CN112759548A - 一种新型par-1抑制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于血液抗凝固技术领域，具体涉及一种新型PAR‑1抑制剂及其制备方法。所述的新型PAR‑1抑制剂，结构式为：

采用市售天然产物香紫苏内酯为原料，经五步反应制得。所述PAR‑1抑制剂，母核与沃拉帕沙高度相似，作用靶点明确、结构新颖、活性高，其IC₅₀值能够达到纳摩尔级别，安全性高，制备成本低廉、易于工业化批量生产，在作为治疗血栓性疾病的候选药物中具有很好的应用前景。

Description

一种新型PAR-1抑制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于血液抗凝固技术领域，具体涉及一种新型PAR-1抑制剂及其制备方法。

背景技术

据国家心血管病中心日前公布的《中国心血管病报告2017》显示：中国现有心脑血管疾病(包括冠心病、脑卒中、心衰、高血压等)患者约2.9亿人，且呈快速增长趋势。在心脑血管疾病中由于血管栓塞引起的血栓性疾病发病率(如由血栓性疾病引起的脑血栓、脑梗塞、心肌梗塞、心力衰竭、心源性休克、冠心病、动脉粥样硬化等)逐年上升，且呈年轻化趋势，目前已经成为我国重大的公共卫生问题。因此国内外对于预防和治疗血栓性疾病药物需求很大。目前我国临床上使用的抗凝药物，抗血小板药类药物的销售和使用规模占据抗血栓药市场半壁江山。但传统抗血小板药物大多是通过抑制TXA2或ADP对抗血栓的形成，容易在阻滞病理性血栓形成过程的同时影响了人体正常的止血功能，进而增加了患者发生出血的概率和风险。

这种情况有望随着PAR-1(Protease-activated receptor-1)抑制类药物的上市得到改善和解决。该类药物能够通过抑制PAR-1从而阻断由凝血酶介导的血小板聚集和病理性血栓扩大，同时不会影响由TXA2和ADP参与的人体正常保护性止血过程，从而减少患者治疗过程中出血的发生。截止目前，第一个且唯一一个基于PAR-1研发并上市的抗血小板药物，为美国默沙东公司研制的新型抗血小板药物硫酸沃拉帕沙(Vorapaxar Sulfate，商品名Zontivity)。该药物分别于2014年5月和2016年11月分别在美国和加拿大批准上市，主要用于有心脏病发作史的患者和下肢动脉栓塞的患者，并可进一步降低心脏病发作和中风的风险。尽管沃拉帕沙具有良好的抗凝血活性，但其存在结构复杂，合成路线较长和制备成本高昂的缺点；此外，在长期使用过程中，仍有部分人群会产生一定程度的出血副作用，但由于该药半衰期较长(10天)，当副作用发生时没有合适的药品能够抵抗和缓解这种出血症状，对该药品的临床应用和市场表现产生了不利影响。

中国专利CN 110627710A公开了一种新型PAR-1抑制剂及其制备方法和在预防和/或治疗血栓性疾病中的用途，所述的PAR-1抑制剂的结构式如下：

但是，以上化合物结构存在以下问题：活性较低，其IC₅₀值仅达到23.83nM。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种新型PAR-1抑制剂，母核与沃拉帕沙高度相似，该抑制剂具有作用靶点明确、结构新颖，活性高，其IC₅₀值能够达到纳摩尔级别，安全性高的特点；本发明同时提供其制备方法。

本发明所述的新型PAR-1抑制剂，结构式如式(I)所示：

所述的新型PAR-1抑制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)以香紫苏内酯为起始原料，在酸性环境下发生构型转化，制备得到式(II)所示的化合物；

2)式(II)所示的化合物经氧化在羰基α-位引入羟基，制得式(III)所示的化合物；

3)将式(III)所示的化合物中的羰基用LiAlH₄还原，制得式(IV)所示的化合物；

4)用NaIO₄将式(IV)所示的化合物中的邻二醇结构进行氧化裂解，制得式(V)所示的化合物；

5)在正丁基锂的作用下，使式(V)所示的化合物与式(VI)所示的化合物经维悌希反应，制得式(I)所示的化合物；

其中：以上以香紫苏内酯为起始原料经步骤1)-步骤4)制得式(V)所示的化合物的步骤为本领域公知步骤。

所述的新型PAR-1抑制剂的用途，加入药学上可接受的药用辅料、载体、赋形剂或稀释剂中的一种或几种，制成药物组合物，用于预防和/或治疗血栓性疾病。

其中：

所述的血栓性疾病包括血栓形成、动脉粥样硬化、再狭窄症、高血压、心绞痛、心脏衰竭、紧急梗死、肾小球炎或周边血管疾病。

优选地，所述的药物组合物的剂型为固体或液体口服制剂、注射剂。

更优选地，所述的药物组合物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

在治疗过程中，所述的新型PAR-1抑制剂还可以与至少一种其他心血管疾病药物合用。其中，所述的其他心血管疾病药物可用于治疗与血栓形成相关的疾病，其包括血栓形成、动脉粥样硬化、再狭窄症、高血压、心绞痛、心律不整、心脏衰竭、心肌梗死、肾小球炎、血栓形成性中风、血栓栓塞性中风、周边血管疾病、其他心血管疾病以及凝血酶及其受体在其中其病理作用的其他疾病。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明所述的PAR-1抑制剂，母核与沃拉帕沙高度相似，作用靶点明确、结构新颖、活性高，其IC₅₀值能够达到0.256nM，安全性高，制备成本低廉、易于工业化批量生产，在作为治疗血栓性疾病的候选药物中具有很好的应用前景。

(2)本发明所述的化合物的合成工艺路线中所使用的起始物料为市售的活性天然物质香紫苏内酯。该反应路线中使用的试剂及物料均为常用市售产品，通过五步反应，由起始物料快速且高效的制备得到目标产物，具有良好的经济性，适合进行大规模工业化批量生产。

附图说明

图1是本发明所述的新型PAR-1抑制剂的¹H NMR(400MHz，CDCl₃)；

图2是本发明所述的新型PAR-1抑制剂的¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不限定本发明。

实施例中用到的所有原料除特殊说明外，均为市购。

实施例1

所述的新型PAR-1抑制剂(化合物I)的制备方法，具体步骤如下：

(1)化合物V的制备

称取8.40g香紫苏内酯置于圆底烧瓶中，依次加入143mL甲酸(99％)和6mL浓硫酸(93％)于室温下搅拌3h，接着用冰水淬灭反应，200mL乙醚萃取，有机相依次用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水淬洗，有机相加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压整去溶剂，得到白色固体化合物II。加入150mL四氢呋喃将其溶解。接着向圆底烧瓶中依次缓慢加入1M的六甲基二硅氮烷钾盐的四氢呋喃溶液50mL和5.6mL三甲氧基磷。最后通入氧气，于-78℃下反应，待反应结束后，体系降至室温，减压蒸去溶剂，得白色固体化合物III。将制备得到的化合物III用100mL无水四氢呋喃溶解后，置于冰水浴下降温至2.5±2.5℃。接着称取3.20g氢化铝锂缓慢加入于圆底烧瓶中，加毕，体系升至室温，并于室温下反应完全。反应结束后，用水淬灭反应，二氯甲烷稀释反应液后，硅藻土过滤，该操作重复三次。滤液合并后用饱和食盐水萃洗一次，酯相分出后无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸去溶剂，得白色固体化合物IV；接着将制备得到的化合物IV用540mL四氢呋喃溶解，于冰水浴环境下向体系内缓慢加入高碘酸钠溶液(将14.4g高碘酸钠溶于560mL纯化水配制而成)，加毕，体系升至室温，并于室温下反应完全。反应结束后，加入乙酸乙酯稀释反应液，依次用饱和硫代硫酸钠、饱和食盐水萃洗，酯相分出后无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸去溶剂，柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯)，得白色固体化合物V共5.98g，纯度：99.12％，收率：74.8％。

(2)化合物I的制备

取5.11g化合物VI置于烧瓶中，加入50mL无水四氢呋喃溶解，氮气保护。-78℃条件下滴加2.5M的正丁基锂的正己烷溶液6.25mL，加毕，体系于-78℃条件继续搅拌30min后，缓慢加入步骤(1)制备得到的化合物V的四氢呋喃溶液(3.14g化合物V溶于30mL无水四氢呋喃中)，搅拌30min后缓慢升至室温，并继续搅拌至反应结束，滴加饱和氯化铵溶液淬灭反应，加入乙酸乙酯，有机层水洗，硫酸镁干燥，过滤，减压蒸去溶剂，柱层析纯化，得白色固体化合物I共4.12g，纯度99.25％，收率：76.8％。

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.69(d,J＝1.6Hz,1H),7.73(dd,J＝8.2,2.2Hz,1H),7.40–7.32(m,2H),7.28(d,J＝7.8Hz,1H),7.20(d,J＝7.6Hz,1H),7.01(td,J＝8.4,1.5Hz,1H),6.84(dd,J＝15.8,10.3Hz,1H),6.45(d,J＝15.8Hz,1H),1.81(d,J＝13.3Hz,1H),1.70(d,J＝10.3Hz,1H),1.60–1.44(m,5H),1.38–1.24(m,3H),1.11(d,J＝9.4Hz,4H),1.04(d,J＝12.4Hz,3H),0.81(t,J＝10.3Hz,8H)。

¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.51,162.06,155.19,147.59,139.95(d,J＝7.8Hz,1C),134.85,133.89,133.31,130.64(d,J＝8.5Hz,1C),122.52(d,J＝2.8Hz,1C),120.81,114.89,114.68,113.89,113.67,72.38,63.79,55.64,42.32,42.08,40.91,38.32,33.60,33.49,31.81,21.86,18.43,18.27,16.12。

MALDI-TOFMSm/z:CalcdforC₂₇H₃₄FNOH[M+H]⁺408.7；Found408.2。

实施例2

所述的新型PAR-1抑制剂(化合物I)的制备方法，具体步骤如下：

(1)化合物V的制备

称取200g香紫苏内酯置于圆底烧瓶中，依次加入3.4L甲酸(99％)和143mL浓硫酸(93％)于室温下搅拌3h，接着用冰水淬灭反应，4.5L乙醚萃取，有机相依次用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水淬洗，有机相加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压整去溶剂，得到白色固体化合物II。加入3.4L四氢呋喃将其溶解。接着向圆底烧瓶中依次缓慢加入1M的六甲基二硅氮烷钾盐的四氢呋喃溶液1.2L和134mL三甲氧基磷。最后通入氧气，于-78℃下反应，待反应结束后，体系降至室温，减压蒸去溶剂，得白色固体化合物III；将制备得到的化合物III用48L无水四氢呋喃溶解后，置于冰水浴下降温至2±1℃。接着称取76.2g氢化铝锂缓慢加入于圆底烧瓶中，加毕，体系升至室温，并于室温下反应完全。反应结束后，用水淬灭反应，二氯甲烷稀释反应液后，硅藻土过滤，该操作重复三次。滤液合并后用饱和食盐水萃洗一次，酯相分出后无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸去溶剂，得白色固体化合物IV；接着将制备得到的化合物IV用13.2L四氢呋喃溶解，于冰水浴环境下向体系内缓慢加入高碘酸钠溶液(将342.2g高碘酸钠溶于13.4L纯化水配制而成)，加毕，体系升至室温，并于室温下反应完全。反应结束后，加入乙酸乙酯稀释反应液，依次用饱和硫代硫酸钠、饱和食盐水萃洗，酯相分出后无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸去溶剂，柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯)，得白色固体化合物V共153.4g，纯度：99.48％，收率：80.6％。

(2)化合物I的制备

取125.9g化合物VI置于烧瓶中，加入1.2L无水四氢呋喃溶解，氮气保护。-78℃条件下滴加2.5M的正丁基锂的正己烷溶液154mL，加毕，体系于-78℃条件继续搅拌30min后缓慢加入步骤(1)制备得到的化合物V的四氢呋喃溶液(77.3g化合物V溶于770mL无水四氢呋喃中)，搅拌30min后缓慢升至室温，并继续搅拌至反应结束，滴加饱和氯化铵溶液淬灭反应，加入乙酸乙酯，有机层水洗，硫酸镁干燥，过滤，减压蒸去溶剂，柱层析纯化，得白色固体化合物I共103.23g，纯度98.92％，收率：78.1％。

实施例3

化合物的生物活性(PAR-1抑制活性)测定

1.细胞培养

1.1细胞复苏

将HEK293-Gα15-PAR1细胞株(HDBiosciences稳转细胞株)从液氮罐内迅速取出，37℃水浴中不停摇晃，直到全部融化。迅速将细胞悬液加入预热的培养基(90％DMEM+10％FBS+1XPen/Strep)中，放入离心机，1000转/分钟，离心10分钟。将离心管取出，弃去上清液，向离心管内加入新鲜预热的培养基，重悬细胞，将细胞悬液加入培养皿，37℃，5％CO₂培养。

1.2传代

当细胞长满至培养皿80-90％，用0.05％胰酶-EDTA轻轻洗细胞，去除部分消化液后孵育2-3min，用新的培养基终止消化，枪头轻轻吹打细胞并将细胞重悬，通常情况下，每2-3天按1：4至1：8传代。

2.钙离子内流实验

2.1细胞板包被

实验前一天，在干净的384孔细胞板中加入1×Matrigel(Brand：BD，Cat#：356230)，在37℃孵育30分钟，然后500转/分倒置离心30秒，去除包被液。

2.2铺板

消化收集细胞沉淀，用培养基重悬至3×105细胞/mL，每孔50μL加入包被好的细胞板，后37℃，5％CO₂孵育过夜。

2.3缓冲液配制

实验当天，配制新鲜的实验缓冲液和0.5×Calcium4(Brand：MolecularDevices，Cat#：R8141)上样缓冲液。

2.4化合物的配制

先将30mM的DMSO储存液用DMSO稀释至10mM，后从10mM开始4倍倍比稀释，共10个浓度。将化合物的10个DMSO浓度梯度按1：20的比例加入到实验缓冲液中，制备成化合物的工作液(终反应浓度的5倍)。后将化合物的工作液转至384孔化合物板中待用。

阳性对照：将参照化合物SCH530348的40mMDMSO储存液稀释至2mM。

阴性对照：实验缓冲液配制的5％DMSO。

2.5PAR-1激动剂haTRAP的配制

用实验缓冲液将激动剂haTRAP的10mMDMSO储存液稀释至18μM(终反应浓度3μM的6倍)，后至少以25μL/孔转入384孔化合物板中待用。

2.6染料孵育

取出孵育过夜的细胞板，300转/分倒置离心30秒去除细胞培养基，每孔加入20μL新鲜配制的0.5×Calcium4上样缓冲液，后37℃，5％CO₂孵育1小时。

2.7加入化合物

按照布局从化合物板中转移5μL/孔的化合物工作液至细胞板中，然后再次置于37℃，5％CO₂孵育15分钟。

2.8加激动剂读取荧光信号

按FLIPR设置程序从384孔化合物板(FLIPR)转5μL/孔激动剂到细胞板，同时读取细胞板中每孔的荧光信号。

3.数据分析

根据每块细胞板上的阳性对照和阴性对照的荧光信号值计算该细胞板上每孔中化合物的抑制率(％)。阳性对照含有高浓度的参照化合物((100nM的SCH530348)，为100％抑制对照；阴性对照不含任何化合物，只有作为化合物溶剂的DMSO(1％DMSO)，为0％抑制对照。将计算所得抑制率和相对应的化合物浓度导入相关软件作图，并按照4-PL剂量效应公式计算出该化合物的IC₅₀值。参照化合物的IC₅₀结果亦是检验每次实验质量的标准之一。

化合物I的活性测定结果如表1所示。

表1化合物剂量效应结果

	SCH530348	化合物I
			Solpe	2.61	1.33
IC<sub>50</sub>(nM)	11.84	0.256

活性测定结果表明：化合物I具有显著的体外抗PAR-1活性，其IC₅₀值为0.256nM，达到纳摩尔级别，远远高于现有技术水平。

Claims (2)

1.一种新型PAR-1抑制剂，其特征在于：结构式如式(I)所示：

2.一种权利要求1所述的新型PAR-1抑制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)以香紫苏内酯为起始原料，在酸性环境下发生构型转化，制得式(II)所示的化合物；

2)式(II)所示的化合物经氧化在羰基α-位引入羟基，制得式(III)所示的化合物；

3)将式(III)所示的化合物中的羰基用LiAlH₄还原，制得式(IV)所示的化合物；

4)用NaIO₄将式(IV)所示的化合物中的邻二醇结构进行氧化裂解，制得式(V)所示的化合物；

5)在正丁基锂的作用下，使式(V)所示的化合物与式(VI)所示的化合物经维悌希反应，制得式(I)所示的化合物：

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