CN112745331B - 一种青藤碱生物素标记探针及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及有机合成及药物化学技术领域，特别涉及一种青藤碱生物素标记探针及其制备方法和用途。所述的青藤碱生物素标记探针为式I所示结构或其药学上可接受的盐，式I所示的化合物通过三步合成，且该标记探针应用在制备抗炎或抗肿瘤药物中。本发明的所涉及的该类分子一方面可作为一种研究青藤碱抗炎、抗肿瘤药物靶点的分子探针，探究青藤碱的作用靶点，有助于对青藤碱抗炎和抗肿瘤机制更加深入的了解，有助于找到更安全和更高效的抗炎以及抗肿瘤方法，另一方面，生物素标记的青藤碱探针本身也具有抗炎以及抗肿瘤作用，可以开发成为抗炎或抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明涉及有机合成及药物化学技术领域，特别涉及一种青藤碱生物素标记探针及其制备方法和用途。
背景技术
青藤碱来源于防己科植物青风藤及毛青藤的根茎，是一种具有广泛药理活性的生物碱单体。近年来随着研究人员对青藤碱的深入研究，发现青藤碱不仅具有抗炎、镇痛、降压、抗心律失常等作用，而且在抗肿瘤方面具有显著的效果。
目前，青藤碱的抗炎、抗肿瘤活性等被广泛关注，但其具体的作用靶点以及作用机制等尚不明确。
发明内容
为了解决上述问题，我们设计制备了含有生物素标记物的青藤碱探针分子，用于探究青藤碱可能的作用靶点蛋白和潜在作用机制。所有这些工作将为青藤碱的后续开发提供重要理论依据。
本发明通过设计合成青藤碱生物素标记探针并考察探针分子的抗炎、抗肿瘤活性，同时以探针为工具，研究青藤碱抗炎、抗肿瘤活性的潜在作用靶点蛋白，一旦潜在的靶标被发现后，再通过一系列的分子生物学实验来确证这些靶点蛋白及其生物学作用。
一种青藤碱生物素标记探针，所述的青藤碱生物素标记探针为式I所示结构或其药学上可接受的盐：
其中，X为NH或O；
R为C1～C5饱和或不饱和的烷基、含有羰基取代的C1～C8的含有醚键的烷基、C7～C8的含有羰基且含有取代亚芳基的烷基。
优选的，所述的标记探针选自如下化合物的一种或多种或其药学上可接受的盐：
前述所述标记探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)式1所示的化合物与式2所示的化合物在碱性条件下反应得到式3所示的化合物；
(2)式4所示的化合物经酰氯化得到式5所示的化合物；
(3)式3所示的化合物与式5所示的化合物在-10℃～10℃，弱碱性条件下反应得到式I所示的标记探针。
优选的，所述步骤(3)中的弱碱选自三乙胺。
优选的，所述步骤(3)在有机溶剂中进行反应，所述有机溶剂选自二氯甲烷、乙腈、二甲基甲酰胺。
前述任一项所述的标记探针在制备抗炎或抗肿瘤药物中的应用。
优选的，所述的肿瘤选自胃癌、肝癌、肺癌或脑胶质瘤，所述的抗炎中的炎症选自肾炎。
优选的，所述肾炎选自肾小球系膜细胞炎症。
优选的，所述肾炎选自系膜增生性肾小球肾炎或脂多糖诱导肾小球系膜细胞炎症。
有益效果
本发明所涉及的青藤碱生物素标记探针分子可作为一种研究青藤碱抗炎、抗肿瘤药物靶点的分子探针，探究青藤碱的作用靶点，有助于对青藤碱抗炎和抗肿瘤机制更加深入的了解，有助于找到更安全和更高效的抗炎以及抗肿瘤方法；
本发明所涉及的青藤碱生物素标记探针分子合成方法简单，无需极端条件即可得到产物；
生物素标记的青藤碱探针本身也具有抗炎以及抗肿瘤作用，可以开发成为抗炎或抗肿瘤药物，疗效好，毒副作用小。
附图说明
图1本发明实施例9Q1-Q5抗脂多糖(LPS)诱导肾小球系膜细胞炎症因子的生成。
图2本发明实施例10通过生物素pull-down鉴定PKC-α为青藤碱的潜在靶点蛋白。
图3本发明实施例11中Q1-Q5抗大鼠系膜增生性肾小球肾炎肾组织炎症因子的生成
图4本发明实施例12中Q1-Q5减轻大鼠系膜增生性肾小球肾炎肾组织增生病变
图5本发明实施例13中Q1-Q5抑制大鼠系膜增生性肾小球肾炎肾组织尿蛋白的分泌
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面结合实施例对本发明进行详细说明，以方便本领域技术人员理解本发明。
实施例1
4-羟丙基青藤碱的制备
将青藤碱(300mg，0.91mmol)溶于丙酮(10mL)中，加入K2CO3(878mg，4.55mmol)和3-溴丙醇(247μL，2.73mmol)，在60℃下反应16h。旋干丙酮，用二氯甲烷萃取三次，合并有机层，用饱和食盐水洗一次，无水Na2SO4干燥，浓缩，柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝50∶1)，得白色固体产品(137mg，38.8％)。将所得产品进行谱图实验，所得氢谱和质谱数据为：1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ6.70(d，J＝7.5Hz，1H)，6.66(dt，J＝7.5，1.0Hz，1H)，6.06(dd，J＝6.2，1.6Hz，1H)，4.23-4.14(m，2H)，4.18-4.10(m，1H)，3.83(s，3H)，3.88-3.78(m，1H)，3.70(s，3H)，3.69(dq，J＝12.2，6.9Hz，1H)，3.38(dddt，J＝8.7，7.1，5.4，1.7Hz，1H)，3.07-2.98(m，2H)，2.96-2.84(m，2H)，2.78-2.61(m，3H)，2.34(d，J＝1.4Hz，3H)，2.15-1.94(m，4H).ESI-MS(m/z)426.1[M+K]+.
实施例2：
生物素酰氯的制备
将生物素(200mg，0.82mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，向其中加入DMF(12.7μL，0.16mmol)，加入草酰氯(208μL，0.82mmol)，在40℃下反应6h，反应完全后，浓缩，得黄色固体产品。将所得产品进行谱图实验，所得氢谱和质谱数据为：1H NMR (500MHz，Chloroform-d)δ6.33(d，J＝7.7Hz，1H)，6.05(d，J＝7.0Hz，1H)，4.45-4.36(m，1H)，4.21(q，J＝7.0Hz，1H)，3.10(qd，J＝7.0，0.7Hz，1H)，2.86(dd，J＝12.4，7.1Hz，1H)，2.85-2.72(m，3H)，1.75-1.42(m，6H).ESI-MS(m/z)263.05[M+H]+.
实施例3：
生物素-4-羟丙基青藤碱(Q1)的制备：
实施例2所得产品4-羟丙基青藤碱(100mg，0.26mmol)溶解在二氯甲烷(2mL)中，冰浴下加入三乙胺(7.2μL，0.052mmol)，向其中滴加实施例1所得产品生物素酰氯的二氯甲烷溶液(1mL)，冰浴下搅拌0.5h，室温反应3h。反应液浓缩后柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1-10∶1)，得黄色固体产品(16mg，10.1％)。将所得产品进行谱图实验，所得氢谱和质谱数据为：1H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ6.74-6.69(m，2H)，5.50(d，J＝2.2Hz，1H)，4.27-4.16(m，2H)，4.13(s，1H)，4.08(s，1H)，3.94-3.89(m，2H)，3.79(s，3H)，3.77-3.75(m，3H)，3.54(s，2H)，3.52(s，2H)，3.49(s，3H)，3.17(s，1H)，3.03-2.97(m，3H)，2.78-2.70(m，2H)，2.52(d，J＝15.9Hz，2H)，2.43(s，3H)，2.07(s，3H)，1.86-1.82(m，2H)，1.68(s，1H).ESI-MS m/z：614.4[M+H]+.
实施例4：
生物素青藤碱(Q2)的制备：
参考Q1的合成方法，工艺条件和用量保持不变，仅改变初始原料，最终得到黄色固体产品Q2。将所得产品进行谱图实验，所得氢谱和质谱数据为：1H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ7.70(br，1H)，6.64-6.70(m，2H)，5.58(d，J＝2.2Hz，1H)，4.18-4.26(m，2H)，4.18(s，1H)，4.04(s，1H)，3.98(m，2H)，3.73(s，3H)，3.72-3.76(m，3H)，3.55(s，2H)，3.52(s，2H)，3.45(s，3H)，3.24(s，1H)，3.01-3.07(m，3H)，2.71-2.77(m，2H)，2.50(d，J＝15.9Hz，2H)，2.41(s，3H)，2.09(s，3H)，1.81-1.87(m，2H)，1.62(s，1H).ESI-MS m/z：613.4[M+H]+.
实施例5：
生物素青藤碱(Q3)的制备：
参考Q1的合成方法，工艺条件和用量保持不变，仅改变初始原料，得黄色固体Q3。将所得产品进行谱图实验，所得氢谱和质谱数据为：1H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ7.78(br，1H)，6.69-6.73(m，2H)，5.59(d，J＝2.2Hz，1H)，4.12-4.16(m，2H)，4.10(s，1H)，4.05(s，2H)，4.04(s，1H)，3.98(m，2H)，3.80-2.89(m，4H)，3.74(s，3H)，3.71-3.73(m，3H)，3.59(s，2H)，3.45(s，2H)，3.41(s，3H)，3.24(s，1H)，3.00-3.04(m，3H)，2.63-2.68(m，2H)，2.47(d，J＝15.9Hz，2H)，2.45(m，2H)，2.40(s，3H)，1.98(s，3H)，1.75-1.77(m，2H)，1.51(s，1H).ESI-MS m/z：713.3[M+H]+.
实施例6：
生物素青藤碱(Q4)的制备：
参考Q1的合成方法，工艺条件和用量保持不变，仅改变初始原料，得黄色固体Q4。将所得产品进行谱图实验，所得氢谱和质谱数据为：1H NMR(300MHz，Chlorofbrm-d)δ7.72(s，1H)，7.15-7.20(m，2H)，6.60-6.68(m，2H)，5.34(d，J＝2.1Hz，1H)，5.03(s，2H)，4.22-4.26(m，2H)，4.19(s，1H)，4.15(s，2H)，4.03(s，1H)，4.00(m，2H)，3.80-2.89(m，4H)，3.74(s，3H)，3.70-3.72(m，3H)，3.45(s，2H)，3.41(s，3H)，3.24(s，1H)，3.00-3.04(m，3H)，2.63-2.68(m，2H)，2.47(d，J＝15.9Hz，2H)，2.42(s，3H)，1.93(s，3H)，1.71-1.73(m，2H)，1.52(s，1H).ESI-MS m/z：798.3[M+H]+.
实施例7：
生物素青藤碱(Q5)的制备：
参考Q1的合成方法，工艺条件和用量保持不变，仅改变初始原料，得黄色固体Q5。将所得产品进行谱图实验，所得氢谱和质谱数据为：1H NMR(300MHz，Chloroform-d)δ6.71-6.76(m，2H)，6.18，5.58(d，J＝15.0Hz，2H)，5.54(d，J＝2.1Hz，1H)，4.20-4.21(m，2H)，4.19(s，1H)，4.08(s，1H)，4.00(m，2H)，3.79(s，3H)，3.71-3.73(m，3H)，3.54(s，2H)，3.51(s，2H)，3.40(s，3H)，3.29(s，1H)，3.05-3.09(m，3H)，2.70-2.74(m，2H)，2.58(d，J＝15.9Hz，2H)，2.49(s，3H)，2.01(s，3H)，1.83-1.89(m，2H)，1.61(s，1H).ESI-MS m/z：640.3[M+H]+.
实施例8 Q1-Q5抗肿瘤活性
1.细胞消化、计数、制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入200μl细胞悬液(每孔1×104个细胞)；
2. 96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
3.用完全培养基稀释药物至所需浓度，置换原有的细胞培养基(每孔200μl)，同时设立调零组(不加细胞)、溶剂对照组(用DMSO替代药物)；
4. 96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养72小时；
5.将96孔板进行MTT染色，λ＝490nm，测定OD值。
1)每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，在培养箱继续培养4小时；
2)弃去培养基，每孔加入150μL DMSO溶解，摇床10分钟轻轻混匀；λ＝490nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算细胞死亡率。
细胞死亡率(％)＝100％-100％×(实验组OD值-调零组OD值)/(溶剂对照组OD值-调零组OD值)
以药物浓度为X轴，细胞死亡率为Y轴，绘制药物剂量-杀伤曲线，计算细胞死亡率为50％时的药物浓度，即IC50值。
实验结果
表1 Q1-Q5及青藤碱对体外4种肿瘤细胞生长的影响(IC50：单位mM)
结论：Q1-Q5均能抑制人胃癌细胞MGC-803、人肝癌细胞Bel-7402、人肺癌细胞A549、人胶质瘤细胞U251的生长，其效果与青藤碱相比无显著差异。提示，此种生物素标记法对青藤碱的抗肿瘤功能无明显影响。
实施例9：Q1-Q5抗脂多糖(LPS)诱导肾小球系膜细胞炎症因子的生成
1.细胞消化、计数、制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，6孔板中每孔加入2mL细胞悬液(每孔2×105个细胞)；
2. 6孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
3.用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入2mL相应的含药培养基(同时加入LPS)，同时设立溶剂对照组1(加DMSO，不加LPS)、溶剂对照组2(加DMSO和LPS)；
4. 6孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养6小时；
5.收集细胞培养上清，实验ELISA法检测TNF-α和IL-6的分泌水平。
实验结果如图1所示，可以看出，Q1-Q5均能抑制LPS刺激肾小球系膜细胞后诱导的促炎因子TNF-α和IL-6生成，其效果与青藤碱相比无显著差异。也即，此种生物素标记法对青藤碱的抗炎功能无明显影响。
实施例10 Q1与肾小球系膜细胞中PKC蛋白相互结合(pull-down实验)
1.细胞消化、计数、制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，6孔板中每孔加入2mL细胞悬液(每孔2×105个细胞)；
2. 6孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
3.用完全培养基稀释Q1至所需浓度，每孔加入2mL相应的含Q1培养基，同时设立对照组(加生物素，不加Q1)；
4. 6孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养1小时；
5.收集细胞裂解液，与链霉亲和素-磁珠共孵育，4℃，1小时；
6.磁珠纯化的蛋白，Western blot检测其PKC含量，并与对照组(即加生物素，不加Q1)相比，计算相对倍数。实验结果如图2所示，可以看出Q1可与肾小球系膜细胞中PKC蛋白相互结合，提示PKC-α为青藤碱的潜在靶点蛋白。同时也表明，生物素标记的青藤碱能够作为分子探针，检查青藤碱与细胞内靶蛋白的相互结合。
实施例11 Q1-Q5抗大鼠系膜增生性肾小球肾炎肾组织炎症因子的生成
1.SD大鼠腹腔分别注射青藤碱(100mg/kg)、Q1-Q5(100mg/kg)，同时设立溶剂对照组(加DMSO，不加青藤碱或Q1-Q5)，每天注射一次，连续四天；
2.于第四次注射青藤碱或Q1-Q5后半小时，经过尾静脉注射兔抗大鼠Thy-1抗原的抗体(Thy-1抗体，1ml/100g)；
3.注射Thy-1抗体后6h取大鼠肾脏，提取肾组织蛋白，ELISA法检测TNF-α和IL-6的分泌水平。
检测结果如图3所示，从图中可以看出Q1-Q5均能抑制大鼠Thy-1肾炎肾组织促炎因子TNF-α和IL-6生成，其效果与青藤碱相比无显著差异。可以得到结论，此种生物素标记法对青藤碱的抗肾脏炎症因子生成的功能无明显影响。
实施例12 Q1-Q5减轻大鼠系膜增生性肾小球肾炎肾组织增生病变
1.SD大鼠分别腹腔注射青藤碱(100mg/kg)、Q1-Q5(100mg/kg)，同时设立溶剂对照组(加DMSO，不加青藤碱或Q1-Q5)，每天注射一次，连续四天；
2.于第四次注射青藤碱或Q1-Q5后半小时，经过尾静脉注射兔抗大鼠Thy-1抗原的抗体(Thy-1抗体，1ml/100g)；
3.SD大鼠分别腹腔注射青藤碱(100mg/kg)、Q1-Q5(100mg/kg)，同时设立溶剂对照组(加DMSO，不加青藤碱或Q1-Q5)，每天注射一次，连续三天；
4.于注射Thy-1抗体7d后取大鼠肾脏，提取肾组织蛋白，HE染色检查大鼠肾组织增生病变。
实验结果如图4所示，从图中可以看出Q1-Q5均能减轻大鼠Thy-l肾炎肾组织增生病变，其效果与青藤碱相比无显著差异。可以得到结论，此种生物素标记法对青藤碱的抗系膜增生性肾小球肾炎功能无明显影响。
实施例13 Q1-Q5抑制大鼠系膜增生性肾小球肾炎肾组织尿蛋白的分泌
1.SD大鼠腹腔注射青藤碱(100mg/kg)、Q1-Q5(100mg/kg)，同时设立溶剂对照组(加DMSO，不加青藤碱或Q1-Q5)，每天注射一次，连续四天；
2.于第四次注射青藤碱或Q1-Q5后半小时，经过尾静脉注射兔抗大鼠Thy-1抗原的抗体(Thy-1抗体，1ml/100g)；
3.SD大鼠腹腔注射青藤碱(100mg/kg)、Q1-Q5(100mg/kg)，同时设立溶剂对照组(加DMSO，不加青藤碱或Q1-Q5)，每天注射一次，连续三天；
4.于注射Thy-1抗体7d后收集大鼠24h尿液，检测尿蛋白含量。
实验结果如图5所示，从图中可以看出Q1-Q5均能抑制大鼠Thy-1肾炎发病7d时24h尿蛋白分泌量，其效果与青藤碱相比无显著差异。可以得出结论，此种生物素标记法对青藤碱的抗系膜增生性肾小球肾炎尿蛋白产生(即肾损伤指标)无明显影响。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种青藤碱生物素标记探针，其特征在于，所述的标记探针选自如下化合物的一种或多种或其药学上可接受的盐：
2.一种如权利要求1所述标记探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
其中，X为NH或O；R为
(1)式1所示的化合物与式2所示的化合物在碱性条件下反应得到式3所示的化合物；
(2)式4所示的化合物经酰氯化得到式5所示的化合物；
(3)式3所示的化合物与式5所示的化合物在-10℃～10℃，弱碱性条件下反应得到如权利要求1所示的标记探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的弱碱选自三乙胺。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)在有机溶剂中进行反应，所述有机溶剂选自二氯甲烷、乙腈、二甲基甲酰胺。
5.一种根据权利要求1所述的标记探针在制备抗炎或抗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤选自胃癌、肝癌、肺癌或脑胶质瘤，所述的抗炎中的炎症选自肾炎。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肾炎选自肾小球系膜细胞炎症。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肾炎选自系膜增生性肾小球肾炎或脂多糖诱导肾小球系膜细胞炎症。
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