CN112739380A - 以受体蛋白作为靶点的治疗药物、检测药物、与受体蛋白结合的抗体以及分子靶向药物的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

从胃癌长期无复发组和复发转移组的基因表达分析中，将CHRNB2和NPTXR鉴定为药物发现靶点。通过将CHRNB2、NPTXR作为靶点的抗体药物、核酸药物，能够抑制肿瘤生长。此外，提供与CHRNB2、NPTXR结合的多克隆抗体和单克隆抗体。由于这些受体分子是新的分子靶点，因此可以治疗现有治疗药物未能奏效的病例。

Description

以受体蛋白作为靶点的治疗药物、检测药物、与受体蛋白结合 的抗体以及分子靶向药物的筛选方法
技术领域
本发明涉及以受体蛋白作为靶点的治疗药物和检测药物。涉及将在癌细胞表面大量表达的受体以及承担该受体下游信号的信号传递系统作为靶点的靶点药物，特别涉及针对受体蛋白的抗体药物、核酸药物。进而，涉及给予上述分子靶向药物时的伴随诊断剂、或预测复发等预后的检测药物。另外，本发明涉及以受体蛋白为靶点的药物的筛选方法。
背景技术
胃癌是全世界患病数排名第四、癌症相关死亡数排名第二的癌症(2012年统计)。胃癌是日本、中国、韩国等亚洲、南美较多的癌症，根据日本癌症患者的统计，胃癌新增患病人数为133000人(第三)，死亡人数为49400人(第三)(2015年统计)，是患病率较高且需要优先克服的重要疾病。
在日本，由于癌症检查的普及，早期发现的病例增加，因此胃癌的死亡率有减少的趋势。但是，由于早期胃癌几乎没有症状，因此现在也多被发现为进行性胃癌，成为死亡人数多的原因。作为对不能切除的进行性复发胃癌的一次治疗，S-1(替加氟·吉美拉西·奥替拉西钾配合剂)和顺铂的并用疗法在日本被确立为标准疗法。此外，针对HER2(人表皮生长因子受体2)阳性病例，作为抗HER2抗体的曲妥珠单抗成为标准治疗药物。另外，作为抗VEGFR-2(血管内皮生长因子受体-2)抗体的雷莫昔单抗的二次治疗，还批准了作为免疫检查点抑制剂的抗PD-1抗体的尼沃单抗(非专利文献1、2)。
相对于以往的抗癌剂以通过细胞损伤来杀死癌细胞为目标，抗体药物这样的分子靶向药物以在癌细胞中过度表达的分子为靶点，因此作用机制不同。其结果是，对于至今未取得效果的患者也很有可能取得效果。胃癌的分子靶向治疗药物也正在进行新的抗体药物的开发(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2017-511342号公报。
非专利文献
非专利文献1：Apicella M.，et al.，Oncotarget.2017，Vol.8(34)，p.57654-57669.doi:10.18632/oncotarget.14825.PMID：28915702；
非专利文献2：大沼启之，北海道外科杂志，2017年，Vol.62，No.1，p.23-28；
非专利文献3：Bartolini，A.，et al.，2015，Cancer Res.Vol.75(20)，p.4265-4271。
发明内容
发明要解决的问题
但是，目前对于进行性胃癌只能使用HER2、VEGF(vascular endothelial growthfactor，血管内皮生长因子)等以有限的生长因子为靶点的药物。HER2阳性胃癌约占进行性胃癌、复发胃癌的20％左右，曲妥珠单抗仅对HER2阳性胃癌有效。另外，新批准的免疫检查点抑制剂尼沃单抗的疗效也停留在20％左右，这产生了治疗的界限。另外，在美国被批准用于治疗进行性胃癌的雷莫昔单抗的预后延长效果并不是很大。因此，能够从完全不同的机制控制胃癌进展的抑制药创制对于改善治疗成绩是必须的。
本发明的目的在于，通过鉴定与胃癌进展相关的分子，找出能够成为靶点的分子，提供靶向治疗药物。另外，如果是成为靶点的分子所表达的癌细胞，则认为可以通过同样的作用机制来发挥效果，因此期待不仅对胃癌而且对其他癌症也具有效果。
用于解决问题的手段
本发明涉及以下分子靶向药物、抗体、检测药物和分子靶向药物的筛选方法。
(1)一种分子靶向治疗药物，含有对CHRNB2(Cholinergic Receptor NicotinicBeta 2Subunit，烟碱型胆碱受体β2亚单元)表达进行中和或抑制的物质作为有效成分。
(2)如(1)所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，所述有效成分是抗体或核酸。
(3)如(1)或(2)所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，所述有效成分对CHRNB2的WKPEEFDNMKKVRLPSKH(序列号8)或TFLHSDHSAPSSK(序列号9)中任一种进行识别。
(4)如(3)所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，所述有效成分是抗体。
(5)如(4)所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，所述抗体由以受托编号NITE P-02857表示的杂交瘤产生。
(6)如(1)或(2)所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，所述有效成分是针对CHRNB2的siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、适配体或诱饵。
(7)如(1)至(6)中任一项所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，所述分子靶向治疗药物的目标疾病为胃癌、大肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、食道癌。
(8)一种单克隆抗体，由以受托编号NITE P-02857表示的杂交瘤产生。
(9)一种杂交瘤，以受托编号NITE P-02857表示。
(10)一种检测试剂盒，包含：对CHRNB2进行识别的抗体、或对CHRNB2的mRNA表达进行定量的引物、以及测定中所需的试剂。
(11)如(10)所述的检测试剂盒，其特征在于，对所述CHRNB2进行识别的抗体对CHRNB2的WKPEEFDNMKKVRLPSKH(序列号8)或TFLHSDHSAPSSK(序列号9)中任一种进行识别。
(12)如(10)所述的检测试剂盒，其特征在于，对所述CHRNB2进行识别的抗体由以受托编号NITE P-02857表示的杂交瘤产生。
(13)如(10)所述的检测试剂盒，其特征在于，用于定量所述CHRNB2的mRNA的引物是由序列号1和序列号2表示的引物。
(14)一种分子靶向药物的筛选方法，将被测物质与CHRNB2的细胞表面所暴露的区域的结合性作为指标。
(15)一种筛选分子靶向药物的方法，在被测物质存在下培养细胞，通过以CHRNB2的表达为指标筛选分子靶向药物。
(16)一种分子靶向治疗药物，含有对NPTXR(Neuronal pentraxin receptor，神经元五种毒素受体)表达进行中和或抑制的物质作为有效成分。
(17)如(16)所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，所述有效成分是抗体或核酸。
(18)如(16)或(17)所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，所述有效成分对NPTXR的CESGLPRGLQGAGPRRDT(序列号10)或KERVALSHSSRRQRQEVE(序列号11)中任一种进行识别。
(19)如(18)所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，所述有效成分是抗体。
(20)如(19)所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，所述抗体由以受托编号NITEP-02856表示的杂交瘤产生。
(21)如(16)或(17)所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，所述有效成分是针对NPTXR的siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、适配体或诱饵。
(22)如(16)至(21)中任一项所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，所述分子靶向治疗药物的目标疾病为胃癌、大肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、食道癌。
(23)一种抗体，对NPTXR的CESGLPRGLQGAGPRRDT(序列号10)或KERVALSHSSRRQRQEVE(序列号11)进行识别。
(24)一种单克隆抗体，由以受托编号NITE P-02856表示的杂交瘤产生。
(25)一种杂交瘤，以受托编号NITE P-02856表示。
(26)一种抗体，对由序列号12(GLPRGLQGAGPRRDT)表示的表位进行识别。
(27)一种检测试剂盒，包含：对NPTXR进行识别的抗体、或对NPTXR的mRNA表达进行定量的引物、以及测定中所需的试剂。
(28)如(27)所述的检测试剂盒，其特征在于，对所述NPTXR进行识别的抗体对CESGLPRGLQGAGPRRDT(序列号10)或KERVALSHSSRRQRQEVE(序列号11)中的任一种进行识别。
(29)如(27)所述的检测试剂盒，其特征在于，对所述NPTXR进行识别的抗体由以受托编号NITE P-02856表示的杂交瘤产生。
(30)如(27)所述的检测试剂盒，其特征在于，对所述NPTXR的mRNA表达进行定量的引物为序列号3和序列号4。
(31)一种分子靶向药物的筛选方法，将被测物质与NPTXR的细胞表面所暴露的区域的结合性作为指标。
(32)一种筛选分子靶向药物的方法，在被测物质存在下培养细胞，通过以NPTXR表达为指标来筛选分子靶向药物。
(33)一种治疗方法，其特征在于，使用(1)至(7)所述的分子靶向治疗药物。
(34)如(33)所述的治疗方法，其特征在于，以CHRNB2表达高的肿瘤为对象。
(35)如(34)所述的治疗方法，其特征在于，使用(10)至(13)所述的检测试剂盒检测CHRNB2表达。
(36)一种治疗方法，其特征在于，使用(16)至(22)所述的分子靶向治疗药物。
(37)如(36)所述的治疗方法，其特征在于，以NPTXR表达高的肿瘤为对象。
(38)如(37)所述的治疗方法，其特征在于，使用(27)至(30)所述的检测试剂盒检测NPTXR表达。
发明效果
由于是与目前治疗中使用的抗癌剂作用机制不同的治疗药物，因此，对于在迄今为止的治疗中未能奏效的患者也有望具有效果。
附图说明
图1是分析胃癌细胞株中的CHRNB2、NPTXR的mRNA表达的图。
图2是使用CHRNB2敲除细胞进行CHRNB2的功能分析的图，(A)表示细胞增殖能力的分析结果，(B)表示凋亡比率的分析结果，(C)表示迁移能力的分析结果，(D)表示侵袭能力的分析结果，(E)表示粘附能力的分析结果。
图3是使用NPTXR敲除细胞进行NPTXR的功能分析的图，(A)表示细胞增殖能力的分析结果，(B)表示凋亡比率的分析结果，(C)表示迁移能力的分析结果，(D)表示侵袭能力的分析结果，(E)表示粘附能力的分析结果。
图4是表示NPTXR表达对凋亡途径的影响的分析结果的图，(A)是表示线粒体去极化的图，(B)是表示半胱天冬酶活性的分析结果的图，(C)是表示代表性的半胱天冬酶家族分子的活性的分析结果的图。
图5是分析NPTXR表达对细胞周期的影响的图，(A)是表示通过细胞分选仪进行的分析结果的图，(B)是表示通过显微镜观察进行的分析结果的图。
图6是表示NPTXR表达对癌干细胞性的影响的分析结果的图。
图7是表示NPTXR表达对细胞增殖的影响的分析结果的图，(A)是表示对癌细胞的增殖产生影响的PI3K路径的分析结果的图，(B)是表示对抗癌剂5-FU敏感性的分析结果的图。
图8的(A)是表示小鼠皮下肿瘤模型中的CHRNB2敲除细胞的造瘤能力的分析结果的图，(B)是表示小鼠皮下肿瘤模型中的NPTXR敲除细胞的造瘤能力的分析结果的图。
图9是表示抗CHRNB2抗体、抗NPTXR抗体对细胞增殖的效果的分析结果的图。
图10是表示抗CHRNB2抗体在小鼠腹膜接种模型中的效果的分析结果的图。
图11是表示抗NPTXR抗体在小鼠腹膜接种模型中的效果的分析结果的图。
图12是表示抗CHRNB2单克隆抗体对细胞增殖的效果的分析结果的图。
图13是表示抗CHRNB2单克隆抗体腹膜内给予的腹膜接种治疗效果的分析结果的图。
图14是研究抗NPTXR单克隆抗体对细胞增殖的效果的图，(A)是表示使用MKN1细胞的分析结果的图，(B)是表示除了MIKN1细胞以外，还使用来自各种脏器的癌细胞株的分析结果的图。
图15是表示抗NPTXR单克隆抗体腹膜内给予的腹膜接种治疗效果的分析结果的图。
图16的(A)是表示CHRNB2的siRNA(Small interfering RNA，小干扰RNA)对细胞增殖的效果的分析结果的图，(B)是表示NPTXR的siRNA对细胞增殖的效果的分析结果的图。
图17是分析胃癌患者中的CHRNB2表达的图，(A)是表示基于阶段的mRNA表达量的图，(B)是表示针对复发/死亡的mRNA表达量的ROC曲线分析的图，(C)是表示计算出的截止值与预后的关系的图，(D)是表示胃癌组织中的蛋白质表达的分析结果的图。
图18是分析胃癌患者中的NPTXR表达的图，(A)是表示基于阶段的mRNA表达量的图，(B)是表示针对复发/死亡的mRNA表达量的ROC曲线分析的图，(C)是表示计算出的截止值与预后的关系的图，(D)是表示胃癌组织中的蛋白质表达的分析结果的图。
图19是表示胃癌患者组织中的NPTXR的各阶段的mRNA表达量的分析结果的图。
图20表示对各种器官/正常组织中的表达分布进行分析的结果，(A)是表示CHRNB2表达分布的图，(B)是表示NPTXR表达分布的图。
图21是表示大肠中的表达分析结果的图，(A)表示CHRNB2表达分布，(B)表示NPTXR表达分布。
图22是表示乳腺中的表达分析结果的图，(A)表示CHRNB2表达分布，(B)表示NPTXR表达分布。
图23是表示肺中的表达分析结果的图，(A)表示CHRNB2表达分布，(B)表示NPTXR表达分布。
图24是表示胰腺中的表达分析结果的图，(A)表示CHRNB2表达分布，(B)表示NPTXR表达分布。
图25是表示食道中的表达分析结果的图，(A)表示CHRNB2表达分布，(B)表示NPTXR表达分布。
具体实施方式
本发明人为了鉴定与胃癌进展有关的分子，根据经过对胃切除术后的病例进行分类，以从胃癌原发灶组织得到的mRNA(信使RNA)为对象，使用下一代测序仪进行了全面的表达分析。结果表明，作为受体分子的CHRNB2和NPTXR是与胃癌进展相关的分子。
根据公开数据库GeneCards，CHRNB2和NPTXR都是在脑等神经系统器官中表达高的基因。CHRNB2在包括胃在内的其他脏器中表达不太高，各脏器间也没有发现差异。另外，NPTXR在神经系统以外的脏器中也同样发现表达，但在脏器间没有发现表达的差异。另外，关于这些基因的功能，虽然得到了提示NPTX/NPTXR参与神经母细胞瘤的结果(非专利文献3)，但关于CHRNB2，与以胃癌为首的肿瘤的关联和肿瘤中的作用，至今为止还没有报告，尚不明确。另外，关于NPTXR，如上所述，虽然有关于神经母细胞瘤的报告，但没有关于其他癌种的报告，关于在上皮性肿瘤中的作用也不清楚。
本发明人进行分析的结果，明确了这些受体分子与肿瘤发展的关系、在肿瘤中的作用。另外，在这些分子的中和抗体和抑制表达的核酸中，发现了肿瘤细胞的增殖抑制和抗肿瘤活性。因此，抑制CHRNB2和NPTXR蛋白的功能或抑制基因表达的物质作为分子靶向治疗药物而发挥作用。
如下所示，在实施例中，作为对CHRNB2和NPTXR表达进行中和或抑制的物质，使用抗体、siRNA(Small interfering RNA，小干扰RNA)。但是，不仅是这些抗体和siRNA，也可以使用对CHRNB2和NPTXR表达进行中和或抑制的任何物质。
另外，在对CHRNB2和NPTXR表达进行中和或抑制的物质中发现了肿瘤细胞的增殖抑制或抗肿瘤活性，因此也可以筛选以CHRNB2或NPTXR为靶点的治疗药物。
具体而言，只要评价与CHRNB2或NPTXR的细胞表面所暴露的区域的结合性即可。CHRNB2或NPTXR的细胞表面所暴露的区域可以通过分析蛋白质的立体结构的程序来预测。例如，由于认为序列号8～11表示的肽暴露在细胞表面上，因此可以通过评价与这些肽的结合性来进行筛选。
另外，由于在抑制CHRNB2或NPTXR的表达的物质中确认到效果，因此也可以以CHRNB2或NPTXR的表达为指标，筛选分子靶向药物。具体而言，在候选物质存在下，培养表达CHRNB2或NPTXR的细胞，对CHRNB2或NPTXR的mRNA或蛋白质进行定量，研究候选物质的效果即可。基因表达、蛋白质表达可以使用公知的方法，例如，基因表达可以通过RT-PCR(反向transcription-Polymerase Chain Reaction，反转录-聚合酶链式反应)测定，蛋白质表达可以通过ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定)等测定。
本发明中的抗CHRNB2抗体和抗NPTXR抗体是指与CHRNB2或NPTXR结合的免疫球蛋白分子。此外，如下所示，本发明人不仅已经获得了针对CHRNB2和NPTXR的多克隆抗体，而且已经获得了单克隆抗体。利用基因重组技术将这些单克隆抗体制成人型嵌合抗体、人源化CDR(Complementarity-determining Region，互补决定区)移植抗体等的人源化抗体、使用基因改造小鼠的人抗体也包含在本发明的抗体中。人源化抗体、人抗体给予于人时，与人以外的动物的抗体相比副作用少，其治疗效果长时间持续。另外，Fab、Fab'、(Fab')2、Fv片段等抗体片段、直链状抗体、单链Fv(scFv)、双重特异性抗体等也包含在本发明的范围内。
此外，还对抗NPTXR单克隆抗体进行了表位分析。“表位”是指由抗体识别的抗原的一部分，是指包含本说明书中公开的抗体可变区的结构域所结合的抗原上的部位。在将NPTXR这样多肽作为抗原的情况下，抗体可以识别直线的氨基酸序列，也可以识别三维的立体结构，表位可以由氨基酸序列或抗原结构来定义。关于与相同表位结合的抗体，由于认为具备同样的性质，因此对于抗NPTXR单克隆抗体，也可以通过表位序列来规定。
另外，作为核酸药物，不仅是以下实施例所示的siRNA，只要是抑制CHRNB2或NPTXR基因的表达的物质即可，并不限于siRNA，也包括如miRNA(micro RNA，微小RNA)、反义寡核苷酸那样的抑制mRNA(信使RNA)表达的物质。它还包括如适配体、诱饵(decoy)等抗体那样与CHRNB2或NPTXR蛋白结合并中和其活性的核酸。
此外，也可以是通过抑制位于CHRNB2或NPTXR受体下游的信号传递系统来使来自这些受体的信号无效的药剂。例如，如下所示，作为NPTXR下游的信号，确认了PI3K/Akt信号路径的存在。因此，在NPTXR高表达的肿瘤治疗中，通过将PI3K/Akt抑制剂单独用于治疗，或者与对NPTXR表达进行中和或抑制的分子靶向治疗药物并用，有可能增强效果。
另外，在给予对CHRNB2或NPTXR表达进行中和或抑制的分子靶向治疗药物的情况下，为了不进行无用的治疗，也需要预先调查CHRNB2或NPTXR的表达。关于CHRNB2和NPTXR的表达，如下所示，可以通过PCR或抗体的免疫组织化学染色来检测。为了测定表达，可以将PCR中使用的引物组或抗体、及测定所需的试剂组合作为检测试剂盒。CHRNB2和NPTXR的表达与预后也有很深的相关性，因此也可以使用这些检测试剂盒进行预后预测。
以下所示的数据是从胃癌的分析中得到的，但是以CHRNB2和NPTXR为靶点的分子靶向治疗药物不仅适用于胃癌，还可以适用于将CHRNB2和NPTXR高表达的各种癌种，或者将CHRNB2和NPTXR过量表达的疾病。
根据TCGA(THE CANCER GENOME ATLAS，癌症基因组图谱)癌症基因组数据库，CHRNB2在急性髓性白血病、乳腺癌、胆管癌、神经胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、肺癌、恶性黑色素瘤、恶性间皮瘤、胰腺癌、子宫癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、肾细胞癌中表达较高，高于或等于胃癌。在脑/神经系统中，在正常组织中CHRNB2的表达也较高，因此认为在神经胶质母细胞瘤、神经胶质瘤中CHRNB2的表达较高反映了原始组织的表达。然而，急性髓性白血病、乳腺癌、胆管癌、肺癌、恶性黑色素瘤、恶性间皮瘤、胰腺癌、子宫癌、子宫肉瘤、肾细胞癌在原始器官中的CHRNB2表达与胃相等或低于胃。因此，这些癌种中CHRNB2表达的高度很可能与致癌有关。另外，如以下实施例所示，可以通过中和或抑制CHRNB2的表达来抑制癌细胞增殖，因此以CHRNB2为靶点的药物在这些癌种中也很有可能发挥效果。
此外，NPTXR在膀胱癌、乳腺癌、食道癌、神经胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、肺癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、恶性褐色细胞瘤、前列腺癌、睾丸生殖细胞瘤、甲状腺癌、胰腺癌、子宫癌、肾细胞癌中表达较高，高于或等于胃癌。因此，在这些癌种中，与胃癌同样，以NPTXR为靶点的药物也很有可能发挥效果。
另外，在以下所示的实施例中，虽然单独使用了以CHRNB2、NPTXR为靶点的抗体或核酸，但可以分别并用。本发明人在抗CHRNB2抗体、抗NPTXR抗体上分别发现了2个可以成为靶点的区域。因此，可以同时使用针对CHRNB2或NPTXR的这2种抗体，也可以并用针对CHRNB2和NPTXR的2个分子的抗体。另外，也可以与已经批准的化疗剂或曲妥珠单抗、雷莫昔单抗、尼古鲁单抗等靶向药物并用。
以下，表示数据进行说明。
1.CHRNB2、NPTXR鉴定
<能够成为靶点分子的与胃癌进展有关的分子的鉴定>
此前，在名古屋大学医学部，对III期胃癌实施了治愈切除手术，作为术后辅助疗法，将内服S-1的病例根据经过进行了分组。胃癌患者大致可分为长期无复发组和复发转移组。5年以上长期无复发组为“现行治疗得到控制的胃癌”，以此为对照，与复发转移组比较。另外，由于转移有腹膜接种、肝转移、淋巴结转移等不同种类的转移，因此将复发转移组分为腹膜接种复发组、肝转移复发组、淋巴结复发组，将从包含5年以上长期无复发组在内的共4组、各4例胃癌原发灶组织中得到的RNA作为对象，通过转录组分析进行表达分析。
关于手术样品，使用RNeasy试剂盒(QIAGEN公司制造)来提取了RNA。关于所提取的总RNA(total RNA)，使用TruSeq RNA样品制备试剂盒(illumina公司制造)并按照标准协议进行了序列用文库的调整。
接着，使用下一代测序仪Hiseq(illumina公司制造)，进行配对末端测序，并进行转录组分析。读取碱基长度为100碱基/读长，参考取得读取数为1亿读长对(2亿读长)/通道，以参考取得数据量为20Gb/通道进行了数据的取得。
关于分析，使用HiSeq软件，进行向指定参照序列的映射处理，算出基于FPKM(Fragments per kilobase of exon per million mapped sequence reads，每千个碱基的转录每百万映射读取的片段数)值的每个基因的表达量，通过制作待测体间比较表来进行。
通过转录组分析全面分析57749个分子的表达量，比较5年以上长期无复发组与其他3组，检测在复发转移组中高表达的分子。着眼于如下两点进行了分析，结果作为满足条件的候选分子而选出了CHRNB2和NPTXR：在所有转移形式中表达都在增加；考虑到抑制药创制的路线图，该分子是能够以抗体药物的研究为前提的受体分子。
[表1]
Figure BDA0002702079370000121
如表1所示，CHRNB2、NPTXR在所有复发组中，与作为对照的5年以上长期无复发组比较，均显著地高表达。CHRNB2、NPTXR两种分子在恶性肿瘤中的作用均不清楚，但均为受体蛋白，可能成为与现有胃癌分子靶向药物完全不同机理的药物发现的靶标，因此进行了进一步研究。
<胃癌细胞株中CHRNB2、NPTXR的mRNA表达量的定量分析>
使用14种胃癌细胞株和非肿瘤性腺管上皮细胞株FHS74，通过定量PCR对CHRNB2、NPTXR的mRNA表达量进行定量(图1)。RNA通过RNeasy试剂盒(QIAGEN公司制造)来提取和纯化，关于定量PCR，使用ABI STEPOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems公司制造)，在95℃下加热10分钟后，在95℃下10秒、60℃下30秒的40个循环的PCR条件下进行扩增，并进行了分析。另外，为了使各RNA的值标准化，作为对照使用了3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)。所使用的PCR引物的序列如下所述。
[CHRNB2]
正向：AGCGAGGACGATGACCAG(序列号1)
反向：GGTGCCAAAGACACAGACAA(序列号2)
[NPTXR]
正向：TCATTCTGGAGCTGGAGGAC(序列号3)
反向：GGCAGCTGAGAGGTTCACA(序列号4)
[对照GAPDH]
正向：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(序列号5)
反向：GAAGATGGTGATGGGATTTC(序列号6)
探针：CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC(序列号7)
在非肿瘤性腺管上皮细胞株FHS74中，CHRNB2、NPTXR的任一分子的表达量都非常低。与此相比，CHRNB2在14种胃癌细胞株中有11种(79％)、NPTXR有9种(64％)发现表达增加。即，发现CHRNB2、NPTXR在复发/转移组的患者的胃癌组织以及胃癌细胞株中表达增加。
2.使用细胞株的CHRNB2、NPTXR的功能分析
<使用敲除细胞株的分析结果>
(1)使用CHRNB2敲除细胞株的功能分析
使用被称为恶性度高的胃癌细胞株的MKN1，通过CRISPR-CAS9法(Gene ArtPlatinum Cas9 nuclease；赛默飞世尔公司制造)进行基因组编辑，制备CHRNB2的敲除(KO)细胞。通过单细胞克隆来选择敲除细胞，并通过直接序列或蛋白免疫印迹法确认敲除细胞。关于增殖能力、凋亡比率、迁移能力、侵袭能力和粘附能力，与对照(未处理的MKN1)细胞进行了比较(图2)。
细胞的增殖能力用以下方法进行分析。在96孔板上接种以使得每个变为1×104个，在添加了2％胎牛血清的DMEM培养基中经时测定细胞增殖直至第5天。测定时，添加了10μL的细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8，Dojindo Molecular Technologies公司制造)并测定吸光度，将测定开始时的值表示为1(图2的(A))。在敲除了CHRNB2的MKN1细胞(KO-CHRNB2细胞)中，细胞增殖率降低，接种1天后发现细胞数有显著差异(在图中*表示。以下，确认有显著差异的部分同样地表示)。另外，KO-CHRNB2细胞即使在接种5天后也几乎没有发现增殖。另外，显著差异通过曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验进行分析。
凋亡细胞比率按以下方法进行分析。采用Annexin V Alexa Fluor 568偶联物(赛默飞世尔公司制造)进行了Annexin V染色。对1×106个细胞添加10μL的Annexin V试剂，在室温下静置15分钟后置于载玻片上，用荧光显微镜(FSX100，奥林巴斯公司制造)测定细胞数和Annexin V阳性细胞数。
在KO-CHRNB2细胞中，凋亡比率显著增加(图2的(B))。如图2的(A)所示，通过敲除CHRNB2，细胞增殖能力与作为亲本菌株的胃癌细胞MKN1细胞相比显著降低。结果表明，细胞凋亡诱导是抑制KO-CHRNB2细胞增殖的机制之一。即，认为由于CHRNB过度表达，难以诱导细胞凋亡，因此恶性度变高。
细胞的迁移能力通过创伤愈合试验(Wound-healing assay，伤口愈合实验)进行评价。将易必迪培养插件法(ibidi Culture insert method，ibid公司制造)以预定宽度在12孔板上形成伤口间隙(wound gap)并接种，在无血清培养基中培养，以使得各细胞分别变为2×104个。接种24小时后除去插件，每6小时以200μm间隔测定了伤口宽度。关于测定，使用40倍倍率的显微镜，测定各孔10处而求出平均以及标准偏差(图2的(C))。通过敲除CHRNB2，发现迁移能力也会明显下降。
细胞的侵袭能力通过基质胶侵袭试验(Matrigel invasion assay)对对照细胞、KO-CHRNB2细胞进行了评价。使用BioCoat基质胶侵袭室(BioCoat Matrigel invasionChambers，BD Biosciences公司制造)，按照协议进行了试验。具体而言，将每个细胞接种至每孔以使得分别变为2.5×104个细胞，在无血清DMEM培养基中培养24小时后，将膜底面的细胞固定，用迪夫快速染色液(Diff-Quick Stain，Sismex公司制造)进行染色，在显微镜下观察，计数细胞数。显微镜观察以200倍的倍率进行，求出随机选择的5个视野的平均和标准偏差。通过敲除CHRNB2，侵袭能力也显著降低(图2的(D))。
关于细胞的粘附能力，使用CytoSelect 48孔细胞粘附试验(CytoSelect48-WellCell Adhesion Assay，Cell Biolabs公司制造)，如下进行分析。将每个细胞接种于涂有粘附因子的板上以使得每孔变为7.5×104个，在无血清DMEM培养基中培养1小时后，测定各吸光度。对5种细胞粘附因子的粘附能力的分析表明，KO-CHRNB2细胞的粘附能力也降低(图2的(E))。
这些结果表明，由于CHRNB2的表达丧失，MKN1细胞的增殖能力、凋亡比率、迁移能力、侵袭能力、粘附能力等与癌进展相关的性质发生了显著变化。因此，通过抑制CHRNB2的作用，有可能抑制胃癌细胞的癌发展。
(2)使用NPTXR敲除细胞株的功能分析
接着，对于NPTXR，同样地，在胃癌细胞株MKN1中使用CRISPR-CAS9法制备敲除细胞，对增殖能力、凋亡比率、迁移能力、侵袭能力、粘附能力进行分析(图3)。
如图3所示，在敲除了NPTXR的细胞(NPTXR-KO-1、NPTXR-KO-2细胞)中，增殖能力、迁移能力、侵袭能力、粘附能力相对于亲本菌株的MKN1细胞均显著降低，凋亡比率显著增加。制备独立建立的2个敲除细胞株并进行研究的结果，所有的株的增殖能力、迁移能力、侵袭能力、粘附能力相对于亲本菌株MKN1细胞均显著降低，凋亡比率显著增加。因此，已经发现，与CHRNB2同样，通过失去NPTXR显著地损害了胃癌细胞MKN1的癌症进展相关的性质。
上述结果提示，NPTXR表达影响细胞凋亡并促进细胞增殖。因此，使用NPTXR敲除细胞株，对与细胞凋亡相关的性质进行了分析。已知线粒体与细胞凋亡密切相关。已知线粒体膜电位的消失促进细胞色素c的释放，半胱天冬酶级联被激活，诱导细胞凋亡。因此，对NPTXR表达是否与线粒体介导的凋亡有关进行了分析(图4)。
首先，使线粒体的膜电位可视化，使发生线粒体去极化的活细胞、即诱导细胞凋亡的细胞可视化(图4的(A))。用Muse MitoPotential试剂盒(Merck Millipore公司制造)对NPTXR敲除细胞NPTXR-KO-1和NPTXR-KO-2以及作为对照的亲本菌株MNK1细胞各染色1×105个，用细胞分选仪进行分析。
敲除了NPTXR的2个细胞株中，发生去极化的活细胞的比例相对于亲本菌株MNK1细胞均增长了6.5-10倍左右。线粒体去极化表明，凋亡是由线粒体介导。这些结果表明NPTXR表达抑制线粒体介导的凋亡。
接着，在NPTXR敲除细胞中，对促进细胞凋亡的蛋白酶即半胱天冬酶活性进行了分析。用Muse多个半胱天冬酶试剂盒(Muse Multi-Caspase kit，Merck Millipore公司制造)对各细胞株各1×105个进行染色，用细胞分选仪进行分析。在任一敲除细胞株中都观察到半胱天冬酶阳性细胞(Caspase+/Dead和Caspase+/Live分级)增加。也就是说，可以认为NPTXR表达阻碍半胱天冬酶的活性，抑制了细胞凋亡。
接着，使用半胱天冬酶活性检测试剂盒(Caspase Colorimetric Assay Kit，BioVision公司制造)对半胱天冬酶家族的哪种半胱天冬酶被活化进行分析(图4的(C))。半胱天冬酶存在与细胞凋亡诱导的初期相关的启动子半胱天冬酶和与细胞凋亡的实施相关的效应子半胱天冬酶。半胱天冬酶3是效应子半胱天冬酶，半胱天冬酶8、9是启动子半胱天冬酶。半胱天冬酶12是仅在小鼠中发现的半胱天冬酶，可能作为诱导内质网应激引起的细胞凋亡的引发剂而发挥作用。
通过对NPTXR表达进行敲除，确认了作为效应子半胱天冬酶的半胱天冬酶3和作为启动子半胱天冬酶的半胱天冬酶9被激活。这些结果表明，通过NPTXR表达，线粒体路径的凋亡的诱导被抑制，其结果，半胱天冬酶的活性化也被抑制。
接着，对与细胞增殖相关的特征进行分析。首先，分析NPTXR表达对细胞周期的影响。使用Muse细胞周期试剂盒(Muse Cell Cycle kit，Merck Millipore公司制造)，用细胞分选仪(图5的(A))进行分析，或者使用细胞周期检测试剂盒(Cell Cycle Assay Cell-Clock Kit，Biocolor公司制造)，在显微镜下(图5的(B))用8个视野计数各周期的细胞数，并进行分析。在任何分析中，NPTXR敲除细胞株在G2/M期发生细胞周期停滞，这表明NPTXR表达也参与细胞周期。
癌细胞具有如上所述的高增殖力、对细胞凋亡的抵抗性、侵袭/转移能力的特征。但是，已经提出了如下的癌症干细胞假说：并不是所有的癌细胞都具备同样的性质，癌细胞的一部分具备干细胞的性质，发生癌症。以干细胞中表达的醛脱氢酶(AldehydeDehydrogenase，ALDH)活性为指标，分析了干细胞的比率。通过ALDEFLOUR荧光试剂系统(ALDEFLOUR fluorescent reagent system，Stem Cell Technologies公司制造)，测定了ALDH阳性细胞的比率(图6)。将亲本菌株MKN1细胞、NPTXR敲除细胞分别染色1×105细胞并进行了分析。
比较处理前的细胞(对照)与试剂给予后(测试)的值，表明NPTXR敲除细胞与亲本菌株MKN1细胞相比，ALDH阳性细胞减少。即，表明NPTXR表达对干细胞性也有影响。
接着，对癌细胞的增殖性进行了分析(图7)。已知PI3激酶(PI3K)是细胞内信号传递系统，进行Akt介导的存活、增殖、蛋白合成、Rac介导的细胞运动等多种功能的调节，与癌症关系密切，在各种癌症中均有高表达。
使用Muse PI3K活化双重检测试剂盒(Muse PI3K Activation Dual DetectionKit，Millipore公司制造)来测定NPTXR敲除细胞中的PI3K的活性(图7的(A))。在作为亲本菌株的MKN1细胞中，几乎所有的细胞中PI3K都被活性化，与此相对，在NPTXR敲除细胞中，发现PI3K阳性细胞的比率减少。NPTXR表达的消失表明PI3K活性受到抑制。
进而，分析了NPTXR表达对胃癌中通常使用的抗癌剂5-FU的敏感性是否产生影响(图7的(B))。将作为对照的亲本菌株MKN1、NPTXR-KO-1和NPTXR-KO-2细胞各5×103个细胞接种到孔中，暴露于0、0.01、0.1、1、10、100mg/L的5-FU，用细胞计数试剂盒-8(CellCounting Kit-8)测定72小时后的细胞数。
在NPTXR敲除细胞中，对5-FU的敏感性均增强。特别是在0.1和1mg/L的低浓度区域中，与作为亲本菌株的MKN1相比，发现明显的敏感性差异。
该结果表明，通过抑制NPTXR表达来提高对5-FU的敏感性，提示通过并用NPTXR表达抑制剂和5-FU来可以得到更好的效果。
(3)使用了小鼠皮下肿瘤模型的分析
将敲除了CHRNB2或NPTXR的MKN1细胞、未处理的MKN1细胞在9周龄的裸鼠(BALBcnu/nu，从日本SLC公司获得)的双肩皮下移植1×106个，并经时测定肿瘤体积。另外，使用各组3只小鼠，通过短径×短径×长径/2来测量肿瘤体积，并计算出肿瘤体积。
制作小鼠皮下肿瘤模型并比较造瘤能力，在对照(未处理的MKN1)中肿瘤随时间增大，但在敲除了CHRNB2的细胞中，从移植后第4周开始观察到肿瘤体积有显著差异(如图8中所示)，表明通过敲除CHRNB2而造瘤能力降低(图8的(A))。另外，在移植了敲除NPTXR的细胞的小鼠中，从移植后第3周开始发现肿瘤体积有显著差异，表明造瘤能力降低(图8的(B))。
在小鼠皮下肿瘤模型中，在敲除了CHRNB2或NPTXR的细胞中，肿瘤的增殖显著降低，这提示以这些分子为靶点的药物对肿瘤具有抑制效果。因此，制备了这些分子的中和抗体、核酸药物，并进行了效果的研究。
3.CHRNB2、NPTXR的分子靶向药物的制备
(1)抗体药物的制备
[实施例1]
<CHRNB2中和抗体(多克隆抗体)的制备>
通过使CHRNB2的特异性抗体作用并抑制其活性，验证了能否抑制胃癌细胞的活性。使用表位检索工具(科斯莫生物公司制造)进行亲水性、二级结构、抗原性的估计和最佳抗原位点检索。选择以下2个序列作为靶序列，按照常规方法对兔子进行免疫，制备了2种针对CHRNB2(登录号：NP_000739)的多克隆抗体。另外，CHRNB2抗体-1是对94-111位(靶序列1、序列号8)的氨基酸序列进行免疫而得到的抗体，CHRNB2抗体-2是对490-502位(靶序列2、序列号9)的氨基酸序列进行免疫而得到的抗体。
靶序列；
CHRNB2抗体-1：WKPEEFDNMKKVRLPSKH(序列号8)
CHRNB2抗体-2：TFLHSDHSAPSSK(序列号9)
首先，研究针对这些靶序列的抗体是否在体外抑制胃癌细胞株MKN1的增殖。将MKN1细胞接种在96孔板上，以使得其变为1×104个细胞，并添加各抗体以使得其浓度变为0.7μg/mL，通过WST-1测定法测定随时间的细胞增殖(图9上)。另外，作为对照，使用了预出血血清(pre-bleed serum)。若对胃癌细胞株MKN1添加2种CHRNB2抗体，则观察到当使用针对靶序列1、2中任一种的抗体时，MKN1细胞在12小时后显示出显著(*)的细胞增殖抑制。
[实施例2]
<NPTXR中和抗体(多克隆抗体)的制备>
为了验证是否可以通过使NPTXR的特异性抗体作用来抑制其活性并阻碍胃癌细胞的活性，同样使用表位检索工具进行了亲水性、二级结构、抗原性的估计和最佳抗原部位检索。选择以下2个序列作为靶序列，按照常规方法对兔子进行免疫，制备2种针对NPTXR(登录号：NP_055108)的多克隆抗体。另外，NPTXR抗体-1是针对161-178位(靶序列1、序列号10)氨基酸序列的抗体，NPTXR抗体-2(靶序列2、序列号11)是针对251-268位氨基酸序列的抗体。
靶序列；
NPTXR抗体-1：CESGLPRGLQGAGPRRDT(序列号10)
NPTXR抗体-2：KERVALSHSSRRQRQEVE(序列号11)
以相同的方式对这些靶序列的抗体进行了体外的细胞增殖抑制活性的分析(图9下)。若对胃癌细胞株MKN1添加2种NPTXR抗体，则观察到当使用靶序列1、2中任一种抗体时，MKN1细胞在24小时后都显示出显著(*)的细胞增殖抑制。
[实施例3]
<使用了小鼠腹膜接种模型的CHRNB2中和抗体的效果的研究>
接着，通过小鼠腹膜接种模型来分析了对上述2种靶点进行识别的CHRNB2抗体的效果。将1×106个MKN1细胞移植到8周龄的裸鼠(BALBcnu/nu，从日本SLC公司获得)的腹腔内，并调查了治疗效果。另外，使用各组4只小鼠，如图10所示的给予时间表那样，每周2次、6周腹腔内给予CHRNB2抗体(各CHRNB2抗体-1为6.5μg/500μL，CHRNB2抗体-2为8.7μg/500μL)，比较对照组和胃癌腹膜接种形成量。另外，对照是未进行抗体给予的组。
示出对照组、CHRNB2抗体-1、CHRNB2抗体-2给予组的6周后剖腹肉眼所见(图10，照片)。在肉眼所见中，用箭头表示观察到腹膜接种的部位。在CHRNB2抗体给予组中，无论使用哪种抗体，仅观察到少量腹膜接种结节，显示出其治疗效果。
从剖腹的小鼠中回收接种结节，测定了各小鼠中的接种结节的总重量(图10下)。与对照相比，抗体给予组的总肿瘤重量显著(*)降低。
[实施例4]
<使用小鼠腹膜接种模型的NPTXR中和抗体的效果的研究>
以与实施例3相同的方式，通过小鼠腹膜接种模型分析了对NPTXR的两个靶点进行识别的NPTXR抗体的效果(图11)。
示出对照组、NPTXR抗体-1、NPTXR抗体-2给予组的6周后治疗后的剖腹肉眼所见(图11上)。在NPTXR抗体给予组中，无论使用哪种抗体，仅观察到少量腹膜接种结节，显示出其治疗效果。
另外，从剖腹的小鼠中回收接种结节，测定各小鼠中的接种结节的总重量(图11下)。与对照相比，抗体给予组的总肿瘤重量显著(*)降低。
无论是实施例1、2所示的体外系统，还是实施例3、4所示的体外系统，均通过以CHRNB2、NPTXR为靶点并对其表达进行中和，可以显著抑制癌细胞的增殖。因此，如果使用对CHRNB2、NPTXR进行识别的抗体作为药物，则可以进行复发/转移性胃癌的治疗。
此外，如上所述，CHRNB2、NPTXR不仅在胃癌中表达增加，而且在许多癌症中表达增加。对于这些癌也同样可以使用CHRNB2、NPTXR的中和抗体进行治疗的可能性高。
[实施例5]
<抗CHRNB2单克隆抗体的建立>
以序列号9表示的肽为抗原，通过常规方法建立针对CHRNB2的单克隆抗体。从得到的杂交瘤中选择3个克隆，得到单克隆抗体。与实施例1同样地，将MKN1细胞接种在96孔板上以使得其变为1×104个细胞，并添加各抗体以使得其浓度变为0.7μg/mL，通过WST-1测定法测定随时间的细胞增殖(图12)。从任何克隆获得的抗体对细胞增殖都显示出同样的抑制效果。
其中，克隆3(以下，称为CH-01)以受托编号NITE BP-02857，于2019年1月7日保藏在独立行政法人产品评价技术基础机构(NITE)专利微生物保藏中心(NPMD)(日本千叶县木更津市Kazusa镰足2-5-8，122号室)。
<CH-01抗体对小鼠腹膜接种模型的效果>
调查了抗CHRNB2单克隆抗体(克隆3，CH-01)对小鼠腹膜接种模型的治疗效果(图13)。将2×106个MKN1细胞移植到8周龄裸鼠(BALBcnu/nu)的腹腔内，并调查了治疗效果。每周3次、4周腹腔内给予抗CHRNB2单克隆抗体25μg/500μl，并比较了无治疗组与胃癌腹膜接种形成量(各组n＝5)。
在抗CHRNB2单克隆抗体给予组中，肉眼观察到明显的腹膜接种进展的抑制(图13上)。进而，回收胃癌腹膜接种结节，比较重量的结果，在抗CHRNB2单克隆抗体给予组中，总肿瘤量显著减少(图13下)。
[实施例6]
<抗NPTXR单克隆抗体的建立>
以序列号10表示的肽为抗原，建立针对NPTXR的单克隆抗体。与实施例1同样地，将MKN1细胞接种在96孔板上，以使得其变为1×104个细胞，并添加各抗体以使得其浓度变为0.7μg/mL，通过WST-1测定法测定随时间的细胞增殖(图14的(A))。所有克隆对细胞增殖均显示出同样的抑制效果。
进而，对来自各种脏器的癌细胞株，分析了抗NPTXR单克隆抗体克隆1的效果。对各癌细胞株，与上述同样地添加抗体，算出第5天的抗体给予组相对于对照的增殖比率(图14的(B))。在任何细胞株中，显示出通过抗体添加来抑制细胞增殖。特别是，对于作为根据胃癌建立的细胞株的MKN1、NUGC4，发现抗体具有很强的细胞增殖抑制效果。
<抗NPTXR单克隆抗体对小鼠腹膜接种模型的效果>
调查了抗NPTXR单克隆抗体对小鼠腹膜接种模型的治疗效果(图15)。将2×106个MKN1细胞移植到8周龄裸鼠(BALBcnu/nu)的腹腔内，并调查了从克隆1～3得到的抗体的治疗效果。每周3次、2周腹腔内给予抗NPTXR单克隆抗体25μg/500μl，，比较了无治疗组与胃癌腹膜接种形成量(各组n＝3)。
在抗NPTXR单克隆抗体给予组中，肉眼观察到明显的腹膜接种进展的抑制(图15上)。特别是，在给予了从克隆1得到的抗体的组中，没能用肉眼检测出腹膜接种病灶。此外，回收胃癌腹膜接种结节，并比较了重量(图15下)。在所有的抗体给予组中，总肿瘤量均显著减少。
另外，克隆1(以下称为NP-01)以受托编号NITE BP-02856，于2019年1月7日保藏在独立行政法人产品评价技术基础机构(NITE)专利微生物保藏中心(NPMD)(日本千叶县木更津市Kazusa镰足2-5-8，122号室)。
<NP-01抗体的表位图谱>
对NP-01抗体进行表位分析。在NPTXR蛋白质的151位至190位的区域中，如表2所示，将由15个氨基酸构成的肽一个一个地从N末向C末移位而合成。通过竞争性酶联免疫吸附测定法来测定针对各肽的结合，并决定了表位(表3)。其结果表明，将164位至178位的氨基酸序列、GLPRGLQGAGPRRDT(序列号12)强烈地识别为表位。由于认为识别相同表位的抗体具有相同的性质，因此认为识别序列号12表示的肽的抗体与NPTXR结合，并具有抑制癌细胞增殖的效果。
[表2]
Figure BDA0002702079370000221
[表3]
Figure BDA0002702079370000222
Figure BDA0002702079370000231
(2)核酸药物的制备
[实施例7]
<针对CHRNB2的核酸药物的研究>
使用核酸药物来抑制CHRNB2表达，由此分析了能否抑制胃癌细胞的增殖。使用针对CHRNB2的特异性siRNA，在体外分析了对增殖能力的影响。CHRNB2的siRNA(小干扰CHRNB2)、对照siRNA(小干扰对照)均来自北海道系统科学公司。另外，对照表示未经处理的细胞的增殖。
使用LipoTrust(注册商标)EX Oligo(北海道系统科学公司制造)向MKN1细胞中导入siRNA，在无血清DMEM培养基中培养72小时后，进行了增殖能力的评价(图16的(A))。
左图示出用定量PCR分析了CHRNB2 mRNA表达量的结果，右图示出用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8)分析了细胞增殖的结果。通过针对CHRNB2的特异性siRNA，胃癌细胞的增殖能力显著(*)降低。
[实施例8]
<针对NPTXR的核酸药物的研究>
接着，使用针对NPTXR的特异性siRNA，与实施例7同样地，体外分析了对增殖能力的影响。对MKN1细胞导入NPTXR的siRNA，在无血清DMEM培养基中培养72小时后，进行了增殖能力的评价(图16的(B))。
左图示出用定量PCR分析了NPTXR mRNA表达量的结果，右图示出用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8)分析了细胞增殖的结果。通过针对NPTXR的特异性siRNA，胃癌细胞的增殖能力显著(*)降低。
由上述结果可知，CHRNB2、NPTXR均可以通过阻碍mRNA表达来抑制细胞增殖。与抗体药物同样，通过使用核酸药物抑制这些分子的表达，可以抑制癌症的发展。
4.使用人临床数据的CHRNB2、NPTXR表达分析
在临床上使用以CHRNB2、NPTXR为分子靶点的药物的情况下，如果预先确认CHRNB2、NPTXR的表达、仅对在肿瘤组织中表达增强的患者进行治疗，则不会进行无用的治疗。因此，通过切除待测体来分析胃癌组织中的CHRNB2、NPTXR的mRNA表达量。另外，通过ROC曲线分析评价预后与mRNA表达量的相关性，研究了mRNA表达量能否用于预后预测。
[实施例9]
<胃癌组织中的CHRNB2表达量的定量分析>
为了确认全面的分析数据的再现性，用定量PCR法调查了从300例胃癌病例得到的胃癌组织中的CHRNB2的mRNA表达量。通过定量PCR来测定了从正常胃粘膜、I期、II期胃癌121病例、III期、IV期胃癌179病例得到的组织中的CHRNB2表达(图17的(A))。
CHRNB2的表达在胃癌组织中比在正常胃粘膜中表达高，而且，相对于I、II期，在III、IV期胃癌中表达显著增加。从这些数据可以看出，CHRNB2的表达随着阶段的进展而增强。
通过ROC曲线分析，求出胃癌原发灶组织中的CHRNB2 mRNA表达量对复发/死亡的截止值。通过将截止值设定为0.0013，得到了灵敏度为54％、特异度为75％、AUC＝0.667的结果(图17的(B))。利用该结果，将300例胃癌病例分为CHRNB2高表达组和低表达组进行分析，CHRNB2高表达组预后明显不良(图17的(C)的左图)。该结果在网站上公开(http://kmplot.com/analysis/)的欧美4国的综合数据中再现(图17的(C)的右图)。因此，CHRNB2表达可用于预后预测。
进一步，通过免疫组织化学染色法来检测了胃组织中的CHRNB2蛋白(图17的(D))。使用针对CHRNB2的多克隆抗体，通过常规方法对组织进行了免疫染色。能够判定在肿瘤部组织中明确发现表达的病例和没有表达的病例。因此，可以通过免疫组织化学染色来确认CHRNB2蛋白的表达。
[实施例10]
<胃癌组织中的NPTXR表达量的定量分析>
与实施例9同样地，用定量PCR法调查了从300例胃癌病例得到的胃癌组织中的NPTXR的mRNA表达量(图18的(A))。NPTXR的表达与阶段无关，在胃癌组织中与正常胃粘膜相比表达显著增加。
进一步，对于NPTXR，对上述300个病例详细地按每个阶段进行划分，与上述同样地用定量PCR法进行了调查(图19)。发现NPTXR的表达随着阶段的进展有增加的倾向，在正常组织和阶段I、阶段II和III中表达有显著差异。
进一步，通过ROC曲线分析，求出胃癌原发灶组织中的NPTXR mRNA表达量对复发/死亡的截止值。通过将截止值设定为0.0086，得到了灵敏度为58％、特异度为66％、AUC＝0.638的结果(图18的(B))。利用该结果，将300例胃癌病例分为NPTXR高表达组和低表达组进行分析，发现NPTXR高表达组显著预后不良(图18的(C)的左图)。该结果在网站上公开(http://kmplot.com/analysis/)的欧美4国的综合数据中再现(图18的(C)的右图)。因此，NPTXR表达也可用于预后预测。
进一步，通过免疫组织化学染色法来检测了胃组织中的NPTXR蛋白(图18的(D))。使用针对NPTXR的多克隆抗体，通过常规方法对组织进行了免疫染色。能够判定在肿瘤部组织中明确发现表达的病例和没有表达的病例。因此，可以通过免疫组织化学染色来确认NPTXR蛋白的表达。
已表明CHRNB2抗体、NPTXR抗体可应用于伴随诊断，该伴随诊断能够选择适合于以CHRNB2、NPTXR为靶点的分子靶点治疗的患者。另外，CHRNB2、NPTXR是将长期无复发组和复发转移组进行对比发现表达有差异的蛋白，因此也可以将CHRNB2、NPTXR表达用作预后预测标记。免疫组织化学染色也可以从少量的组织待测体判定，因此不仅手术待测体，内窥镜检查时的活检待测体也成为对象。另外，免疫组织化学染色是临床上通常进行的检查，因此能够通过抗体确认待测体中的这些蛋白的表达在临床上非常有意义。
[实施例11]
<基于组织微阵列的表达分布>
(1)各种器官/正常组织中的表达分布
作为用于研究在使用了与CHRNB2、NPTXR结合的抗体药物或阻碍表达的药物时的安全性的数据，对CHRNB2、NPTXR在各种器官/正常组织中的表达分布进行了分析(图20)。
利用组织微阵列(Provitro公司制造)，通过免疫组织化学染色法，分析了CHRNB2、NPTXR的表达。组织染色的结果，将所分析的组织分类为无表达、低表达、高表达，其比率表示在图表中。另外，在图表中表示作为(n)分析的组织的数量。在人正常组织中，CHRNB2表达和NPTXR表达均较少，表明在非目的器官中表达不良事件的可能性较低。
2.各种器官在癌症中的表达分布
利用组织微阵列(Provitro公司制造)，进行了CHRNB2、NPTXR在各种癌症中的表达分析。与上述同样地，组织染色的结果，将所分析的组织分类为无表达、低表达、高表达，并表示在图表中。进行了CHRNB2、NPTXR在大肠中的表达分析。在约70％的大肠癌中发现CHRNB2表达、在约50％的大肠癌中发现NPTXR表达(图21)。在以下的癌种中也同样地进行了分析。
进行了CHRNB2、NPTXR在乳腺癌中的表达分析(图22)。在约40％的乳腺癌中发现CHRNB2表达、约30％的乳腺癌中发现NPTXR表达。进行了CHRNB2、NPTXR在肺癌中的表达分析(图23)。在约50％的肺癌中均发现CHRNB2表达和NPTXR表达。进行了CHRNB2、NPTXR在胰腺癌中的表达分析(图24)。在约40％的胰腺癌中发现CHRNB2表达、在约50％的胰腺癌中发现NPTXR表达。进行了CHRNB2、NPTXR在食道癌中的表达分析(图25)。在约50％的食道癌中均发现CHRNB2表达和NPTXR表达。
根据上述组织阵列的结果，发现CHRNB2、NPTXR的表达在正常组织中表达较低，此外，发现不仅在胃癌中表达，而且在乳腺癌、肺癌、胰腺癌、食道癌等多种癌症中表达。因此，提示在这些癌中也可以通过阻碍CHRNB2、NPTXR表达的抑制剂、或者与CHRNB2、NPTXR结合的抗体药物来进行治疗。
工业应用性
从实施了被定位为标准治疗的S-1术后辅助疗法的病例组中发现了CHRNB2、NPTXR高表达组，可以说这两种分子是克服现有治疗无法控制的状况的关键分子。对CHRNB2、NPTXR表达进行中和、抑制的药物与现有的以生长因子受体为中心的分子靶点治疗药物的靶点完全不同，因此成为一种全新的治疗药物。另外，不限于胃癌，也可以成为对CHRNB2、NPTXR高表达的肿瘤具有效果的药物。
序列表
<110> 国立大学法人名古屋大学
<120> 分子靶向药物和伴随诊断药物
<130> MS17089PCT
<160> 12
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 1
agcgaggacg atgaccag 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 2
ggtgccaaag acacagacaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 3
tcattctgga gctggaggac 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 4
ggcagctgag aggttcaca 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 5
gaaggtgaag gtcggagtc 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 6
gaagatggtg atgggatttc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 7
caagcttccc gttctcagcc 20
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CHRNB2_#94-111
<400> 8
Trp Lys Pro Glu Glu Phe Asp Asn Met Lys Lys Val Arg Leu Pro Ser
1 5 10 15
Lys His
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CHRNB2_#490-502
<400> 9
Thr Phe Leu His Ser Asp His Ser Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NPTXR_#161-178
<400> 10
Cys Glu Ser Gly Leu Pro Arg Gly Leu Gln Gly Ala Gly Pro Arg Arg
1 5 10 15
Asp Thr
<210> 11
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NPTXR_#251-268
<400> 11
Lys Glu Arg Val Ala Leu Ser His Ser Ser Arg Arg Gln Arg Gln Glu
1 5 10 15
Val Glu
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NH-01表位
<400> 12
Gly Leu Pro Arg Gly Leu Gln Gly Ala Gly Pro Arg Arg Asp Thr
1 5 10 15

Claims (32)

1.一种分子靶向治疗药物，含有对CHRNB2(Cholinergic Receptor Nicotinic Beta 2Subunit，烟碱型胆碱受体β2亚单元)表达进行中和或抑制的物质作为有效成分。
2.如权利要求1所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，
所述有效成分是抗体或核酸。
3.如权利要求1或2所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，
所述有效成分对CHRNB2的WKPEEFDNMKKVRLPSKH(序列号8)或TFLHSDHSAPSSK(序列号9)中任一种进行识别。
4.如权利要求3所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，
所述有效成分是抗体。
5.如权利要求4所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，
所述抗体由以受托编号NITE P-02857表示的杂交瘤产生。
6.如权利要求1或2所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，
所述有效成分是针对CHRNB2的siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、适配体或诱饵。
7.如权利要求1至6中任一项所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，
所述分子靶向治疗药物的目标疾病为胃癌、大肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、食道癌。
8.一种单克隆抗体，由以受托编号NITE P-02857表示的杂交瘤产生。
9.一种杂交瘤，以受托编号NITE P-02857表示。
10.一种检测试剂盒，包含：对CHRNB2进行识别的抗体、或对CHRNB2的mRNA表达进行定量的引物、以及测定中所需的试剂。
11.如权利要求10所述的检测试剂盒，其特征在于，
对所述CHRNB2进行识别的抗体对CHRNB2的WKPEEFDNMKKVRLPSKH(序列号8)或TFLHSDHSAPSSK(序列号9)中任一种进行识别。
12.如权利要求10所述的检测试剂盒，其特征在于，
对所述CHRNB2进行识别的抗体由以受托编号NITE P-02857表示的杂交瘤产生。
13.如权利要求10所述的检测试剂盒，其特征在于，
用于定量所述CHRNB2的mRNA的引物是由序列号1和序列号2表示的引物。
14.一种分子靶向药物的筛选方法，将被测物质与CHRNB2的细胞表面所暴露的区域的结合性作为指标。
15.一种筛选分子靶向药物的方法，在被测物质存在下培养细胞，通过以CHRNB2表达为指标来筛选分子靶向药物。
16.一种分子靶向治疗药物，含有对NPTXR(Neuronal pentraxin receptor，神经元五种毒素受体)表达进行中和或抑制的物质作为有效成分。
17.如权利要求16所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，
所述有效成分是抗体或核酸。
18.如权利要求16或17所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，
所述有效成分对NPTXR的CESGLPRGLQGAGPRRDT(序列号10)或KERVALSHSSRRQRQEVE(序列号11)中任一种进行识别。
19.如权利要求18所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，
所述有效成分是抗体。
20.如权利要求19所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，
所述抗体由以受托编号NITE P-02856表示的杂交瘤产生。
21.如权利要求16或17所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，
所述有效成分是针对NPTXR的siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、适配体或诱饵。
22.如权利要求16至21中任一项所述的分子靶向治疗药物，其特征在于，
所述分子靶向治疗药物目标疾病为胃癌、大肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、食道癌。
23.一种抗体，对NPTXR的CESGLPRGLQGAGPRRDT(序列号10)或KERVALSHSSRRQRQEVE(序列号11)进行识别。
24.一种单克隆抗体，由以受托编号NITE P-02856表示的杂交瘤产生。
25.一种杂交瘤，以受托编号NITE P-02856表示。
26.一种抗体，对由序列号12(GLPRGLQGAGPRRDT)表示的表位进行识别。
27.一种检测试剂盒，包含：对NPTXR进行识别的抗体、或对NPTXR的mRNA表达进行定量的引物、以及测定中所需的试剂。
28.如权利要求27所述的检测试剂盒，其特征在于，
对所述NPTXR进行识别的抗体对CESGLPRGLQGAGPRRDT(序列号10)或KERVALSHSSRRQRQEVE(序列号11)中的任一种进行识别。
29.如权利要求27所述的检测试剂盒，其特征在于，
对所述NPTXR进行识别的抗体由以受托编号NITE P-02856表示的杂交瘤产生。
30.如权利要求27所述的检测试剂盒，其特征在于，
对所述NPTXR的mRNA表达进行定量的引物为序列号3和序列号4。
31.一种分子靶向药物的筛选方法，将被测物质与NPTXR的细胞表面所暴露的区域的结合性作为指标。
32.一种筛选分子靶向药物的方法，在被测物质存在下培养细胞，通过以NPTXR表达为指标来筛选分子靶向药物。
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