酸，抗坏血酸为原料，对甲苯磺酸一水合物作为保护基团，在高温下脱水酯化制得；具体包括如下步骤：将精氨酸、抗坏血酸和甲苯磺酸一水合物加入到溶剂中，加热至110±5℃进行酯化反应，待反应结束后，得到精氨酸抗坏血酸酯(Arg-Vc-S)。

所述的精氨酸和抗坏血酸的摩尔比为2～5:1；优选为2～2.1:1。

所述的对甲苯磺酸一水合物与精氨酸的摩尔比为2～2.1:1；优选为2:1。

所述的溶剂优选为苯。

所述的苯的用量为按每毫摩尔精氨酸配比1.1～1.2L苯计算；优选为按每毫摩尔精氨酸配比1.19L苯计算。

所述的酯化反应的时间为16～20h；优选为16h。

所述的酯化反应过程中，不断收集蒸发出来的水分(反应过程中会生成水，收集蒸发出来的水分一方面可让此可逆反应继续正向进行，另一方面方便观察反应进行程度)。

所述的精氨酸抗坏血酸酯的制备方法，还包括将获得的精氨酸抗坏血酸酯进行纯化的步骤；具体为：待反应结束后，将溶剂倒出，加入异丙醇进行蒸发结晶(采用异丙醇蒸发结晶的方式提纯)，分离沉淀，真空干燥，得到纯化后的精氨酸抗坏血酸酯。

所述的蒸发的温度为60℃～80℃；优选为60℃。

所述的结晶的温度为-10℃～-30℃；优选为-20℃。

所述的纯化的次数优选为3次以上。

所述的精氨酸抗坏血酸酯在制备创伤修复的生物医用材料或药物中的应用。

所述的创伤修复包括慢性创伤修复，如糖尿病患者的创伤修复，能够促进糖尿病伤口愈合，该精氨酸抗坏血酸酯具有很好ROS清除效果，能够促进巨噬细胞中NO分泌和提高细胞摄取的能力，在氧化应激条件下促进内皮细胞VEGF分泌，进而促进伤口修复。

所述的精氨酸抗坏血酸酯在制备促进内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)分泌的药物中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明从抗氧化这一方面同时入手，在控制ROS水平的同时，增加NO水平，这样一个合理的抗氧化系统可以逆转ROS对伤口的损伤，以及降低ROS对内源性NO生成的影响，从而也能够更大程度地促进NO的生成，首次将精氨酸和抗坏血酸这两种在创伤修复过程中发挥重要作用的分子有机结合，合成了一种能够促进糖尿病伤口愈合的具有生物活性的小分子精氨酸抗坏血酸酯(Arg-Vc-S，S为对甲苯磺酸)，它结合了抗氧化和NO供体两种逆转慢性伤口微环境的原理。

(2)本发明中的精氨酸抗坏血酸酯是由精氨酸和抗坏血酸(维生素C)按摩尔比2:1酯化而成，其中抗坏血酸是典型的抗氧化剂减少ROS对组织的损伤，同时作为抗氧化成分，还能够降低ROS在NO合成过程中发挥的抑制作用，而精氨酸是内源性合成NO的唯一底物，精氨酸修饰能促进整个分子的穿细胞膜特性，使其从细胞膜外向细胞质中从而发挥作用。

(3)本发明的原料精氨酸和抗坏血酸是常用的天然生物分子，常用作为口服补剂，具有了一定的使用基础，几乎无毒副作用，且具有一定的药理作用。因此所得Arg-Vc-S材料无毒，生物相容性好，可作为创伤修复当中的代替精氨酸的优势分子。

(4)本发明中的精氨酸抗坏血酸酯是由精氨酸的羧基和抗坏血酸的羟基在特定条件下酯化得到的，制得的化合物Arg-Vc-S结构稳定，且此分子由天然小分子精氨酸和抗坏血酸有酯键连接而成，酯键可被酶水解，从而具有精氨酸和抗坏血酸的双重作用，同时在未降解状态下，此分子很利于抗坏血酸向细胞内的转运。

(5)本发明中的Arg-Vc-S用于创伤修复过程中，抗坏血酸担任了抗氧化的作用，精氨酸充当了NO合成的底物以及促进穿透细胞膜的媒介分子，抗坏血酸可以促进精氨酸反应生成NO，精氨酸可以帮助抗坏血酸更好地进入细胞，因此，精氨酸抗坏血酸酯可以最大发挥两者在创伤修复，尤其在慢性创伤修复当中的作用，最大程度地促进伤口愈合。

(6)本发明中的精氨酸抗坏血酸酯保留了精氨酸和抗坏血酸的活性基团，分子中以酯键的形式键合，此反应操作简单，反应步骤少，条件温和且产物无污染等优点，其制备方法简单、高效、经济，制得的生物活性分子Arg-Vc-S具有良好的生物相容性和抗氧化性，在生理环境中，生物活性分子降解后释放精氨酸和抗坏血酸，可直接改善细胞内环境，纠正正常细胞功能，在创伤部位协同发挥作用，有效促进皮肤切口创面修复。

附图说明

图1是实施例1中制备的Arg-Vc-S的核磁共振氢谱图。

图2是实施例1中制备的Arg-Vc-S的质谱图。

图3是实施例2中在氧化应激下的Arg-Vc-S在细胞中的抗氧化性能结果图(标尺：150nm)。

图4是Arg-Vc-S材料促进巨噬细胞NO的分泌情况图。

图5是Arg-Vc-S材料修饰在异硫氰酸罗丹明后，在细胞实验中的摄取情况图(标尺：150nm)。

图6是Arg-Vc-S材料促进内皮细胞VEGF的分泌情况图。

图7是动物实验中的材料对慢性创伤修复情况图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

实施例1精氨酸抗坏血酸酯的合成

1、通过以下方法制备化合物Arg-Vc-S，包括以下步骤：

本实验采用一锅法酯化反应，称取36.582g(0.21mmol)精氨酸(Aladdin，纯度98％)，17.612g(0.1mmol)抗坏血酸(Aladdin，纯度>99％)和83.887g(0.441mmol)对甲苯磺酸一水合物(Aladdin，纯度>97％)，同时加入到装有1/2分析纯物质苯的500ml圆底烧瓶中。烧瓶口接回流装置以及分液器，将烧瓶内固液混合物充分搅拌，同时加热至110℃后充分反应16小时。等到分液器中生成约14.4ml水后，反应结束，得紫色粘稠液体。

放至室温后，将烧瓶内苯溶液倒出，加入异丙醇至烧瓶中并在60℃下加热搅拌使其充分溶解后，放入-20℃冰箱冷却结晶，反复三次。将最后得到的沉淀进行真空干燥，最后得到紫色粉末，将其命名为精氨酸抗坏血酸酯(Arg-Vc-S)。

2、结果

(1)利用500M超导核磁共振波谱仪(Ascend TM 500)和基质辅助激光解析飞行时间质谱MALDI-TOF检测上述制备的化合物Arg-Vc-S的结构。两者是比较常规的测定化合物分子结构的表征方法，其中核磁溶剂为氘代DMSO(二甲基亚砜)，核磁共振氢谱图如图1所示。

1HNMR(DMSOd6,ppm,δ)of Arg-Vc-S:1.36[1H,OH-CH(R)₂-],1.63[4H,-CH₂-CH₂-CH₂-NH-],1.82[4H,-OC(O)-CH(NH³⁺)CH₂-(CH₂)₂-],3.10[4H,-(CH₂)₂-CH₂-NH-],4.06[2H,⁺H₃N-CH(R)-C(O)-O-],4.27[1H,CH₂-CH(R)-CH(R)₂-],4.39[2H,-(O)C-O-CH₂-],5.16[1H,-O-CH(R)-C-],5.50[OH-C-],7.69[10H,-CH₂-NH(NH²⁺)-NH₂],8.39[6H,⁺H₃N-CH(R)-C(O)-O-]。

质谱图如图2所示，飞行时间质谱溶剂为超纯水，最大分子量为1005.3。

(2)经鉴定，化合物Arg-Vc-S的结构如式(I)所示：

实施例2细胞内ROS清除实验

1、本实验采用了活性氧检测试剂盒，基于荧光染料DCFH-DA(2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate)(Sigma-Aldrich)的荧光强度变化，定性定量检测细胞内活性氧水平，具体包括以下步骤：

(1)铺板：6孔板，3T3细胞(ATCC)30000/孔，DMEM培养基(10％(v/v)胎牛血清，1％(w/v)双抗；双抗为青霉素-链霉素)。

(2)加样：6小时后，待细胞贴壁，将细胞分为实验组(过氧化氢加材料组)、过氧化氢组和对照组，其中对照组中更换DMEM培养基，过氧化氢组更换为含有过氧化氢浓度为100μM的DMEM培养基；实验组更换为含有过氧化氢浓度为100μM和精氨酸抗坏血酸酯(实施例1制备)浓度为160μM的DMEM培养基。

注：上述DMEM培养基均含有10％(v/v)胎牛血清和1％(w/v)双抗。

(3)加ROS探针：24小时后，各孔换成稀释1000倍DCFH-DA的无血清的DMEM培养基，细胞培养箱内孵育20分钟。

(4)观察：倒置荧光显微镜下观察绿色荧光。

2、结果

如图3所示，在同等观察条件下，本发明中的精氨酸抗坏血酸酯(Arg-Vc-S)材料组中观察到的绿色荧光最低，且显示比对照组低，说明本发明制备的Arg-Vc-S材料具有很好ROS清除效果。

实施例3促巨噬细胞分泌NO实验

1、本实验利用脂多糖(LPS)活化巨噬细胞分泌NO，再加入材料观察促进细胞NO分泌的作用，最后采用NO检测试剂盒(CUSABIO)的方法测定NO的浓度。具体包括以下步骤：

(1)铺板：12孔板，巨噬细胞(ATCC)8000/孔，DMEM培养基(10％(v/v)胎牛血清，1％(w/v)双抗)。

(2)加样：6小时后，待细胞贴壁，将细胞分为实验组(精氨酸抗坏血酸酯)、LPS组、混合物组(精氨酸+抗坏血酸)、精氨酸组、抗坏血酸组和对照组，对照组中更换DMEM培养基，除对照组外，各组更换含有LPS浓度为100ng/ml的DMEM培养基。活化12小时后，实验组更换含有LPS浓度为100ng/ml和精氨酸抗坏血酸酯浓度为160μM的DMEM培养基；LPS组是继续更换为含有LPS浓度为100ng/ml的DMEM培养基；混合物组(精氨酸+抗坏血酸)更换含有LPS浓度为100ng/ml、精氨酸浓度为320μM以及抗坏血酸浓度为160μM的DMEM培养基；精氨酸组更换为含有LPS浓度为100ng/ml和精氨酸浓度为320μM的DMEM培养基；抗坏血酸组更换为含有LPS浓度为100ng/ml和抗坏血酸浓度为160μM的DMEM培养基；对照组更换为DMEM培养基。

注：上述DMEM培养基均含有10％(v/v)胎牛血清和1％(w/v)双抗。

(3)测定：24小时后，取细胞上清液离心后，用NO检测试剂盒确定NO浓度。

2、结果

如图4所示，本发明中制备的精氨酸抗坏血酸酯材料组在正常生理条件下具有明显的促进巨噬细胞中NO分泌的作用。

实施例4细胞摄取实验

1、本实验利用异硫氰酸与氨基的反应，将本发明中制备的Arg-Vc-S材料与异硫氰酸罗丹明B(Sigma-Aldrich)化学连接。在通过与细胞孵育之后，观察细胞摄取罗丹明B的变化，从而确定精氨酸抗坏血酸酯的促进穿透细胞膜的能力。具体包括以下步骤：

(1)荧光修饰：取200μl浓度为10mg/ml的异硫氰酸罗丹明B的DMSO溶液，加入到5ml浓度为20mg/ml的精氨酸抗坏血酸酯的超纯水溶液中，搅拌均匀后，避光静置在4℃冰箱中24小时。

(2)铺板：6孔板，3T3细胞30000/孔，DMEM培养基(10％(v/v)胎牛血清，1％(w/v)双抗)。

(3)加样：6小时后，待细胞贴壁后为实验组和对照组，其中实验组更换含有步骤(1)中获得的反应后的染料的DMEM培养基(加入含有10％(v/v)胎牛血清和1％(w/v)双抗的DMEM培养基，使染料终浓度为2.5、5和10μg/ml)，对照组更换含有未反应的异硫氰酸罗丹明B染料的DMEM培养基(10％(v/v)胎牛血清，1％(w/v)双抗)，孵育4小时。

(4)观察：倒置荧光显微镜下观察黄色荧光。

2、结果

如图5所示，在同等观察条件下，在染料浓度不同的情况下，键合了本发明中Arg-Vc-S高分子材料的实验组均有不同程度增强的荧光，显示化合物Arg-Vc-S具有良好的促进细胞摄取的能力，以便于更好地在细胞内部发挥作用。

实施例5内皮细胞分泌VEGF实验

1、本实验通过在测定在氧化应激下的内皮细胞在与不同材料孵育后血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况，测定方法是采用VEGF检测试剂盒(CUSABIO)测定细胞培养液终VEGF的浓度。具体包括以下步骤：

(1)铺板：12孔板，人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein EndothelialCells，HUVEC)(ATCC)8000/孔，DMEM培养基(10％(v/v)胎牛血清，1％(w/v)双抗)。

(2)加样：6小时后，待细胞贴壁，将细胞分为实验组(精氨酸抗坏血酸酯；Arg-Vc-S)、混合物组(精氨酸+抗坏血酸；Arg/Vc)、精氨酸组(Arg)、抗坏血酸组和对照组(Vc)，对照组(control)，其中实验组更换为含有过氧化氢浓度为100μM和精氨酸抗坏血酸酯浓度为160μM的DMEM培养基；混合物组是为含有过氧化氢浓度为100μM、精氨酸浓度为320μM和抗坏血酸浓度为160μM的DMEM培养基；精氨酸组含有过氧化氢浓度为100μM和精氨酸320μM的DMEM培养基；抗坏血酸组含有过氧化氢浓度为100μM和抗坏血酸浓度为160μM的DMEM培养基；对照组含有过氧化氢浓度为100μM的DMEM培养基。

注：上述所用DMEM培养基均为含有血清和双抗的DMEM培养基，即含有10％(v/v)胎牛血清和1％(w/v)双抗的DMEM培养基。

(3)测定：48小时后，取细胞上清液离心后，用VEGF检测试剂盒确定其表达水平。

2、结果

如图6所示，本发明中制备的精氨酸抗坏血酸酯材料组在氧化应激条件下具有明显的促进内皮细胞VEGF分泌的作用。

实施例6糖尿病模型伤口修复

1、本实验采用了SD大鼠的糖尿病模型并以辅料的形式给药，观察Arg-Vc-S对伤口修复情况，具体包括以下步骤：

(1)构建SD大鼠的糖尿病模型

SD大鼠的糖尿病模型是通过腹腔注射链脲佐菌素构建的糖尿病模型，具体构建方法如下：

1.SD大鼠(中山大学动物实验中心购买，鼠龄4-6个月，体重180-220g)禁食14小时左右；

2.缓冲液制备：柠檬酸和柠檬酸钠(sun)1:1(摩尔比)溶解于超纯水中，三者的具体比例为31.5mg，44.1mg，3ml，使其pH为4左右；

3.称取150mg链脲佐菌素(Aladdin)溶于上一步制备的缓冲液中，并过220nm滤膜；

4.按50mg/kg腹腔注射；

5.一周后测血糖，13.5～25mmol/L即可用于实验。

(2)分别将材料溶解于4％(w/v)的透明质酸溶液中，浓度为1.6mM，再将其敷于创伤部位(于大鼠背部通过手术剪创建一个直径为1cm的圆形伤口)，给药频次为两天，并在第0(当天)、5、7和10天拍照观察。其中，实验组为精氨酸抗坏血酸酯浓度为1600μM的4％(w/v)的透明质酸溶液；精氨酸抗坏血酸混合物组为混有等量精氨酸(3200μM)和抗坏血酸(1600μM)的4％(w/v)的透明质酸溶液，精氨酸组为混有精氨酸3200μM的4％(w/v)的透明质酸溶液，抗坏血酸组为混有抗坏血酸1600μM的4％(w/v)的透明质酸溶液，对照组为4％(w/v)的透明质酸溶液。

2、结果

如图7所示，本发明中制备的Arg-Vc-S材料组的伤口愈合情况要比其他各组对照以及物理混合组好，说明化合物Arg-Vc-S具有良好的促进伤口修复的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种精氨酸抗坏血酸酯，其特征在于，结构式如式(I)所示：

2.权利要求1所述的精氨酸抗坏血酸酯的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

将精氨酸、抗坏血酸和甲苯磺酸一水合物加入到溶剂中，加热至110±5℃进行酯化反应，待反应结束后，得到精氨酸抗坏血酸酯。

3.根据权利要求2所述的精氨酸抗坏血酸酯的制备方法，其特征在于：

所述的精氨酸和抗坏血酸的摩尔比为2～5:1；

所述的对甲苯磺酸一水合物与精氨酸的摩尔比为2～2.1:1。

4.根据权利要求2所述的精氨酸抗坏血酸酯的制备方法，其特征在于：

所述的溶剂为苯；

所述的酯化反应的时间为16～20h。

5.根据权利要求2所述的精氨酸抗坏血酸酯的制备方法，其特征在于：还包括将获得的精氨酸抗坏血酸酯进行纯化的步骤；具体为：待反应结束后，将溶剂倒出，加入异丙醇进行蒸发结晶，分离沉淀，真空干燥，得到纯化后的精氨酸抗坏血酸酯。

6.根据权利要求5所述的精氨酸抗坏血酸酯的制备方法，其特征在于：

所述的蒸发的温度为60℃～80℃；

所述的结晶的温度为-10℃～-30℃；

所述的纯化的次数为3次以上。

7.权利要求1所述的精氨酸抗坏血酸酯在制备创伤修复的生物医用材料或药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

所述的创伤修复为慢性创伤修复。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

所述的创伤修复为糖尿病患者的创伤修复。

10.权利要求1所述的精氨酸抗坏血酸酯在制备促进内皮细胞血管内皮生长因子分泌的药物中的应用。

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