CN112770738A - 用于神经修复的槚如酸 - Google Patents

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Abstract

描述了刺激神经修复和髓鞘再生的方法以及治疗受试者中的髓磷脂相关疾病的方法。这些方法包括向需要治疗的受试者施用有效量的具有权利要求1的式(I)的槚如酸或其药学上可接受的盐。
Figure DDA0002990457680000011

Description

用于神经修复的槚如酸
相关申请
本申请要求2018年8月10日提交的、名称为“槚如酸神经修复”的美国临时申请No.62/717,051的权益。用于所有目的，该临时申请通过引用全文结合于此。
背景技术
中枢神经系统(CNS)的完整性由神经轴的不同区域之间的适当连接来维持。这种连接是通过髓鞘质膜的形成来维持的，髓鞘质膜包裹着轴突，并提供从皮层到脊髓不同区域的最佳电信号传输。中枢神经系统中的少突胶质细胞和外周神经系统(PNS)中的许旺细胞是主要的髓鞘质产生细胞，它们的完整性对于最佳的神经传导至关重要。少突胶质细胞、许旺细胞或髓鞘质膜受损的疾病可因电脉冲传导受损而导致神经功能障碍。
髓鞘的疾病可分为髓鞘形成障碍或脱髓鞘。在脱髓鞘疾病中，正常髓鞘被破坏，而在髓鞘形成障碍疾病中，正常髓鞘在神经系统发育过程中从未形成足够的数量。脱髓鞘疾病通常在生命后期获得，包括免疫和/或感染性疾病以及由创伤性损伤引起的疾病(例如，脊髓损伤)。
接触有毒化学品(例如，铅)或饮食缺乏可表现为脱髓鞘或髓鞘形成障碍，这取决于环境损伤是发生在发育早期还是大多数髓鞘质合成完成后。在人类当中，大部分髓鞘质是在两岁前沉积下来的，但是一些神经束继续积累鞘直到生命的第二个十年。脱髓鞘最常见的原因是大脑和脊髓的炎症性疾病。其中，多发性硬化(MS)是最具典型的疾病。Reich etal.,N Engl J Med,378(2):169-80(2018)；Noseworthy et al.,New.Eng.J.Med,343:938-46(2000)。临床过程的特征在于神经功能障碍的发作(例如，失去运动控制)，随后恢复，这可以用磁共振成像来监测，以观察崩解髓鞘质(神经斑)的斑块和髓鞘再生的区域。此外，对大脑和脊髓的创伤也会导致髓鞘质的不可逆损伤。
在CNS的脱髓鞘疾病(横断性脊髓炎、德维克氏病、多发性硬化)中，机体未能髓鞘再生和修复组织损伤似乎是该疾病的主要特征和临床残疾的原因。Wingerchuk et al.,Lancet Neurol,6(9):805-15(2007)。这种不充分的修复在CNS的脱髓鞘疾病急性恶化后未能恢复的患者、导致脱髓鞘疾病的急性发作后未能恢复的患者、进行性脱髓鞘疾病稳定性差的患者和处于MS的增长期的患者中得到证明。Rovaris et al.,Lancet Neurol,5(4):343-54(2006)；Compston and Coles,Lancet,372(9648):1502-17(2008)；Franklin andFrench-Constant,Nat Rev Neurosci,9(11):839-55(2008)；Mahad et.al.,LancetNeurol,14(2):183-93(2014)。
发明内容
非常需要开发新的治疗方法来治疗多发性硬化和其他以髓鞘质丧失或髓鞘质缺乏为特征的神经障碍。目前对复发型多发性硬化的治疗对阻止疾病进展的影响有限，因为它们没有解决与神经修复、特别是髓鞘再生有关的问题。本公开通过提供刺激神经修复和髓鞘再生的方法以及治疗髓鞘质相关疾病的方法来解决这些问题。
在一个方面，本公开可以包括在有需要的受试者中刺激神经修复的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的下式的槚如酸或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002990457660000021
另一方面，本公开可以包括在有需要的受试者中刺激髓鞘再生的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的AA或其药学上可接受的盐。
此外，本公开可以包括在有需要的受试者中治疗髓鞘质相关疾病的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的AA或其药学上可接受的盐。
在另一方面，髓鞘质相关疾病可以包括疾病、病症(例如，发生于创伤性脊髓损伤和脑梗死的那些疾病)或与受试者脱髓鞘或髓鞘再生相关的障碍。在某些情况下，髓鞘质相关疾病可能是CNS的脱髓鞘疾病。在一个示例中，脱髓鞘疾病可以是多发性硬化症。在另一个方面，髓鞘质相关疾病可以是影响视神经、大脑和/或脊髓功能的自身免疫性疾病。
在其他情况下，受试者被诊断为患有导致脱髓鞘的感染。在一个示例中，引起脱髓鞘的感染可以是人类免疫缺陷病毒感染。
本公开还可以包括用于刺激神经修复和髓鞘再生以及用于治疗髓鞘质相关疾病的含有AA的组合物。在一些情况下，根据本文所述的方法可向受试者施用的AA的量可以是每天250mg至1500mg AA。
附图说明
通过参考以下附图，可以更容易地理解本公开，其中：
图1显示了具有完全饱和侧链的槚如酸(AA)的结构。
图2显示了通过诱导IL-33以激活少突胶质前体细胞(OPC)中髓磷脂基因的直接和间接途径。
图3显示了添加AA后OPC中髓磷脂基因表达的qPCR分析。Mbp＝髓磷脂碱性蛋白，Plp＝蛋白脂质蛋白，Mog＝髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白。
图4(上部)显示了用AA培养后，OPC中髓磷脂碱性蛋白(MBP)的诱导。图像分析(底部)显示，在用AA培养后，MBP的表达增加了2.4倍。
图5(上部)提供了蛋白质印迹研究的结果，显示在OPC中存在AA的情况下，IL-33的表达增加。图5(底部)显示了凝胶的图像分析，表明蛋白质表达增加了1.6倍。因为IL-33主要在细胞核中，所以用细胞核提取物进行蛋白质印迹，用核纤层蛋白作为对照。
图6提供了显示在用AA(Ana)培养后OPC向成熟少突胶质细胞分化增加的图像。从大鼠幼仔中分离出OPC，用AA进行培养，每隔一天向培养物中加入1μM的AA，持续14天。实验结束时，对细胞进行染色，并使用ImagJ软件评估MBP的量。
图7A提供了用IL-33处理的OPC培养物中MPB表达的蛋白质印迹分析。图7B提供了qRT-PCR分析，显示了与MPB启动子区和用IL-33处理的主要髓磷脂基因结合的转录因子的基因表达。T3是甲状腺激素内部阳性对照。
图8A显示了在存在IL-33的第4天，O4表达细胞(早期祖细胞)数量的增加(上部一组小图)。图8B显示了在第14天在OPC培养物中表达MBP的细胞的增加(下部一组小图)。右边的图表显示了O4和MBP的定量。
图9提供了显示背根神经节轴突的髓鞘形成的图像。箭头指向添加IL-33(20倍)的培养物中有髓节间的较长片段。
图10显示了9周研究中小鼠髓鞘形成的改善。小鼠服用双环己酮草酰双腙9周，从第7周开始，小鼠每天服用12.5mg/kg的AA，持续3周。在第9周结束时处死小鼠。与对照组小鼠相比，7-9周的用AA治疗的小鼠表现出最大的改善。数据表示为LFB染色的平均像素强度，其被标准化为在胼胝体的两个非重叠区域测量的对照组。
图11提供了在为期9周的研究中使用LFB染色(顶部小图)和用抗MBP抗体免疫染色(底部小图)在大脑冠状切片中对髓磷脂进行染色的图像，这些研究分别针对天然的(左)、双环己酮草酰双腙治疗的(中)和双环己酮草酰双腙+AA治疗的(12.5mg/kg/天)的小鼠，其中双环己酮草酰双腙+AA治疗的小鼠在研究的第7-9周接受了AA治疗。Y轴代表标准化为LFB对照和MBP免疫染色的染色的平均像素强度。
图12显示了在研究中施用环己酮草酰双腙9周和在第7-9周施用AA之后，在经AA治疗(12.5mg/kg/天)和载体治疗的小鼠的胼胝体的冠状切片中使用LFB染色(左)和用抗MBP抗体免疫染色(右)的髓磷脂染色的定量。与对照组小鼠相比，在AA治疗的小鼠中发现了更高含量的髓磷脂。
图13显示了在用MOG肽免疫和用AA(0.25mg/kg/天)治疗的小鼠中，AA预防EAE病的能力。在两个实验中，AA治疗组的10只小鼠中只有2只出现1级瘫痪。在载体治疗组，10只小鼠中有9只出现瘫痪。临床评分：1＝尾巴无力，2＝步态共济失调和一条以上肢体瘫痪，3＝两条以上肢体瘫痪，4＝所有肢体无力，5＝死亡。
图14显示了用AA(0.25mg/kg/天)治疗的小鼠从最早出现瘫痪症状开始的瘫痪进展。接受AA治疗的小鼠恢复更快。
图15显示了经AA治疗(0.25mg/kg/天)和载体治疗的诱导产生EAE的小鼠脊髓的脱髓鞘的定量。数据显示，在用AA治疗的小鼠中，对脱髓鞘有显著的保护作用。该数据表示为脊髓的三个不连续轴切面中髓磷脂损失的百分比面积；当从第0天开始或从症状开始施用AA时，治疗组和未治疗组之间的p<0.01。
具体实施方式
I.定义
本文所述的术语仅用于描述实施例，不应被理解为对本公开的整体限制。如在本公开和所附权利要求的描述中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括它们的复数形式，除非由其上下文所限制。
本公开包括任何药学上可接受形式的本文所述化合物，包括异构体(例如，非对映异构体和对映异构体)、互变异构体、盐、溶剂化物、多晶型物、前药等。特别地，如果化合物是光学活性的，本公开具体包括该化合物的每一种对映异构体以及对映异构体的外消旋混合物。应当理解，无论是否明确说明(尽管有时明确说明了“盐”)，术语“化合物”包括任何或所有这些形式。
本文所定义的受试者可以是任何动物。在一个实例中，受试者是脊椎动物，在更具体的实例中，受试者是哺乳动物，例如家养的农场动物(例如，牛、马、猪)或宠物(例如，狗、猫)。在另一个示例中，受试者是人。受试者也可能是有患髓磷脂相关疾病风险的受试者。
如本文所用，术语“治疗”可以涉及逆转、减轻、抑制特定病症或状况的进展或阻止特定病症或状况，预防特定病症或状况，或减轻与特定病症或状况相关的症状和/或预防或消除所述症状。
本文所用的“药学上可接受的”是指该化合物或组合物适合于按照本文所述方法施用于受试者，鉴于疾病的严重性和治疗的必要性，没有过度有害的副作用。
术语“治疗有效”旨在限定达到降低疾病严重程度同时避免不利副作用(例如通常与替代疗法相关的副作用)的目标的药物量。另一方面，“有效量”是足以提供显著化学效果的量。
II.概述
本发明总体上涉及通过施用AA来刺激神经修复和髓鞘再生以及治疗髓磷脂相关疾病的方法。
本公开至少部分基于细胞因子IL-33参与髓磷脂再生和修复的这一发现。基于这一发现，已经研究了增加细胞因子IL-33的策略，包括识别可能促进IL-33表达的治疗剂。已经发现，在槚如果实和壳中发现的天然化合物AA在少突胶质前体细胞(OPC)中诱导细胞因子IL-33，并在OPC中诱导某些髓磷脂基因的表达。因此，AA是一种有吸引力的天然神经修复化合物。
AA是一种非类异戊二烯的长链酚酸，主要从原产于南美的植物槚如树(Anacardium occidentale)的坚果壳中获得。(图1)。
Figure BDA0002990457660000061
溶剂提取的槚如坚果壳液(CNSL)富含许多长链酚类化合物，包括各种槚如酸。在CNSL发现了三种主要的槚如酸。这三种主要形式是单烯、二烯和三烯。完全饱和的形式(被称为AA)以可忽略的量存在。合在一起，单烯、二烯、三烯和AA在本文中被称为天然槚如酸(“NAA”)。
Figure BDA0002990457660000062
NAA是亲脂性小分子，使它们对刺激神经修复和髓鞘再生特别有吸引力，因为它们有能力进入中枢神经系统，包括在血脑屏障完好无损时进入大脑的能力。尽管本公开内容涉及将AA用于刺激神经修复和髓鞘再生，以及用于治疗髓磷脂相关疾病，但是应当理解，任何NAA都可用于本文所述的方法。
方法
本公开的一个方面提供了一种在有所需要的受试者中刺激神经修复的方法，包括向受试者施用有效量的AA或其药学上可接受的盐。本公开还提供了一种在有需要的受试者中刺激髓鞘再生的方法，包括向受试者施用有效量的AA或其药学上可接受的盐。此外，本公开可以包括在有需要的受试者中治疗髓磷脂相关疾病的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的AA或其药学上可接受的盐。
髓磷脂疾病可以包括任何疾病、病症(例如，发生于创伤性脊髓损伤和脑梗死的那些疾病)或与受试者脱髓鞘或髓鞘再生相关的疾病。髓磷脂形成细胞的死亡可能是由于创伤、毒素、营养缺乏、遗传障碍或涉及CNS或PNS的炎症疾病。
脱髓鞘是一些神经退行性自身免疫性疾病(包括MS、横断性脊髓炎、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病和格林-巴利综合征)的标志。可通过本文所述方法治疗的神经障碍的非限制性示例包括MS(例如，复发/缓解型MS、继发进展型MS、进展复发型MS、原发进展型MS和急性暴发型MS)、脑桥中央髓鞘溶解症、急性播散性脑脊髓炎、进行性多灶性白质脑病、亚急性硬化性全脑炎、感染后脑脊髓炎、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、德维克氏病、Balo同心圆硬化、脑白质营养不良(例如，异染性脑白质营养不良症、克拉伯病、肾上腺脑白质营养不良症、佩梅病、卡那万病、儿童共济失调伴中枢性低髓鞘化症、亚历山大病或雷夫苏姆病)、视神经炎、横断性脊髓炎、脑性瘫痪、脊髓损伤、与年龄相关的髓磷脂缺失，以及外周神经系统的获得性和遗传性神经病(例如，格林-巴利综合征和腓骨肌萎缩症)。在一个示例中，神经障碍是MS。
在某些情况下，受试者被诊断为患有CNS的脱髓鞘疾病，包括表1中所列的疾病。
表1：CNS的脱髓鞘疾病
CNS创伤 脊髓挫伤
原发性脱髓鞘疾病 多发性硬化
视神经脊髓炎
急性播散性脑脊髓炎
急性横断性脊髓炎
急性进展性视神经炎
导致脱髓鞘的感染 人类免疫缺陷病毒(HIV)
人类T淋巴细胞病毒-1(HTLV-1)
进展性多灶性白质脑病
血管功能不全 中风
在某些情况下，受试者被诊断为患有原发性脱髓鞘疾病。例如原发性脱髓鞘疾病可以是MS。在另一方面，受试者被诊断为患有导致脱髓鞘的感染。例如，引起脱髓鞘的感染可以是人类免疫缺陷病毒感染。
在另一方面，髓磷脂相关疾病可以是影响视神经、大脑和/或脊髓功能的自身免疫性疾病。
在另一个实例中，本公开可包括一种预防受试者脱髓鞘的方法，该受试者已被证明具有发展成脱髓鞘疾病的高风险。例如，炎症性脱髓鞘疾病可以通过给受试者施用AA来预防。此外，可以通过对中风、血管损伤或创伤性损伤的高风险受试者施用维持剂量的AA来降低任何未来髓磷脂损伤的严重性。
评估受试者神经修复和髓鞘再生的方法是本领域已知的。例如，常规MRI、磁化传递(MT)成像、髓磷脂水分数、弥散张量成像(DTI)和正电子发射断层(PET)成像可用于评估受试者的神经修复和髓鞘再生。此外，反映脑蛋白存在的生物标志物，如血液或脊髓液中存在的神经丝轻链，可用于确定神经退行性病变。
AA的配制和施用
本公开提供了一种施用在药物组合物中的AA化合物的方法。药物组合物的实例包括用于口服、静脉内、鞘内、肌内、皮下或腹膜内、或本领域技术人员已知的任何其它途径给药的药物组合物，并且通常包括提供与药学上可接受的载体一起配制的AA化合物。在一些情况下，可将AA化合物掺入水凝胶网或支架中，该水凝胶网或支架可植入损伤部位以在损伤部位提供连续的AA释放。
当制备用于口服给药的药物组合物时，药物组合物可以是例如片剂、胶囊、悬浮液或液体的形式。药物组合物优选制成含有特定量的AA化合物的剂量单位形式。这种剂量单位的示例是胶囊、片剂、粉末、颗粒或悬浮液，具有常规添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；具有粘合剂，如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；具有崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；且具有润滑剂，如滑石或硬脂酸镁。AA化合物也可以作为组合物通过注射给药，其中例如生理盐水、葡萄糖或水可以用作合适的载体。
对于静脉内、鞘内、肌内、皮下或腹膜内给药，可将AA化合物与无菌水溶液混合，该无菌水溶液优选与受体的血液等渗。这种制剂可以通过将固体AA化合物溶解在含有生理相容物质(如氯化钠、甘氨酸等)且具有与生理条件相容的缓冲pH的水中以产生水溶液，并使所述溶液无菌来制备。该制剂可以存在于单位或多剂量容器(例如密封安瓿或小瓶)中。
适于胃肠外给药的制剂方便地包含优选制成等渗的AA化合物的无菌水性制剂。注射制剂也可以通过将AA化合物悬浮或乳化在非水溶剂(如植物油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇)中来配制。
通过参考已知的治疗或预防方案，可以容易地确定剂型和用量。施用的AA化合物的量和用本文所述的AA化合物和/或组合物治疗疾病状况的剂量方案可以根据多种因素而变化，包括受试者的年龄、体重、性别和医学状况、疾病的严重程度、给药途径和频率、所用的特定AA化合物以及所治疗个体的药代动力学性质。如果AA化合物是局部给药而不是全身给药，并且用于预防而不是治疗，则剂量通常会更低。这种治疗可以根据需要经常给药，并持续治疗医师认为必要的时间。例如，治疗可以每天、每隔一天、每周或每月进行。
本领域技术人员将理解，待施用的AA化合物的剂量方案或治疗有效量可能需要针对每个个体进行优化。该药物组合物可含有约0.1mg至2000mg的AA化合物。例如，在药物组合物中，AA化合物的含量可以在约0.5mg至1500mg的范围内，或者在约1mg至200mg的范围内。每日剂量为约0.01-100mg/kg体重或约0.1-50mg/kg体重的AA化合物可能是合适的。在一个实例中，每日施用的AA剂量在250-1500mg之间。在另一个示例中，每日施用的AA剂量为675mg。每日剂量可以一天一到四次。
AA化合物的最大耐受剂量(MTD)可以在无瘤无胸腺裸鼠中确定。将药物制备成在含有0.5％甲基纤维素(w/v)和0.1％吐温80(v/v)的无菌水中的悬浮液，并以0、25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg的剂量口服给药于小鼠(7只/组)，每天一次，持续14天。小鼠的体重每周测量两次，对一般健康和行为的直接日常观察作为药物耐受性的主要指标。将MTD定义为在14天的治疗期内导致体重减轻不超过10％的最高剂量。Carvalho et al.,JEthnopharmacol,135(3):730-36(2011)。
AA化合物可以作为药学上可接受的盐提供。短语“药学上可接受的盐”意指通常用于形成碱金属盐和形成游离酸或游离碱的加成盐的盐。盐的性质并不重要，只要它是药学上可接受的。化合物的合适的药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸或有机酸制备。这种无机酸的示例是盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸。合适的有机酸可选自脂肪族、脂环族、芳香族、芳脂族、杂环族、羧酸类和磺酸类有机酸，其示例包括甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡萄糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖醛酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、甲磺酸、水杨酸、对羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、阿波酮酸、帕莫酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、2-羟基乙磺酸、甲苯磺酸、对氨基苯磺酸、环己氨基磺酸、硬脂酸、海藻酸、γ-羟丁酸、半乳糖二酸和半乳糖醛酸。本文所述的AA化合物的合适的药学上可接受的碱加成盐包括由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制成的金属盐。可选地，由N,N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因制成的有机盐可用于形成本文所述化合物的碱加成盐。所有这些盐都可以通过常规方法由本文所述的相应化合物通过例如合适的酸或碱与该化合物反应来制备。
AA化合物也可以与其他药物同时给药。例如，AA化合物可以与甾体药物(如泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、倍他米松和地塞米松)一起给药。该AA活性化合物也可以与疾病改善药物(如含干扰素β-1a和干扰素β-1b的药)一起给药。在其他情况下，AA化合物可与诸如醋酸格拉替雷、米托蒽醌、那他珠单抗、特立氟胺、芬戈莫德、阿仑单抗、富马酸二甲酯和达方吡啶的药物一起给药。
AA化合物的制备
用于本文所述方法的AA化合物可以通过本领域已知的途径和化学领域熟知的类似方法合成，特别是根据本文所含的描述。Satoh,et al.,Chem Pharm Bull(Tokyo),49(1):18-22(2001)；Swamy et al.,Chem Commun(Camb),54(90):12758-61(2018)。AA和其它起始物料通常可从商业来源获得，例如Aldrich Chemicals(美国威斯康星州密尔沃基)，或者使用本领域技术人员熟知的方法(例如，通过Louis F.Fieser and Mary Fieser,Reagents for Organic Synthesis,v.1-19,Wiley,New York,(1967-1999ed所大致描述的方法)和本领域技术人员已知的类似信息容易地制备。
从槚如坚果壳油中提纯槚如酸，包括强心酚和槚如酚(cardonol)。槚如酸以钙盐的形式分离，无酸的槚如坚果壳液用氨处理，用己烷和乙酸乙酯混合物提取。此外，已经使用超临界二氧化碳从槚如坚果壳油中分离出槚如酸，这样避免了使用有机溶剂。Balasubramanyam et al.,J Biol Chem,278(21):19134-40(2003)；Hemshekhar et al.,Basic Clin Pharmacol Toxicol,110(2):122-32(2012)；Philip et al.,J Agric FoodChem,56(20):9350-54(2008)。
通过以下实施例来说明本公开。应该理解的是，具体的示例、物料、数量和程序应该根据这里阐述的本公开的范围和精神进行广义解释。
实施例
实施例1：作为神经修复和髓鞘再生治疗剂的AA
槚如树是漆树科的一员，是巴西本土的热带树种，在印度和东非广泛种植。Trevisan et al.,Food Chem Toxicol,44(2):188-97(2006)。槚如坚果壳液(CNSL)是槚如坚果壳的重要农业副产品。槚如酸占槚如壳液成分的近70％。槚如酸是一种酚类脂质，与乙醇和醚部分混溶，但几乎不与水混溶。化学上，槚如酸由水杨酸部分组成，水杨酸部分取代有15或17个碳原子的饱和或不饱和的烷基链。槚如酸上的长烷基链赋予槚如酸亲脂性。Hemshekhar et al.,Basic Clin Pharmacol Toxicol,110(2):122-32(2012)。
(i)槚如酸(AA)增加髓磷脂基因合成。
研究了AA对髓磷脂基因、MBP和IL-33表达的影响。由于已进行的研究表明IL-33是髓磷脂基因的关键诱导剂，因此在OPC中进行了IL-33的诱导(图2)。Natarajan et al.,PLOS One,11(3):e0152163(2016)；Sriram et al.,Neurology,Abstract presented atthe American Academy of Neurology,2016(2016)。这些研究是在从大鼠幼崽获得的OPC中进行的。OPC用AA(2.5μM)治疗3小时，信息水平用qPCR分析进行定量。用AA治疗的OPC诱导主要髓磷脂基因Mbp、Mog和Plp。此外，qPCR分析显示结合在Mbp启动子区的转录因子Sp1、Sox10和Purα上调(图3)。
还检测了AA诱导的IL-33在OPC中的表达。如表2所示，在2.5μM AA存在下培养3小时的OPC中，IL-33的表达增加了8.54倍(图3)。数据表示为与对照蛋白GAPDH相比的倍数变化。
表2对存在或不存在AA的情况下培养的OPC中IL-33的诱导的q-PCR。
20ng/cDNA GAPDH(ct) IL-33(ct) 倍数变化
载体3h 26.625 32.155 1.00
AA 2.5μM 3h 28.285 30.72 8.54
AA 5μM 3h 27.135 30.41 4.77
(ii)在用AA培养的OPC中的MBP的诱导。
为了进一步验证AA诱导MBP蛋白质合成的能力，将4×106个OPC在含有和不含AA的多聚赖氨酸涂覆的培养皿中培养10天。研究的AA浓度如下：1、2.5、5、7.5和10μM。生长培养基每三天更换一次。新生幼崽的OPC在出生后第0天不表达髓磷脂蛋白。在体外培养时，OPC分化成髓磷脂表达细胞，这个过程需要7-14天。正如预期的那样，蛋白质印迹分析显示，AA治疗以剂量依赖的方式增加了MBP水平(图4)，表明AA可以作为髓鞘形成的营养因子。
此外，在2.5μM的AA剂量下，IL-33的蛋白水平增加了1.8倍，在7.5μM的AA剂量下，IL-33的蛋白水平增加了3.1倍(图5)。这些研究表明，AA可以通过诱导IL-33直接和间接诱导MBP和MBP基因。
(iii)AA诱导OPC的成熟
用AA培养14天之后，在存在和不存在AA(1μM)的情况下，对MBP(OPC中髓磷脂成熟的标志)的表达进行了研究。如图6所示，与在正常生长培养基中培养的细胞相比，MBP的表达增加了2.1倍。
(iv)在存在AA的情况下，IL-33在OPC中诱导MBP和MBP基因。
IL-33作为许多髓磷脂基因的诱导剂的重要性已经得到了证明。用IL-33治疗OPC显示出26％的MBP诱导率。定量了MBP、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(Mog)、蛋白脂质蛋白(Plp)以及Purα、Sox10和Sp-1的mRNA在IL-33培养的OPC中的表达。Purα、Sox10和Sp-1是与MBP启动子区结合以启动MBP基因表达的转录因子。如图7A所示，IL-33的加入诱导了MBP表达4.5倍，Mog表达3.8倍，PLP表达2.3倍，Purα表达2.1倍，Sox10表达3.9倍，Sp1表达2.2倍。这些数据表明外源性添加重组IL-33是髓鞘形成相关的关键基因的诱导剂(图7B)。
(v)IL-33诱导OPC的成熟。
CNS髓磷脂的形成依赖于OPC的分化和成熟。成熟的过程在体外和体内都很好的识别。未成熟的OPC表达血小板衍生生长因子(PDGFR)的受体，也表达被抗体A2B5、抗O4和抗Olig2抗体识别的蛋白质。随着少突胶质细胞的成熟，它们对A2B5、PDGFR和Olig 2失去反应性，并开始表达包括MBP的髓磷脂蛋白。成熟程度可以通过确定表达早期谱系标记(如O4)和晚期谱系标记(如MBP)的细胞的百分比来评估。测定了O4和MBP在IL-33存在或不存在的情况下在培养4天和14天的OPC中的表达。如图8A所示，与在正常生长培养基中培养的细胞相比，用IL-33培养4天后，O4表达细胞的表达增加了2.3倍。当OPC培养14天后，成熟少突胶质细胞形成膜状(表达高水平的MBP)增加(图8)。利用IL-33所见的增加与利用AA所见的增加相似。
(vi)IL-33诱导轴突的髓鞘形成。
在初步研究中，研究了使用背根神经节-OPC共培养物在IL-33存在下的轴突的体外髓鞘形成。从出生后第2天(P2)的大鼠幼鼠解剖背根神经节(DRG)，并通过已建立的方法进行培养。一旦OPC附着在板上，就用大鼠rIL-33(10ng/ml)对它们进行处理，持续16天。实验结束时，用针对轴突的微管蛋白β和针对髓磷脂形成少突胶质细胞的MBP对细胞进行染色。使用图像分析对轴突中的髓磷脂进行定量，并确定轴突周围的髓磷脂的量。添加IL-33导致裸轴突髓鞘形成增加。与载体治疗的对照组相比，在用IL-33治疗的培养物中，MBP增加了18％。这些研究表明，外源性添加重组IL-33诱导髓鞘形成涉及的关键蛋白的表达(图9)。
(vii)在双环己酮草酰双腙诱导的脱髓鞘模型中，AA能有效诱导髓鞘形成。
双环己酮草酰双腙诱导的脱髓鞘模型是一种毒性脱髓鞘模型。Torkildsen etal.,Acta Neurol Scand Suppl.188:72-6(2008)；Bai et al.,Exp Neurol,283(Pt A):330-40(2016)。双环己酮草酰双腙诱导CNS的大白质束的广泛脱髓鞘。因为胼胝体是大脑中最大的白质束，它通常用于研究双环己酮草酰双腙模型中的脱髓鞘/髓鞘再生。在双环己酮草酰双腙模型中，动物被喂以导致少突胶质细胞死亡的双环己酮草酰双腙。然而，因为双环己酮草酰双腙不会破坏新的少突胶质细胞，所以在双环己酮草酰双腙诱导的脱髓鞘过程中和之后会发生髓鞘再生。此外，从动物饮食中去除双环己酮草酰双腙已被证明会导致轴突的快速髓鞘再生。Deshmukh et al.,Nature,502(7471):327-32(2014)；Magalon et al.,Ann Neurol,71(2):213-26(2012)。由于该模型是非免疫介导的，可以在没有炎症标记物干扰的情况下测试促进髓鞘再生的神经修复疗法。Lassmann and Bradl,Acta Neuropathol,133(2):223-44(2017)。
为了证明使用双环己酮草酰双腙诱导的脱髓鞘模型的治疗效果，药物必须以比自然发生的髓鞘再生的程度更大的程度来促进髓鞘再生。任何潜在药物的疗效仅在双环己酮草酰双腙戒断后和髓鞘再生的自然过程恢复之前的短时间内是明显的。双环己酮草酰双腙戒断后，6周后出现完全髓鞘再生。因此，进行了一项研究，其中在小鼠的食物中施用双环己酮草酰双腙9周，并且从7周开始与双环己酮草酰双腙一起施用AA或载体。以前的研究表明，与0.2％双环己酮草酰双腙混合的食物会引起广泛扩散的脱髓鞘，并且在使用双环己酮草酰双腙6-8周后，胼胝体会出现脱髓鞘。在第7周开始时，小鼠每天接受12.5mg/kg溶解在DMSO sc中的AA，持续三周。对照组小鼠接受等量的DMSO(载体)。在第7、8和9周结束时，处死相同数量的小鼠(5只/组)，通过用Luxol Fast Blue(“LFB”)染色(髓磷脂的化学染色)或用抗MBP抗体染色来测定髓磷脂的量。在第7、8和9周结束时，处死小鼠的代表性样品，然后检查胼胝体是否脱髓鞘。将代表性切片从胼胝体的两个区域染色，间隔5mm。结果总结如下。
在第7周和第8周结束时，接受过1周或2周槚如酸治疗的小鼠与相应的对照小鼠相比，髓磷脂的表达没有差异。然而，在第9周结束时，与相应的对照小鼠相比，接受三周AA的小鼠显示出胼胝体髓磷脂染色量的显著增加。与对照小鼠相比，经AA治疗的小鼠的LFB染色(来自6只小鼠的12个不同区域的总和)增加了10％(P<0.02)(图10)。
还用抗MBP抗体进行了额外的免疫染色。发现与对照小鼠相比，经AA治疗的小鼠的MBP染色增加了17％(P＝0.02)。槚如酸治疗的小鼠和载体治疗的小鼠之间的少突胶质细胞的数量没有差异。因此，这表明，即使在存在胶质毒剂的情况下，槚如酸也最有可能增加未成熟少突胶质细胞向成熟形式的分化(图11和图12)。
(viii)AA能有效预防和逆转急性实验性变应性脑炎的病程。
实验性变应性脑炎(“EAE”)是一种CNS的自身免疫性炎症性脱髓鞘疾病。出于实验目的，通过用佐剂中的髓磷脂抗原免疫动物，在动物中诱发该疾病。传统上，神经抗原是髓磷脂少突胶质细胞蛋白(MOG)或MOG的合成肽(肽P35-55)，其已被证明是致脑炎的。免疫后10到12天，动物出现瘫痪。瘫痪程度评分如下：1＝尾巴无力，2＝步态共济失调和一条以上肢体瘫痪，3＝两条以上肢体瘫痪，4＝所有肢体无力，5＝死亡。
EAE模型已被广泛用于检查潜在药物对MS治疗的疗效。检测AA在用佐剂中的MOG肽免疫的小鼠中预防EAE病的效力。在整个研究期间(28天)，给总共10只小鼠施用0.25mg/kg溶解在DMSO(载体)中的AA，并且给总共10只小鼠单独施用载体，每天腹腔注射。AA从商业来源获得。载体组的10只动物中有9只出现瘫痪症状，平均最大瘫痪评分为2.66。接受AA治疗的10只动物中有两只出现瘫痪，被评为1级瘫痪(治疗组与安慰剂组相比，P<0.01)。与接受AA治疗的小鼠相比，载体治疗组的髓磷脂损失也显著减少(图13)。
为了确定用AA治疗是否会促进瘫痪发作后的恢复，重复了图13所示的实验，但是直到在用MOG抗原初次免疫后的第11天和第12天之间出现最早的疾病迹象时，才开始用AA治疗。在实验中，10只小鼠每天施用DMSO中的0.25mg/kg AA，10只小鼠被施用DMSO(载体)。在每天接受0.25mg/kg AA的10只小鼠中，与载体治疗的小鼠相比，疾病的平均最大严重程度没有差异。载体治疗组的平均最大严重度为2.8，AA治疗组的平均最大严重度为2.6。然而，在AA治疗组中，瘫痪迅速逆转。到第24天，除了AA治疗组的一只动物表现出2级虚弱外，所有其他小鼠都已完全康复。相比之下，载体组10只小鼠中有6只仍表现出瘫痪状态，平均临床评分为1.8(图14)。
为了证实在EAR实验中计算的临床评分反映了病理学，检查了载体治疗组和AA治疗组中每只小鼠的颈、胸腰段脊髓的脱髓鞘的程度。在从免疫日开始每天用0.25mg/kg AA治疗的组中，载体治疗组中脱髓鞘的平均百分比为9.9+/-4.0。该组的平均最高临床评分为2.7分。在从第0天开始每天接受0.25mg/kg AA的小鼠中，没有观察到脱髓鞘，表明存在完全的病理保护。
当在最早出现瘫痪临床症状时施用AA时，AA治疗组的脱髓鞘百分比评分为2.9。相比之下，在载体治疗组中，脱髓鞘百分比评分为7.2(P<0.01)(图15)。
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Claims (20)

1.一种在有需要的受试者中刺激神经修复的方法，其中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的槚如酸(AA)或其药学上可接受的盐，所述槚如酸的结构为：
Figure FDA0002990457650000011
2.根据权利要求1所述的方法，其中，对所述受试者施用AA。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受试者已被诊断为患有脱髓鞘疾病。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述脱髓鞘疾病是多发性硬化。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受试者已被诊断为患有导致脱髓鞘的感染。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，用药学上可接受的载体施用AA。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所施用的所述有效量的AA为每天250-1500mg的AA。
8.一种在有需要的受试者中刺激髓鞘再生的方法，其中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的AA或其药学上可接受的盐。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述受试者已被诊断为患有脱髓鞘疾病。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述脱髓鞘疾病是多发性硬化。
11.根据权利要求8所述的方法，其中，所述受试者已被诊断为患有导致脱髓鞘的感染。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述导致脱髓鞘的感染是人类免疫缺陷病毒感染。
13.根据权利要求所述8的方法，其中，用药学上可接受的载体施用AA。
14.根据权利要求8所述的方法，其中，所施用的所述有效量的AA为每天250-1500mg的AA。
15.一种在有需要的受试者中治疗髓磷脂相关疾病的方法，包括向所述受试者施用有效量的AA或其药学上可接受的盐。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述髓磷脂相关疾病是多发性硬化。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述髓磷脂相关疾病是脊髓的损伤。
18.根据权利要求15所述的方法，其中，所述髓磷脂相关疾病是脑梗死。
19.根据权利要求15所述的方法，其中，所述髓磷脂相关疾病是感染后脑脊髓炎。
20.根据权利要求15所述的方法，其中，所施用的所述有效量的AA为每天250-1500mg的AA。
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