KR20190043591A - MELK에 대한 단클론 항체(monoclonal antibody) 및 그 사용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 MELK에 대한 단클론 항체(monoclonal antibody)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체를 이용하여 MELK 관련 질환을 진단하는 방법, MELK 단백질을 검출하는 방법, MELK 저해제 치료 후 약효를 확인하는 방법, MELK 저해제 치료 효과가 높은 개체를 선별하는 방법 및 상기 항체 성분을 포함하는 진단 시약을 제공한다.

Description

MELK에 대한 단클론 항체(monoclonal antibody) 및 그 사용
본 발명은 MELK에 대한 단클론 항체(monoclonal antibody), 상기 항체를 이용하여 MELK 관련 질환을 진단하는 방법, MELK 단백질을 검출하는 방법, MELK 저해제에 의한 치료 후 약효를 판정하는 방법, MELK 저해제에 의한 치료효과가 높은 개체를 선별하는 방법 및 상기 항체를 포함하는 진단 시약에 관한 것이다.
MELK, 즉 모체배아 류신 지퍼 키나아제(Maternal Embryonic Leucine zipper Kinase) (참조 배열 : Genbank 액세스 번호 NM-0 14971.3 ; 서열번호 21)는 포유동물 배아의 발생에 관여하는 snfl/AMPK 세린-트레오닌 키나아제 패밀리(family)의 신규 멤버로 이전에 동정 되었다 (（Heyer BS eta 와 Dev Dyn. 1999 Aug, 2 15(4) :344-51 (비특허문헌1)). 이 유전자는 줄기 세포의 재생 (Nakano I et al., J Cell Biol. 2005 Aug 1, 170 (3) : 413-27 (비 특허 문헌 2)), 세포주기의 진행 (Blot J et al., Dev Biol. 2002 Jan 15, 241 (2) : 327-38 (비 특허 문헌 3); Seong HA et al., Biochem J. 2002 Feb 1, 361 (Pt 3) : 597-604 (비 특허 문헌 4)) 및 mRNA 전구체의 접합 (Vulsteke V et al., J Biol Chem. 2004 Mar 5, 279 (10) : 8642-7. Epub 2003 Dec 29 (비 특허 문헌 5))에 중요한 역할을 수행한다.
또한, 23,040 개의 유전자를 포함한 게놈 전역에 걸친 cDNA 마이크로 어레이(Micro array)를 이용하는 유전자 발현 프로파일 해석을 통해 MELK가 유방암에서 과잉 발현되는 것으로 나타났다(Lin ML et al., Breast Cancer Res. 2007, 9 ( 1) : R17 (비 특허 문헌 6), WO2006 / 016525 (특허 문헌 1), WO2008 / 023841 (특허 문헌 2)). 사실, MELK는 폐암 세포, 방광암 세포, 림프종 세포 및 자궁 경부암 세포 등 일부 암 세포에서 과잉 발현된다 (WO2004 / 031413 (특허 문헌 3), WO2007 / 013665 ( 특허 문헌 4) 및 WO2006 / 085684 (특허 문헌 5) 참조). 여러 인간 조직 및 암 세포주에서의 노던 블롯(Northern blot) 분석에서 MELK는 대부분의 유방암 및 유방암 세포주에서 유의하게 높은 수준에서 과잉 발현하지만, 주요 정상적인 장기 (심장, 간, 폐 및 신장 )에서는 발현하지 않는 것이 입증되었다 (WO2006 / 016525 (특허 문헌 1)). 또한 siRNA에 의한 MELK 발현 억제가 인간 유방암 세포의 증식을 유의하게 억제하는 것 (특허 문헌 1) 및 항 MELK 저분자 저해제가 마우스의 유방암 이종 이식(xenograft)의 크기를 축소한 것으로 나타났다 ( Chung S et al., Oncotarget 2012 Dec 3 (12) : 1629-1640 (비 특허 문헌 7), Chung S et al., Oncotarget. 2016 Feb 24, 7 (14) : 18171-18182 (비 특허 문헌 8)).
따라서 MELK는 항암제의 적절한 표적인 것으로 보이고, MELK에 대한 단클론 항체(monoclonal antibody)는 치료의 진단약으로서 사용될 수 있다. 현재 유방암, 악성 림프종 및 대장암에 대한 트라스투주맙(Trastzumab)의 진단약, 리툭시맙(Rituximab)의 진단약 및 베바시주맙(Bevacizumab)의 진단약과 같은 단클론 항체(monoclonal antibody)의 임상적 적용에 따른 성공 사례 외에 다른 분자 표적에 대한 몇 가지 단클론 항체(Monoclonal antibody)가 개발 중이며, 이러한 진단 효과를 평가 중이다. 이러한 진단약은 환자가 치료약을 효과적으로 선택할 수 있다는 점에서, 보다 효과적인 치료법으로 이어지게 될 것으로 기대된다.
[특허 문헌 1] WO 2006/016525 [특허 문헌 2] WO 2008/023841 [특허 문헌 3] WO 2004/031413 [특허 문헌 4] WO 2007/013665 [특허 문헌 5] WO 2006/085684
[비 특허 문헌 1] Heyer BS et al., Dev Dyn. 1999 Aug, 215(4): 344-51 [비 특허 문헌 2] Nakano I et al., J Cell Biol. 2005 Aug 1, 170(3): 413-27 [비 특허 문헌 3] Blot J et al., Dev Biol. 2002 Jan 15, 241(2): 327-38 [비 특허 문헌 4] Seong HA et al., Biochem J. 2002 Feb 1, 361(Pt 3): 597-604 [비 특허 문헌 5] Vulsteke V et al., J Biol Chem. 2004 Mar 5, 279(10): 8642-7. Epub 2003 Dec 29 [비 특허 문헌 6] Lin ML et al., Breast Cancer Res. 2007, 9(1): R17 [비 특허 문헌 7] Chung S et al., Oncotarget. 2012 Dec, 3(12): 1629-1640 [비 특허 문헌 8] Chung S et al., Oncotarget. 2016 Feb 24, 7(14): 18171-18182
분자 표적 치료제를 이용한 종양 치료의 진단약에 있어서, 표적 종양의 대부분에 대해서는 과잉 발현되고, 정상 조직에서는 발현되지 않거나 최소한으로 발현되는 세포 단백질을 검출하는 것이 중요하다. 그러나 종양에 발현되는 단백질을 특이적으로 높은 감도로 검출하기 어려우며, 이러한 단백질에 대한 항체를 얻는 것도 어렵다. 예를 들어, 항암제의 표적으로 여겨지는 MELK에 대한 몇 가지 항체가 시판되고 있다. 그러나 본 발명자들이 시판 중인 항체를 사용하여 MELK 발현 세포의 염색을 한 결과, 시판 중인 항체를 사용한 경우 MELK의 발현 수준이 낮은 세포에서도 양성 신호(위양성)가 관찰되었다. 이와 같이 면역학적 특이성이 부족한 항체는 항체 반응 강도를 지표로 하여 MELK 발현 수준의 차이를 명확하게 감지할 수 없다. 따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 MELK에 특이적이고 높은 감도로 결합하는 항체를 제공하는 것이다.
이에 본 발명자들은 마우스(mouse)를 MELK 항원으로 면역화한 단클론 항체(monoclonal antibody) 중에서 MELK에 특이적으로 결합하는 항체를 탐색한 결과, 세포에 강제 발현시킨 MELK 단백질에 특이적으로 결합할 수 있으며, 또한 세포와 조직 안에 발현하는 내인성 MELK 단백질을 특이적으로 잘 감지할 수 있는 클론(clone)을 동정하는데 성공하였다.
구체적으로, 본 발명은 다음에 관한 것이다 :
(1) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및
서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역 중 하나 또는 둘을 포함하고,
MELK 단백질 또는 그 일부 펩타이드에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment).
(2) (1)에 있어서, 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역 중 하나 또는 둘을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment).
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment).
(4) MELK 단백질에 대한 특이적 결합에 대해서 (1) 내지 (3) 중 어느 하나의 항체와 경쟁하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment).
(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 친화도(affinity) 표지, 효소 표지, 방사성 동위 원소 표지 또는 형광 표지로 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment).
(6) (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)을 코딩(coding)하는 폴리뉴클레오티드(Polynucleotide).
(7) (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)을 포함하는, MELK 관련 질환의 진단, MELK 저해제에 의한 치료 후 약효를 판정, MELK 저해제에 의해 높은 치료 효과를 가지는 개체를 선별 하기 위한 시약.
(8) 하기의 단계를 포함하는 개체에서 MELK 관련 질환 또는 그 질환의 발병 소인(predisposition)을 진단하는 방법 :
(a) 상기 개체로부터 분리된 시료를 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)과 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시료와 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)의 결합을 검출하여 상기 시료 내의 MELK 단백질을 검출하는 단계; 및
(c) 상기 시료 내 MELK 단백질 수준을 대조군과 비교하는 단계로서, 대조군과 비교하여 MELK 단백질 수준이 높을 때, 상기 개체가 상기 질환을 앓고 있거나 발병 위험이 있을 것으로 나타내는 단계.
(9) (7) 또는 (8)에 있어서, 상기 MELK 관련 질환이 MELK가 발현되는 암 또는 자궁 내막증인 시약 또는 진단하는 방법.
(10) (9)에 있어서, 상기 암은 유방암, 방광암, 자궁 경부암, 담관 세포암, 만성 골수성 백혈병 (Chronic Myelogenous Leukemia, CML), 대장암, 식도암, 위암, 간암, 비소 세포 폐암 (Non-Small-Cell Lung Carcinoma, NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암 및 소세포 폐암 (Small-Cell Lung Carcinoma, SCLC)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 시약 또는 진단하는 방법.
(11) 하기의 단계를 포함하는 시료 내의 MELK 단백질을 검출하는 방법 :
(a) 개체로부터 분리된 시료를 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)과 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시료와 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)의 결합을 검출하여 시료 내의 MELK 단백질을 검출하는 단계.
(12) 하기의 단계를 포함하는 개체의 MELK 저해제에 의한 치료 후 약물 효과를 판정하는 방법 :
(a) 개체으로부터 분리된 시료를 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)과 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시료와 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)의 결합을 검출하여 시료 내의 MELK 단백질을 검출하는 단계; 및
(c) 상기 시료 내 MELK 단백질 수준을 약물 투여 전의 발현 수준과 비교하는 단계로서, 약물 투여 전과 비교하여 상기 MELK 단백질 수준이 낮을 때 상기 개체에서 약물 효능이 있는 것으로 나타나는 단계.
(13) 하기의 단계를 포함하는 개체의 MELK 저해제에 의한 치료 효과가 높은 개체 선별 하는 방법 :
(a) 개체로부터 분리된 시료를 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)과 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시료와 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)의 결합을 검출하여 상기 시료 내의 MELK 단백질을 검출하는 단계; 및
(c) 상기 시료 내 MELK 단백질 수준을 대조군과 비교하는 단계로서, 대조군과 비교하여 상기 MELK 단백질 수준이 유사하거나 그보다 높을 때, 상기 개체에서 MELK 억제제에 의한 치료 효과가 높은 것으로 나타나는 단계.
(14) (8) 내지 (13) 중 어느 하나에 있어서, 상기 시료는 상기 개체로부터 분리된 세포 또는 조직인 방법.
(15) 하기의 단계를 포함하는 MELK 단백질 또는 이의 일부 펩타이드에 결합할 수 있는 항체를 제조하는 방법 :
(a) (6)의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터(vector)를 포함하는 세포를 배양하는 단계;
(b) 상기 세포 배양물 또는 배양배지로부터 상기 항체를 회수하는 단계.
또한 본 발명은 다음에 대한 것이다.
하기의 단계를 포함하는 MELK 관련 질환 또는 상기 질환의 발병소인(predisposition)을 진단하는 마커(marker)를 검출하는 방법 :
(16) (a) 개체로부터 분리된 시료를 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)과 접촉시키는 단계 ; 및
(b) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)과 상기 시료의 결합을 검출하여, 상기 시료 내의 MELK 단백질을 상기 마커(marker)로 검출하는 단계.
(17) (1) 내지 (5)중 어느 하나에 있어서, MELK 관련 질환 또는 상기 질환의 발병 소인(Predisposition)의 진단에 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment).
(18) MELK 관련 질환 또는 상기 질환의 발병 소인(Predisposition)을 진단하기 위한 시약의 제조에 있어서, (1) 내지 (5)중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment).
(19) 하기의 단계를 포함하는 MELK 저해제의 약효 마커(marker)를 검출하는 방법 :
(a) 개체로부터 분리된 시료를 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)과 접촉시키는 단계 ; 및
(b) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)과 상기 시료의 결합을 검출하여, 상기 시료 내의 MELK 단백질을 상기 마커(marker)로 검출하는 단계.
(20) MELK 저해제에 의한 치료 후 약물효과를 판정하는데에 사용하기 위한 (1) 내지 (5)중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment).
(21) MELK 저해제에 의한 치료 후 약물 효과를 판정하기 위한 시약의 제조에 있어서, (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment).
(22) 하기의 단계를 포함하는 MELK 저해제의 치료반응성 마커(marker)를 검출하는 방법 :
(a) 개체로부터 분리된 시료를 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)과 접촉시키는 단계 ; 및
(b) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)과 상기 시료와의 결합을 검출하는 것으로서, 상기 시료 내의 MELK 단백질을 상기 마커(marker)로 검출하는 단계.
(23) MELK 저해제에 의한 치료효과가 높은 개체를 선별 하는 데에 사용하기 위한, (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment).
(24) MELK 저해제에 의한 치료효과가 높은 개체를 선별 하기 위한 시약의 제조에 있어서, (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)의 사용.
상기에 기재된 사항 외에 본 발명의 다른 목적 및 특징은 첨부된 도표 및 실시예와 함께 다음의 상세한 설명에 의해 명확하게 설명된다. 그러나 전술한 발명의 개요 및 하기의 상세한 설명은 모두 예시적인 것으로서 본 발명 또는 다른 대안적인 형태로 한정하는 것은 아니다. 특히, 본 발명을 몇 가지 구체적인 예를 참조하여 설명하지만, 이는 본 발명을 예시하는 것 이며, 한정하는 것이 아니다. 첨부된 특허 청구범위에 의해 설명되는 본 발명의 사상 및 범위에서 일탈하지 않고, 당업자는 다양한 변경 및 적용을 생각해 볼 수 있다. 마찬가지로 본 발명의 다른 목적, 특징, 이익, 및 장점은 첨부된 실시예, 데이터, 도표 및 그들로부터 도출되는 모든 타당한 추론과 함께 위에서 단독으로 또는 본 명세서에 포함되는 참고 자료를 고려하여 명백해질 것이다.
도 1은 강제 발현 세포주를 이용한 면역 조직 화학 염색에서 항 MELK 항체 (OTSMAb01)의 특이성을 나타내는 현미경 사진이다. 항 MELK 항체 (OTSMAb01)에 의한 면역 조직 화학 염색 결과 MELK 강제 발현 세포주(MELK/293T)에서 제작된 파라핀 표본에서 특이적인 염색이 관찰되었으나, 대조군으로 공벡터(Empty Vector)를 도입시킨 세포주 (Mock / 293T)는 염색되지 않았다. 한편, 시판 항체 (MELK (N449) pAb (Bioworld Technology), MELK (HPA017214) pAb (Sigma-Aldrich))도 면역 조직 화학 염색 결과 MELK / 293T에 특이적인 염색이 관찰되었지만, 대조군(Mock) 은 염색되지 않았다. 또한 하기의 그래프는 면역 조직 화학 염색 결과에서 강제 발현 세포 수에 대한 MELK 양성 세포의 비율 (%)을 산출하여 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 MELK 발현량이 다른 여러 세포주에서, MELK 의 발현을 나타내는 OTSMAb01을 이용한 웨스턴 블랏(Western blot)의 결과를 나타내는 사진이다. PK-45P, BT-549, MDA-MB-231, A549은 MELK 고(高)발현 세포주이며, MCF-7, Hep G2, HT-29은 MELK 저(低)발현 세포주이다.
도 2b는 도 2a의 연속이다.
도 3a 및 도 3b는 MELK 발현 세포주를 이용한 면역 조직 화학 염색에서 항 MELK 항체 (OTSMAb01)의 특이성을 나타내는 현미경 사진이다. 위쪽 패널의 본 발명의 항 MELK 항체 (OTSMAb01)에 의한 면역 조직 화학 염색 결과, PK-45P, BT-549, MDA-MB-231, A549 등 MELK 고(高) 발현 세포주에서 제작 된 파라핀 절편에서 염색이 관찰되었지만, MCF-7, Hep G2, HT-29 등 저(低) 발현 세포주에서는 거의 염색되지 않았다. 한편 중앙 패널 아래쪽 패널의 시판 항체 (MELK (N449) pAb, MELK (HPA017214) pAb)에서는 MELK 고(高) 발현 세포주와 저(低) 발현 세포주 모두에서 염색이 관찰되었다. 세포주를 이용한 분석을 통해 시판 항체와 비교하여 본 발명의 항 MELK 항체 (OTSMAb01)의 면역 조직 화학 염색법의 높은 특이성이 밝혀졌다. 또한 사진 아래의 그래프는 면역 조직 화학 염색 결과에서 각 세포주에서 차지하는 MELK 양성 세포의 비율 (%)을 산출하고 그래프로 나타낸 것이다.
도 3b는 도 3a의 연속이다.
도 4는 유방암 임상 검체 1 ~ 3을 이용한 면역 조직 화학 염색 및 반 정량적 RT-PCR의 발현의 상관관계를 나타낸다. A : 본 발명의 항 MELK 항체 (OTSMAb01)를 이용한 면역 조직 화학 염색을 통해 모든 유방암 시료에서 MELK 양성 소견이 관찰되었다. 한편 정상 유방 검체는 거의 염색되지 않았다. B : 면역 조직 화학 염색 결과에서 종양 세포에서 차지하는 MELK 양성 세포의 비율을 계산하여 그래프에 나타내었다. C : 동일한 증례의 RT-PCR에 의한 발현 해석하여 면역 조직 화학 염색과 상관하는 결과가 얻어졌다. 임상 검체를 이용한 분석을 통해 본 발명의 항 MELK 항체 (OTSMAb01)의 면역 조직 화학 염색법의 높은 특이성이 밝혀졌다.
상세한 설명
본 발명을 실시 또는 실험할 때에, 본 명세서에 기재된 방법 및 재료와 유사한 또는 동일한 임의의 방법 및 재료를 사용할 수 있지만, 선호하는 방법, 장치 및 재료를 여기에 기재한다. 그러나 본 발명의 재료 및 방법에 대해 설명하기 전에, 본 명세서에 기재된 특정 크기 형상, 치수, 재료, 방법론, 프로토콜(protocol) 등은 관례적인 실험방법 및 최적화에 따라 변경할 수 있으므로 본 발명은 이에 한정되지 않는다. 본 기재에 사용하는 전문용어는 특정 형태 또는 방식만을 설명하는 목적이며, 본 발명의 범위를 한정하지 않고, 본 발명은 특허 청구범위에 의해서만 한정된다.
본 발명은 MELK 단백질 또는 그 일부 펩타이드에 특이적으로 결합 할 수 있는 항 MELK 단클론 항체(monoclonal antibody)를 제공한다. 본 발명은 항 MELK 단클론 항체(Monoclonal antibody)가 면역 조직 화학 염색에 의해 MELK 단백질의 검출에 높은 특이성을 갖는다는 증거를 제공한다.
본 발명의 항 MELK 항체 (OTSMAb01)는 가변영역에서 최소한 다음의 아미노산 서열을 가지고 있다 :
OTSMAb01, 중쇄가변영역 아미노산 서열 (신호(signal) 서열 제외) :
EVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGNTIYDPKFQGKASVTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTSHHYSAMDYWGQGTSVTVSS (서열 번호 7)
OTSMAb01, 경쇄가변영역 아미노산 서열 (신호(signal) 서열 제외) :
DVVMTQTPLSLPVSLRDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLIISRVEAEDLGVYFCSQSTYVPLTFGAGTKLELKRAD (서열 번호 8)
본 발명의 항체는 상기 아미노산 서열을 코딩(coding)하는 DNA를 이용한 재조합 기술에 의해 제조가 가능하다.
본 발명의 항체는 마우스(mouse)를 면역시켜 얻은 다수의 항체 생산 하이브리도마(hybridoma)에서 면역 염색법에 의해 강제 발현 세포 (양성 대조군 세포)에서 양성, 대조군 세포에서 음성인 MELK에 결합하는 항체를 선별하고 선택함으로써 얻을 수 있다. 선택된 항체에 대해 내인성(endogenous) MELK 발현 세포 (양성 대조군 세포)에서 양성, 대조군 세포에서 음성인 항체를 추가로 선별했다. MELK와의 상호 작용이 그다지 강하지 않은 경우에는 약한 결합력을 가진 항체가 백그라운드에 남아있다. 따라서 내인성(endogenous) MELK 발현량이 미리 측정 된 세포주를 이용하여 면역 염색을 실시하여 선별함으로써 목적하는 MELK과 강한 결합성을 갖는 항체를 선택할 수 있었다.
본 발명의 항체는 MELK에 특이적으로 결합한다. 따라서 본 발명의 항체는 MELK 또는 MELK 를 발현하는 세포 혹은 조직을 검출하기 위한 도구로서 유용하다. 또한 본 발명의 항체는 그 항체를 검출할 수 있는 표지와 결합한 표지체로 이용할 수 있으며, 해당 표지체는, 예를 들어 대장암 등의 MELK를 발현하는 암세포 또는 암 조직을 감지하는데 더 바람직하다. 본 발명의 항체에 결합하는 표지로는 MELK에 결합된 항체를 검출할 수 있는 표지이면 되고, 친화도(affinity) 표지(예를 들면 비오틴(biotin), 아비딘(abidin) 등), 효소 표지(예를 들면 서양 고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 알칼리 포스파타아제(alkaline phophatase 등) 및 형광표지(예를 들면, FITC(Fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine) 등)을 들 수 있다.
본 발명의 항체를 암 치료를 위한 환자의 선택에 진단 시약으로 사용하는 경우, 본 발명의 항체는 그대로 사용할 수도 있지만, 다양한 사용형태에 적합한 조성물로 사용할 수도 있다.
Ⅰ. 정의
본 명세서에서 사용되는 "하나의 (a)", "하나의 (an)"와 "그 (the)"라는 단어는 특별히 명시하지 않는 한 "하나의"를 의미한다. 물질 (예를 들면, 펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오티드(polynucleotide) 등)에 대해 사용 "분리된"및 "정제된"이라는 용어는 해당 물질의 자연 발생원에 포함되어 있을 수 있는 최소한 1 종의 물질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 나타낸다. 따라서 분리 또는 정제된 항체는 항체가 유래한 세포 또는 조직원(source)에서 다른 세포 재료, 예를 들면 당질, 지질 및 다른 오염 단백질을 실질적으로 함유하지 않은 항체를 말한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 분리 또는 정제되어있다.
"폴리펩타이드(polypeptide)" 및 "단백질(protein)"이라는 용어는 본 명세서에서 호환적으로 사용되며, 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 이 용어는 천연 아미노산 중합체 외에 1 개 또는 복수의 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 비천연 아미노산 중합체에도 적용된다. 비천연 아미노산은 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체 등이 포함된다.
"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)", "올리고 뉴클레오티드(oligonucleotide)" 및 "핵산(nucleic acid)" 이라는 용어는 본 명세서에서 호환적으로 사용되며, 뉴클레오티드의 중합체를 말한다.
특별한 사정이 없는 한, "MELK 관련 질환"이라는 용어는 MELK 를 발현하는 암 또는 자궁내막증이다.
특별한 사정이 없는 한, "암"이라는 용어는 MELK 유전자를 과잉 발현하는 암을 말하며, 그 예로는 유방암, 방광암, 자궁 경부암, 담관 세포암, 만성 골수성 백혈병 (Chronic Myelogenous Leukemia, CML), 대장암, 식도암, 위암, 간암, 비소 세포 폐암 (Non-Small-Cell Lung Carcinoma, NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암 또는 소세포 폐암 (Small-Cell Lung Carcinoma, SCLC) 등이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "항체"라는 용어는 지정된 단백질 또는 펩타이드에 대한 특이적 반응성을 갖는 면역 글로불린 및 그 단편을 포함한다. 항체는 다른 단백질 또는 표지와 융합된 항체 및 이의 항체 단편을 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 항체는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 완전한 단클론 항체(intact monoclonal antibody), 다중클론 항체(polyclonal antibody) 적어도 두 완전한 항체로부터 형성되는 다중 특이성 항체(multi-specific antibody) (예를 들어, 이중 특이성 항체) 및 항체 단편을 포함한다. "항체"는 모든 클래스(class) (예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)를 가리킨다.
"항체 단편"은 완전한 항체(intact antibody)의 일부분이고 항체의 하나 이상의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 일반적으로 포함한다. 따라서 본 발명에서 항체 단편은 완전한 항체(intact antibody)의 하나 이상의 항원 결합 부분을 포함 할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 항체의 "항원 결합 부분"또는 "항원 결합 단편"라는 용어는 항원 (예를 들면, MELK)에 특이적으로 결합 할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 하나 또는 복수의 면역학적으로 활성화된 단편을 가리킨다. 항체의 항원 결합 기능은 완전한 항체(intact antibody)의 단편에 의해 수행 될 수 있다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab ', F (ab') 2 및 Fv 단편, 선형 항체, 및 단일 가닥 항체 분자가 포함된다. 구조에 관계없이 항체 단편은 완전한 항체(intact antibody)에 의해 인식되는 항원과 같은 항원에 결합한다. 또한 "항체 단편"이라는 용어는 특이적 항원에 결합하는 합성 폴리펩타이드 또는 유전자 조작 폴리펩타이드, 예컨대 경쇄가변영역에서 이루어진 폴리펩타이드, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된 'Fv' 단편, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역이 펩타이드 링커(peptide linker)에 의해 연결된 재조합 단일 가닥 폴리펩타이드 분자 ("scFv 단백질") 및 초가변 영역을 모방한 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위를 포함한다.
특별한 사정이 없는 한, 본 명세서에서 사용되는 기술용어 및 과학용어는 모두 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 공통적으로 이해되는 용어와 같은 의미를 가진다.
본 발명에서 MELK 단백질과 항체의 특이적인 결합은 예를 들어, 항체 간의 경쟁으로 판단할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 항체로서, 예를 들어, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄가변영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄가변영역을 포함한 항체를 참조하여 후보 항체의 특이성을 판단할 수 있다. 대표적인 참조 항체는 OTSMAb01이다. 참조 항체와 인간 MELK 단백질 사이의 항원- 항체 반응에 대해 후보 항체가 경쟁한 경우에 후보 항체가 참조 항체와 동일한 특이성을 가지는 것을 확인할 수 있다. 예를 들어, 후보 항체 부존재화로 MELK 단백질에 결합하는 항체의 양이, 후보 항체의 공존 하에서 참조 항체와 MELK 단백질을 반응시킨 때, 10 %, 20 %, 30 % 또는 40 % 더 바람직하게는 50 % 또는 그 이상의 참조 항체의 결합이 저해 된 경우 항체 간의 경쟁이 발생했다고 판정할 수 있다. 항체 간의 경쟁의 평가는 MELK 단백질뿐만 아니라 참조 항체가 결합하는 한 그 일부 펩타이드를 이용할 수도 있다. 바람직한 일부 펩타이드는 예를 들면 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 일부 펩타이드이다.
Ⅱ. 항체의 생산
본 발명은 항 MELK 단클론 항체(monoclonal antibody)를 사용한다. 본 발명의 항체는 해당 기술 분야에서 주지의 방법에 의해 제공된다. 본 발명에서 이용하는 예시적인 항체 생산 기술에 대해 다음에 설명한다.
(ⅰ) 단클론 항체(monoclonal antibody)
단클론 항체는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻을 수 있다. 즉 집단을 구성하는 개개의 항체는 약간의 양으로 존재할 수 있는 자연적인 변이를 제외하고 동일하다. 이와 같이, "단클론"라는 수식어는 항체가 별도의 항체의 혼합물이 아니라는 것을 의미한다.
예를 들어, 단클론 항체(Monoclonal antibody)는 Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)에 의해 최초로 기재된 하이브리도마(hybridoma)법을 이용해 생산할 수 있으며, 변형 DNA법(US4,816,567호)에 의해서도 생산될 수 있다.
하이브리도마(hybridoma)법에서 마우스(mouse) 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들면 햄스터 등을 MELK 폴리펩타이드 (MELK 단백질 또는 그 일부 폴리펩타이드)에 면역하여 MELK 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산 할 수 있는 림프구를 유발한다. 혹은 림프구를 in vitro에서 MELK 폴리펩타이드로 면역해도 된다. 그 후, 폴리에틸렌글리콜(Polyethyleneglycol) 등의 적절한 융합제를 이용하여 림프구를 골수종 세포(Myeloma cell)와 융합시켜 하이브리도마(hybridoma) 세포를 형성 시킨다 (Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
조제한 하이브리도마(hybridoma) 세포를 융합되지 않은 부모 골수종 세포(Myeloma cell)의 증식 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유하고 있는 적절한 배양 배지에 씨딩(seeding)하여 그 배양 배지에서 증식시킨다. 예를 들어, 부모 골수종 세포가 효소인 하이포잔틴-구아닌-포스포리보실전달효소 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, (HGPRT 또는 HPRT))가 결손 되어 있는 경우, 하이브리도마(hybridoma)의 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴 (hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin), 그리고 티미딘(thymidine) (HAT 배지)을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 HGPRT-결손 세포의 증식을 방해한다.
바람직한 골수종 세포(Myeloma cell)는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체 생산 세포에 의한 안정적이고 높은 수준의 항체 생산을 보조하며 HAT 배지 등의 배지에 감수성을 가지는 것이다. 바람직한 골수종 세포주는 마우스 골수종 주, 예를 들면 Salk Institute Cell Distribution Center (San Diego, California USA)에서 입수 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양에서 유래하는 것, 및, American Type Culture Collection, (Manassas , Virginia, USA)에서 입수 가능한 SP-2 세포 또는 X63-Ag8-653 세포를 포함한다. 인간 단클론 항체(monoclonal antibody)의 생산에 대해 인간 골수종 세포주 및 마우스(mouse)-인간 헤테로(hetero) 골수종 세포주도 기재되어있다. (Kozbor, J. Immunol., 133 : 300 1 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마(hybridoma) 세포가 증식하고 있는 배양 배지를 항원에 대한 단클론 항체(monoclonal antibody)의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마(hybridoma) 세포에 의해 생산된 단클론 항체(monoclonal antibody)의 결합 특이성은 면역 침강법(immunoprecipitation method) 또는 in vitro 에서 방사 면역 측정법 (RIA) 또는 효소 결합 면역 흡착 측정 (ELISA)와 같은 결합 측정법(binding assay)에 의해 측정된다.
단클론 항체(monoclonal antibody)의 결합 친화도(binding affinity)는 예를 들어, 30 Scatchard analysis(Munson et al., Anal Biochem. 107 : 220-39 (1980) )에 의해 측정할 수 있다.
원하는 특이성(specificity), 친화도(affinity) 및 / 또는 활성도(activity)를 가지는 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma) 세포를 동정한 후, 복제 한계 희석법(limiting dilution)에 따라 클로닝(cloning)하고 표준 방법(standard method)에 의해 증식시킬 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이 목적에 적합한 배양 배지의 예로 D-MEM 배지 또는 RPMI1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마(hybridoma)세포는 동물 내의 복수 종양(ascites neoplasms)과 같이 in vivo 에서도 증식할 수 있다.
서브 클론(subclone)에 의해 분비되는 단클론 항체(monoclonal antibody)는 균일하게 될 때까지 정제 할 수 있다. 예를 들어, 일반적인 단백질에 사용되는 분리법 및 정제법에 따라 항체를 분리 및 정제 할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지 않지만, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 등의 컬럼 크로마토그래피(column chromatography), 필터(filter), 한외 여과(ultrafiltration), 염석(salting-out), 투석(dialysis), SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) 및 등전점 전기영동(isoelectric focusing electrophoresis)의 사용을 적절히 선택, 조합함으로써 항체를 배지, 복수 또는 혈청에서 적절하게 분리 할 수 있다 (Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). 단백질 A 컬럼 및 단백질 G 컬럼은 친화성 컬럼(affinity column)으로 사용할 수 있다. 예를들면, 사용되는 단백질 A 컬럼은 예를 들어, Hyper D, POROS 및 Sepharose F.F. (Pharmacia)가 포함된다.
예시적인 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 이외에 이온 교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 소수성 크로마토그래피(hydrophobic chromatography), 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography), 역상 크로마토그래피(reversed-phase chromatography), 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography ) 등이 포함된다 (Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). 크로마토그래피 절차는 HPLC 및 FPLC 등의 액상 크로마토그래피(liquid-phase chromatography)에 의해 할 수도 있다.
단클론 항체(monoclonal antibody)를 코딩(coding)하는 DNA는 종래의 절차를 사용하여 (예를 들어, 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩(coding)하는 유전자에 특이 적으로 결합 할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브(oligonucleotide probe)를 사용하여) 쉽게 분리되고, DNA서열이 결정된다. 하이브리도마(hybridoma) 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원 역할을 한다. DNA를 분리한 후, DNA를 발현 벡터(expression vector)내에 배치하고, 이것을 대장균 (E.coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 골수종 세포(myeloma cell) 또는 다른 방법으로는 면역 글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포(host cell)에 감염(transfecting)시켜 단클론 항체(monoclonal antibody)를 합성 할 수 있다. 항체를 코딩하는 DNA의 세균 중에서 재조합 발현에 관한 총설은 Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5 : 256-262 (1993) 및 Pluckthun, Immunol. Revs., 130 : 151- 188 (1992)를 포함한다.
MELK에 대해 반응을 나타내는 특이적인 항체 또는 항체 단편을 생산하기 위한 다른 방법은 세균 중에서 발현되는 면역 글로불린 유전자 또는 그 일부를 코딩(coding)하는 발현 라이브러리(expression library)를 MELK 단백질 또는 일부 펩타이드를 이용하여 선별하는 것이다. 예를 들어, 파지 발현 라이브러리(phage expression library)를 사용하여 전체 Fab 단편, VH 영역 및 Fv 영역을 세균 중에서 발현시킬 수 있다. 예를 들어, Ward et al., Nature 341 : 544-546 (1989); Huse et al., Science 246 : 1275-1281 (1989); 및 McCafferty et al., Nature 348 : 552-554 (1990)에 이에 대한 것이 나와있다. 예를 들어 MELK 펩타이드를 이용하여 이러한 라이브러리(library)를 선별하여, MELK에 대해 반응성을 갖는 면역 글로불린 단편을 식별 할 수 있다. 또는 항체 또는 그 단편을 생산하기 위해 Genpharm에서 입수할 수 있는 SCID-hu 마우스를 사용할 수 있다.
추가 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 McCafferty et al., Nature, 348 : 552-554 (1990)에 기재 되어있는 기술을 이용하여 제작된 항체 파지 라이브러리(antibody phage library)로부터 분리 할 수 있다. Clackson et al., Nature, 352 : 624-628 (1991) 및 Marks et al., J MoL BioL, 222 : 581-597 (1991)에 파지 라이브러리(phage library)를 사용하여 마우스 항체 및 인간 항체의 를 분리하는 방법에 대해 각각 기재되어있다. 그 출판물은 chain shuffling에 의해 높은 친화도(affinity) (nM 범위)를 가지는 인간 항체의 생산 (Marks et al., BioTechnology 10 : 779-783 (1992)), 및 매우 큰 파지 라이브러리(phage library)를 구축하기 위한 전략으로서 조합 감염(Combinatorial infection ) 및 in vivo에서 재조합(recombination) (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21 : 2265-2266 (1993))에 대해 기재되어있다. 따라서 이러한 기술은 단클론 항체(monoclonal antibody) 분리를 위한 종래의 단클론 항체(monoclonal antibody) 하이브리도마(hybridoma) 기술을 대체할 수 있는 수단이다.
본 발명은 MELK 관련 질환의 진단, MELK 저해제 치료 후 약효 판정 및 MELK 저해제 치료 효과가 높은 개체의 선별에 적합한 항체를 제공한다. 본 발명은 면역 조직 화학 염색에서 높은 특이성으로 MELK 단백질을 검출 할 수 있는 마우스 단클론 항체 클론(monoclonal antibody clone) (OTSMAb01)을 밝히는데에 성공했다. 이 항체 클론(clone)을 유방암 임상 검체의 면역 조직 화학 염색에 사용하면 유방암 검체에서 양성 소견이 인정되지만, 정상 유방 검체에서는 거의 염색되지 않는 것으로 입증되었다. 또한 시판 항MELK 항체를 이용하면 MELK 고 발현 세포주와 저 발현 세포주 중에서 제작 된 시료에서도 염색이 확인 된 반면, 본 발명의 항MELK 항체를 이용한 경우, MELK 고 발현 세포주에서 제작된 시료에서 특이적으로 염색되는 것으로 밝혀졌다. 이처럼 높은 항원 특이성을 갖는 본 발명의 항체는 MELK 발현 수준이 높은 환자, 나아가서 MELK 저해제 치료가 효과적일 가능성이 높은 환자를 선택하는 데 유리하다.
본 발명의 항MELK 마우스 단클론 항체 클론(monoclonal antibody clone) (OTSMAb01)의 중쇄가변영역 (H 사슬 V 영역) 및 경쇄가변영역 (L 쇄 V 영역)의 아미노산 서열은 각각 서열번호7 및 8에 표시된 바 있다.
중쇄가변영역 및 경쇄가변영역에 포함된 CDR (상보성 결정 영역)은 본 기술 분야에서 주지한 방법에 따라 결정할 수 있다. 예를 들어 CDR을 결정하는 방법은 Kabat 등 (Kabat EA et al. (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest. 5th Edition) 또는 Chothia 등 (Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196; 901-917)의 방법이 일반적으로 사용된다. Kabat의 정의에 의해 결정되는 본 발명의 항 MELK 마우스 단클론 항체 클론(mouse monoclonal antibody) (OTSMAb01)의 중쇄가변영역의 CDR1,2,3은 각각 서열번호 1,2,3에 표시되며,경쇄가변영역의 CDR1,2,3은 각각 서열번호 4,5,6에 기재되어 있다.
따라서 본 발명은 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역 중 하나 이상을 포함하는 MELK 단백질 또는 이의 일부 펩타이드에 결합 할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 중쇄가변영역은
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고, 경쇄가변영역은
서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는
항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)을 제공한다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 항체가 결합하는 MELK 단백질의 일부 펩타이드는 바람직하게는 MELK 단백질(서열번호 22)의 264-601 위치에 해당하는 아미노산 서열 (서열번호 9)를 포함하고, 서열번호 22에서 선택된 아미노산 서열로 구성된다. 보다 바람직하게는 본 발명의 MELK 단백질의 일부 펩타이드는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
상기 "서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3에 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3"를 포함하는 중쇄가변영역의 하나의 예는 서열번호 7에 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역이다. 위의 "서열번호 4에 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 5에 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 6에 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3"를 포함하는 경쇄가변영역의 하나의 예는 서열번호 8에 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역이다.
따라서 구체예로서, 본 발명은 서열번호 7에 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 8에 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역 중 하나 또는 모두를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명의 항체는 종래의 방법으로 제조 할 수 있다. 예를 들어, 기존의 유전자 조작 기술에 따라 항체 폴리펩타이드를 코딩(coding)하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 벡터에 내장하고, 상기 벡터를 숙주에 도입하며 숙주에서 항체를 생산함으로써, 항체를 제조 할 수 있다 (Vandamme, AM et al., Eur. J. Biochem (1990) 192, 767-75을 참조).
본 발명의 항체의 가변 영역 (V 영역)을 코딩(coding)하는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 본 발명의 항체의 V 영역의 아미노산 서열에서 유추 할 수 있다. 본 발명의 항체 클론(clone)의 중쇄가변영역 (VH) 및 경쇄가변영역 (VL)을 코딩(coding)하는 핵산 서열은 각각 예를 들어, 서열번호 10 및 11에 표시된 핵산 서열을 사용할 수 있다 . 본 발명의 항체의 V 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열정보에 따라 고상 기술(solid phase technique) (Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron (1992) 48, 2223-311; Matthes et al., EMBO J (1984) 3, 801-5) 및 올리고 뉴클레오티드 합성 기술 (Jones et al., Nature (1986) 321, 522-5)과 같은 종래의 방법으로 합성 할 수 있다.
항체 V 영역을 코딩(coding)하는 폴리뉴클레오티드를 항체 정상 (C) 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터(expression vector)에 삽입 한다.
본 발명에서 사용되는 항체의 생산을 위해 상기 항체 (항체 유전자)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현 제어 요소 (예를 들어, 인핸서(enhancer) 또는 프로모터(promoter))의 제어 하에 항체 유전자가 발현 할 수 있도록 발현 벡터(expression vector)에 삽입 한다 . 상기 발현 벡터를 이용하여 숙주 세포(host cell)를 형질 전환하여 항체를 발현시킨다.
항체유전자의 발현에서 항체 H 사슬을 코딩(coding)하는 폴리뉴클레오티드 및 L 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 별도의 발현 벡터(expression vector)에 삽입할 수도 있고, 그 후 얻어진 재조합 발현 벡터(expression vector)를 모두 하나의 숙주세포(host cell)에 함께 형질전환 시킬수도 있다. 그 후 얻어진 재조합 발현 벡터를 숙주 세포(host cell)에 형질 전환시킨다. ( 예를 들면, WO94 / 11523 호).
항체 유전자는 종래의 방법에 의해 발현시킬 수 있다. 포유류 세포의 발현의 경우, 기존의 유용한 프로모터(promoter), 발현되는 항체 유전자, 및 폴리 (A) 신호 (항체 유전자의 3 '말단에 하류에 위치)를 기능적으로 연결시킬 수 있다 . 예를 들어, human cytomegalovirus immediate-early 프로모터(promoter)/인핸서(enhancer) system이 유용한 프로모터(promoter) / 인핸서(enhancer) 시스템으로 사용될 수 있다.
다른 프로모터(promoter) / 인핸서(enhancer) 시스템, 예를 들면, 바이러스 (예를 들어, 레트로 바이러스(retrovirus), 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 아데노 바이러스(adenovirus) 및 원숭이 바이러스 40(simian virus 40, SV40)에서 유래 한 것, 및 포유류 세포에서 유래하는 것 (예를 들어, 인간 신장 인자 1α (Human Elongation Factor 1α, (HEF1α))를 본 발명의 항체 발현에 사용할 수도 있다.
SV40 프로모터(promoter) / 인핸서(enhancer) 시스템이 사용되는 경우, 유전자 발현은 (Mulligan et al., (Nature (1979) 277, 108-14)의 방법에 의해 쉽게 할 수 있다. HEF1α 프로모터(promoter) / 인핸서(enhancer) 시스템이 사용되는 경우, 유전자 발현은 (Mizushima et al., (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)의 방법에 의해 쉽게 할 수 있다.
대장균에서 발현의 경우 기존의 유용한 프로모터(promoter), 항체를 분비하기 위한 신호(signal) 서열 및 항체 유전자를 기능적으로 연결시킬 수 있다. 프로모터(promoter)로는 lacZ 프로모터(promoter) 또는 araB 프로모터(promoter)를 사용할 수 있다. lacZ 프로모터(promoter)가 사용되는 경우, 유전자 발현은 (Ward et al. (Nature (1098) 341, 544-6 .; FASBE J. (1992) 6, 2422-7)의 방법으로 할 수 반면, araB 프로모터(promoter)가 사용되는 경우, 유전자 발현은 (Better et al. (Science (1988) 240, 1041-3)의 방법으로 할 수 있다.
항체 분비를 위한 신호(signal) 서열에 관해서, 항체가 대장균의 세포 주변 강(periplasmic space)으로 분비되는 것이 의도 된 경우, pelB 신호(signal) 서열 (Lei, SP et al., J. Bacteriol (1987) 169 , 4379-83)을 사용할 수 있다. 세포 주변 강(periplasmic space)으로 분비 된 항체를 분리 후 항체가 적절한 입체 구조를 취하도록 다시 접힌다.
바이러스 (예를 들어, SV40 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 아데노 바이러스(adenoviruses), 소 파필 로마 바이러스 (Bovine papillomavirus, BPV)) 등에서 유래한 복제 기점을 사용할 수 있다. 숙주 세포 계(host cell system)의 유전자 카피 수를 증가시키기 위해 발현 벡터(expression vector)는 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제 (aminoglycoside phosphotransferase , (APH)) 유전자, 티미딘 키나제 (thymidine kinase , (TK)) 유전자, 대장균 크산틴-구아닌 포스포리보실 전이 효소 (E. coli hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase, (Ecogpt)) 유전자 및 디히드로 엽산 환원 효소 (dihydrofolate reductase, (dhfr)) 유전자 등의 선택 마커 유전자(selection marker gene)를 더 포함 할 수있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 생산에 관해서는 진핵 생물과 원핵생물의 세포 계를 포함한 임의의 발현 시스템을 사용할 수 있다. 진핵 세포는 동물 (예, 포유류, 곤충, 곰팡이 및 곰팡이, 효모)의 수립 세포주(established cell lines)가 포함된다. 원핵생물 세포는 대장균 세포 등의 세균 세포가 포함된다. 본 발명에서 사용되는 항체는 CHO 세포, COS 세포, 골수종 세포, BHK 세포, Vero 세포 및 HeLa 세포 등의 포유류 세포에서 발현되는 것이 바람직하다.
다음 형질 전환 된 숙주 세포를 in vivo 또는 in vitro에서 배양하여 관심 개체의 항체를 생산한다. 숙주 세포의 배양은 임의의 공지의 방법으로 할 수 있다. 본 명세서에서 사용할 수 있는 배양 배지는 DMEM, MEM, RPMI1640 또는 IMDM 배지 일 수 있다. 배양 배지는 소 태아 혈청 (Fetal Calf Serum, (FCS)) 등의 혈청 보충제를 포함 할 수 있다.
재조합 항체의 생산에 있어서, 상기 숙주 세포 외에 유전자 변형 동물을 숙주로 사용할 수도 있다. 예를 들어, 항체 유전자를 동물의 모유에서 원래 생산 된 단백질 (예를 들어, β-casein)을 코딩(coding)하는 유전자의 소정 부위에 삽입하여 융합 유전자를 제조한다. 항체 유전자가 도입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편을 비-인간 동물의 배아에 주입하고, 이 배아를 다음에, 자성(female) 동물에 도입한다. 상기 배아를 체내에 가지고 해당 자성(female) 동물은 유전자 변형이 된 비-인간 동물을 낳는다. 관심 개체의 항체는 상기 유전자 변형이 된 비-인간 동물 또는 그 자손에서 모유로 분비된다. 상기 항체를 함유하는 모유의 양을 증가시킬 목적으로 적절한 호르몬을 상기 형질 전환 동물에 투여 할 수 있다 (Ebert, K.M. et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702).
상기 발현되어 생산된 항체를 세포 또는 숙주 동물의 몸에서 분리, 정제 할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 분리 및 정제는 친화도 컬럼(affinity column)으로 할 수 있다. 항체의 분리 및 정제에 종래 사용되는 다른 방법을 이용할 수도 있으며, 따라서 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 다양한 크로마토그래피, 여과(filtration), 한외 여과(ultrafiltration), 염석(salting-out) 및 투석(dialysis)을 단독으로 또는 조합하여 사용하여 관심이 있는 항체를 분리 및 정제 할 수 있다 (Antibodies A Laboratory Manual Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
(ⅱ)항체 단편(antibody fragment)
다양한 기술이 항체 단편의 생산을 위해 개발되고 있다. 그러나 이러한 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산 할 수있다. 예를 들어, 항체 단편을 항체 파지 라이브러리(antibody phage libraries)로부터 분리 할 수있다. 또는 Fab'-SH 단편을 대장균에서 직접 회수하여 화학적으로 결합하여 F (ab ') 2 단편을 형성 시킬 수도 있다 (Carter et al., Bio / Technology 10 : 163-167 ( 1992)). 다른 접근법에 따르면, F (ab ') 2 단편을 재조합 숙주 세포 배양물 로부터 직접 분리 할 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 구체 예에서, 최적의 항체는 단일 가닥 Fv 단편 (scFv)이다. WO93 / 16185 호; US5,571,894 호; 및 US5,587,458 호를 참조하기 바란다. 또한 항체 단편, 예를 들어 US5,641,870 호에 예를 들어 설명 된 바와 같이, "선형 항체"이어도 좋다. 이러한 선형 항체 단편은 단일 특이성 또는 이중 특이성을 가지고 있다.
(ⅲ) 표지된 항체
본 발명의 항체를 선택적으로 선호도 표지, 효소 표지, 방사성 동위 원소, 형광 표지 또는 화학 발광 신호와 결합시킨다. 예를 들어, MELK를 발현하는 암 내부에 존재하고 검출 가능한 표지의 존재에 의해 진단되는 개체의 암 또는 종양의 유무의 판정이 가능하게 된다. 또한 암 내부 표지의 부위 병소 부위에 의해 질병의 확대를 판정 할 수 있다.
사용에 적합한 표지는 예를 들면, 플루오레세인(fluorescein) 및 로다민(rhodamine) 등의 형광 표지; 및 루시페라아제(luciferase) 등의 효소 표지를 포함한다. 검출한 표지/검출에 사용된 표지는 사용된 이미징(imaging) 양식에 따라 선택된다. 그러한 표지 및 항체의 결합체는 본 기술 분야에서 공지 된 프로토콜 및 기술을 이용하여 제조 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 본 발명의 항체는 사용 직전에 원하는 표지와 결합 할 수도 있고, 표지와 결합 된 항체로 제공될 수도 있다.
항체와 표지의 결합체는 N-숙신이미딜 -3- (2- 피리딜디티오) 프로피오네이트 (N-Succinimidyl- 3-(2-pyriltriol)propionate, (SPDP)), 숙신이미딜 -4- (N- 말레이미도메틸) 시클로헥산 -1- 카르복실레이트, 이미노티오란 (Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate, iminothiolane (IT)), 이미도에스테르(imidoester)의 두 기능의 유도체 (예, 아디피미딕 산 디메틸, (Adipimidic acid dimethyl, (HCL))), 활성 에스테르 (예 디숙신이미달 수베린산, (Disuccinimidyl suberate)), 알데히드 (예, 글루타르알데히드, (glutaraldehyde)), 비스-아자이드 화합물 (예, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산 디아민, (bis-(p-azidobenzoyl)hexanediamine)), 비스-디아조늄 유도체 (예, 비스 -(p-디아조늄 벤조일)-에틸렌디아민(bis-(p-diazonium benzoyl)-ethylenediamine)), 디이소시아네이트(diisocyanates) (예, 톨루엔 2,6- 디이소시아네이트(toluene-2,6-diisocyanate)) 및 비스-활성 불소 화합물(bis-active fluorine compounds) (예, 1,5- 디플루오로-2,4-디니트로 벤젠(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene)) 등의 다양한 두 기능성 단백질 커플링(coupling)제를 이용하여 제조 할 수 있다. 또는 항체 및 표지를 포함한 융합 단백질, 예를 들면 재조합 기술 또는 펩타이드 합성에 의해 제조 할 수 있다. 이러한 융합 단백질의 바람직한 예로는 ECFP, EYFP 또는 EGFP 등의 표지 단백질 및 항체 융합 단백질을 들 수 있다.
III.MELK 관련 질환의 진단, MELK 저해제의 치료 효과가 높은 개체 선별 (치료 전 진단) 또는 MELK 저해제 치료 후 약효 판정 (치료 후 진단)
MELK는 MELK 관련 질환의 진단 마커로서뿐 아니라 이러한 질환의 MELK 저해제에 대한 반응 및 해당 저해제의 약효를 평가하기 위한 마커로서 유용하다. 따라서, 본 발명의 항체는 암 등의 MELK 관련 질환을 진단하기 위해 MELK 저해제 치료 효과가 높은 개체를 선별하기 위해 또는 MELK 저해제 치료 후 약효를 판정하기 위한 마커 검출 시약으로 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 항체에 의해 개체에서 분리된 시료 중의 MELK 단백질을 감지하고 MELK 관련 질환의 진단, MELK 저해제 치료 효과가 높은 개체의 심사 또는 MELK 저해제 치료 후 의약 판정을 실시 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 개체에서 분리 한 시료에서 본 발명의 항체를 사용하여 MELK 단백질을 검출하는 것에 의한 개체에서 MELK 관련 질환 또는 해당 질환의 발병 소인(predisposition)을 진단하는 방법 MELK 저해제 치료 효과 높은 개체를 선별하는 방법 및 MELK 저해제 치료 후 약효를 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 다음의 단계를 포함한다 :
(a) 개체에서 분리 된 시료를 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계.
(b) 상기 시료와 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)의 결합을 검출하여 상기 시료 내의 MELK 단백질을 검출하는 단계; 및
(c) 상기 시료 내 MELK 단백질 수준을 대조군과 비교하는 단계.
전형적인 양태에 있어서, 상기 시료는 상기 개체에서 분리한 세포 또는 조직이며, 바람직하게는, 상기 개체에서 분리된 조직이다. 따라서 일반적으로 본 발명의 각 방법은 모두 개체에서 분리 된 시료에 대해 in vitro에서 실시된다. 생검(biopsy) 및 채혈 등의 방법에 의해 개체에서 조직이나 세포를 분리하는 방법은 공지되어 있다. 또는 치료를 위한 의료적 처치 (외과적 수술 등)을 통해 개체에서 제외된 생체 시료를 이용할 수도 있다. 개체에서 분리 된 세포와 조직은 항체와 접촉하기 전에 적절하게 처리 할 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 개체에서 얻은 조직 시료는 동결 후 절편으로 알코올이나 포르말린 등으로 추가로 고정하여 면역 조직학적 분석을 위한 시료로 할 수 있다. 또는 포르말린 등으로 조직 시료나 배양 세포 등을 고정 후 파라핀 포매(paraffin embedding)하여 면역 조직학적 분석을 위한 절편을 얻을 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 시료와의 결합, 즉 시료 중의 항원 단백질과의 결합은 당업자의 공지의 방법에 의해 검출 할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 항체와 상기 시료와 접촉 후 시료 중의 MELK에 결합하지 아니한 항체를 세척하여 제거한 다음에 시료 중에 남아있는 항체를 검출함으로써, 본 발명의 항체와 시료 중의 MELK 단백질의 결합을 검출 할 수 있다. 이때 항체가 직접 표지된 경우에는 표지를 검출하여 MELK 단백질에 결합 된 본 발명의 항체의 존재를 검출 할 수 있다. 표지는 효소, 형광 물질, 발광 물질 또는 입자 등의 검출 가능한 것이면 이러한 징후를 즉시 감지 할 수 있다. 그 외에 본 발명의 항체를 비오틴(biotin) 등의 친화도(affinity) 물질 (결합 물질)로 표지 한 경우 (친화도 표지, affinity 표지)는 표지 아비딘(abidin) 등의 결합 파트너로 항체의 존재를 포착 할 수 있다. 또는 본 발명의 항체가 직접 표지되지 않은 경우에는 항체에 대한 결합 시약에 의해 본 발명의 항체를 검출 할 수있다. 예를 들어, 단백질 A나 항체에 대한 항체를 표지한 항체의 검출에 항체 결합 시약으로 이용할 수 있다.
MELK 관련 질환의 진단의 경우, 상기 단계 (c)에서 대조 수준 (정상 대조군 수준, 바람직하게는 MELK 관련 질환을 앓고 있지 않은 건강한 개체에서 분리 된 시료 중의 MELK 단백질의 발현 수준)에 비해 MELK 단백질 수준이 높을 때, 개체가 MELK 관련 질환을 앓고 있거나 발병 위험이 있을 수 있다는 것을 의미한다.
또한 MELK 저해제 치료 효과가 높은 개체 선별의 경우 상기 단계 (c)에서 대조 수준 (바람직하게는 MELK 관련 질환으로 진단된 개체의 조직에서 MELK 단백질의 발현 수준)에 비해 MELK 단백질 수준이 비슷하거나 그보다 높은 경우 개체에서 MELK 저해제 치료 효과가 높은 것으로 나타난다.
한편 MELK 저해제 치료 후 약효 판정의 경우, 상기 단계 (c)에서 대조 수준 (바람직하게는 약 투여 전에 개체에서 분리된 시료 중의 MELK 단백질의 발현 수준)에 비해 MELK 단백질 수준이 낮을 때 개체의 약효가 있었던 것으로 나타난다.
본 발명의 진단 방법으로 보았을 때, MELK 관련 질환이 있는 것으로 나타난 환자는 MELK 저해제 치료의 개체가 될 가능성이 높다. 따라서, 본 발명의 진단 방법에 따라, MELK 관련 질환을 가진 것으로 나타난 환자에 MELK 저해제를 투여 할 수있다. 또는 MELK 저해제의 치료 효과가 높을 가능성이 나타난 환자도 선별을 거쳐 MELK 저해제를 투여 할 수 있다. 또한 MELK 저해제를 투여받은 환자에서 당해 저해제의 치료 효과가 있던 것으로 나타난 경우에도 계속 같은 환자에 MELK 저해제를 투여 할 수 있다.
즉, 본 발명은 이하의 군에서 선택되는 어느 환자를 본 발명의 방법에 의해 특정하여 당해 환자에 MELK 저해제를 투여하는 단계를 포함하는 MELK 관련 질환을 치료하는 방법에 대한 것이다.
본 발명의 진단 방법으로 MELK 관련 질환을 가진 것으로 나타난 환자;
MELK 저해제의 치료 효과가 높을 가능성이 나타난 환자; 그리고
MELK 저해제를 투여받은 환자에서 당해 저해제의 치료 효과가 있던 것으로 나타난 환자.
본 발명에 있어서, 환자에게 투여되는 MELK 저해제는 공지의 화합물을 사용할 수 있다. 예를 들어, MELK의 효소 작용을 저해하는 각종 화합물이 공지되어있다 (WO2012 / 016082, WO2013 / 109388, Oncotarget 2012, 3 : 1629-1640, Oncotarget. 2016; 7 : 17652-17664).
본 발명과 관련해서 MELK 관련 질환을 앓고 있지 않은 (예를 들면, 비 암(cancer)성) 것으로 알려진 생체 시료에서 측정된 대조 수준은 '정상 대조군 수준 "이라고 불린다. 개체에서 분리된 시료의 MELK 단백질 수준이 정상 대조군 수준과 비교하여 높은 경우 개체는 치료를 받는 MELK 관련 질환을 가진 것으로 진단 될 수 있다.
한편 MELK 관련 질환을 앓고 있는 (예를 들어, 암(cancer)성) 것으로 알려진 생체 시료에서 측정된 대조 수준은 "질환 대조 수준 (예를 들어, 암 대조군 수준)"이라고 불린다. MELK 저해제 이전 개체에서 분리된 시료의 MELK 단백질 수준이 질환 대조 수준과 비슷하거나 그보다 높은 경우 개체는 MELK 저해제 치료 효과가 높다고 진단 될 수 있다.
또한 MELK 저해제 치료 후 개체에서 분리 된 시료의 MELK 단백질 수준이 약 투여 전 같은 개체 질환 대조 수준보다 낮은 경우, 치료에 의한 약효가 있었다, 즉 개체는 MELK 저해제 치료 효과가 높다고 진단 될 수 있다.
특정 구체 예에서, 치료해야 하는 MELK 관련 질환 (예를 들면, 암성(cancerous))을 갖는 기관의 비 이환 영역(unaffected region) (예를 들면, 비암성(noncancerous) 영역)에서 얻어진 정상 세포 (또는 조직)을 성공적 대조군으로 사용하여도 좋다. 또 다른 측면에서 대조적 수준은 질환 상태 (예를 들어, 암성(cancerous) 또는 비암성(noncancerous))를 알고 있는 개체 유래의 시료에서 미리 측정 된 MELK 단백질 수준을 분석하여 얻은 결과에 따라 통계적 방법에 의해 결정할 수 있다. 또한 대조 수준은 이전에 시험 된 시료 (세포 또는 조직)에서 유래한 발현 패턴의 데이터베이스에서 더 유래 할 수 있다. 평가 개체 시료가 조직 시료 인 경우, 이와 같은 조직에서 유래하는 시료를 대조 시료로 하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 하나의 국면에 따라, 생체 시료 중의 MELK 단백질 수준은 여러 참조 시료에서 측정되는 여러 대조 수준과 비교 될 수 있다. 개체에서 유래한 생체 시료의 조직형과, 유사한 조직 형태에서 유래한 참조 시료에서 측정 된 대조 수준을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 질환 상태가 알려진 집단의 MELK 단백질 수준의 기준치를 이용하는 것이 바람직하다. 기준치는 당 기술 분야에 공지 된 임의의 방법에 의해 얻을 수있다. 예를 들어, 평균 + 2 S.D. 또는 평균 +/- 3 S.D.의 범위를 기준치로 사용할 수 있다.
시료 중의 MELK 단백질 수준은 그 수준이 대조 수준에서 예를 들면 10 %, 25 % 또는 50 % 높거나 1.1 배 이상 1.5 배 이상 2.0 배 이상 5.0 배 이상, 10.0 배 이상 혹은 그 이상 높으면 높다고 볼 수 있다. 시료 중의 MELK 단백질 수준은 그 수준이 대조 수준에서 예를 들면 10 %, 25 % 또는 50 % 낮거나, 1.1 배 이상 1.5 배 이상 2.0 배 이상 5.0 배 이상, 10.0 배 이상 혹은 그 이상 낮은 경우 낮다고 볼 수 있다.
전형적인 예에서, MELK 관련 질환은 MELK을 발현하는 암 또는 자궁 내막증이다. MELK를 발현하는 암, 예를 들면, 유방암, 방광암, 자궁 경부암, 담관 세포 암, 만성 골수성 백혈병 (Chronic Myelogenous Leukemia, CML), 대장암, 식도암, 위암, 간암 비소 세포 폐암 (Non-Small-Cell Lung Carcinoma, NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선 암, 신장 암, 또는 작은 세포 폐암 (Small-Cell Lung Carcinoma, SCLC)이지만, 이에 한정되지 않는다.
추가 구체 예에서, 본 발명은 MELK 관련 질환 또는 해당 질환의 발병 소인(predisposition)의 진단 마커를 검출하는 방법으로서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여 시료 중의 MELK 단백질을 상기 진단 마커 로 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. MELK은 일종의 암 세포에서 정상 조직에 비해 발현이 강화되는 것으로 밝혀졌다. 따라서 MELK의 발현 수준을 특이적으로 검출 할 수 있다면, 그것은 관련 질환의 진단 마커로서 유용하다. 본 발명과 관련해서 MELK 관련 질환 또는 해당 질환의 발병 소인(predisposition)의 진단 마커는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과의 결합에 의해 감지되는 개체로부터 분리 된 시료 중의 MELK 단백질이며, 그 발현 수준이 대조군 수준과 비교하여 높은 때 해당 개체가 해당 질환을 앓고 있거나 발병 위험이 있을 수 있다고 표시되는 것을 특징으로 한다. 여기서, 상기 대조 수준은 정상 대조군 수준, 바람직하게는 MELK 관련 질환을 앓고 있지 않은 건강한 개체에서 분리한 시료 중의 MELK 단백질의 발현 수준이다. 일반적으로 대조 수준 진단 마커를 검출하려고하는 암 세포에서 유래하는 조직과 같은 조직에서 발현 수준인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 MELK 관련 질환 또는 해당 질환의 발병 소인(predisposition)의 진단에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 또는, 본 발명은 MELK 관련 질환 또는 해당 질환의 발병 소인(predisposition)을 진단하는 시약의 제조에있어서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 사용을 제안한다.
또한, 본 발명은 MELK 저해제 치료 반응 마커를 검출하는 방법으로서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여 시료 중의 MELK 단백질을 상기 반응 마커로 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. MELK은 일종의 암 세포에서 특이 적으로 발현이 증강하고 있으며, 이러한 암세포의 증식이 MELK 저해제에 의해 저해되는 것으로 밝혀졌다 (WO2004 / 031413, WO2006 / 016525, WO2007 / 013665, WO2008 / 023841). 즉, MELK의 발현을 지표로 MELK 저해제에 대한 반응을 예측할 수 있다. MELK을 높은 수준으로 발현하고 있으면 MELK 저해제에 의한 세포 증식 억제 작용을 기대할 수 있기 때문이다. 따라서 MELK의 발현 수준을 특이적으로 검출 할 수 있다면 MELK 저해제 치료 반응 마커로서 유용하다. 본 발명과 관련해서, MELK 저해제 치료 반응 마커는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과의 결합에 의해 감지되는 개체로부터 분리 된 시료 중의 MELK 단백질이며, 그 발현 수준이 대조군 수준과 비교하여 비슷하거나 그보다 높은 경우 해당 개체의 MELK 저해제 치료 효과가 높은 것으로 나타나는 것을 특징으로 한다. 여기서, 상기 대조 수준은 ,바람직하게는 질환 대조 수준, 즉 MELK 관련 질환을 앓고있는 것으로 알려진 개체의 질환 부위에서 분리된 시료의 MELK 단백질의 발현 수준, 특히 바람직하게는 MELK 저해제에 의한 치료 효과가 높은 개체에서 치료 전에 분리된 시료의 MELK 단백질의 발현 수준이다.
본 발명은 또한 MELK 저해제 치료 효과가 높은 개체에 대한 검사에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 또는, 본 발명은 MELK 저해제 치료 효과가 높은 개체을 선별하기 위한 시약의 제조에있어서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 사용을 제안한다.
본 발명은 또한 MELK 저해제의 약효 마커를 검출하는 방법으로서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여 시료 중의 MELK 단백질을 상기 의약 마커로 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공 한다. MELK은 일종의 암 세포에서 특이적으로 발현이 증강하고 있으며, 이러한 암세포의 증식이 MELK 저해제에 의해 저해되는 것으로 밝혀졌다 (WO2004 / 031413, WO2006 / 016525, WO2007 / 013665, WO2008 / 023841). 따라서 이러한 암세포를 갖는 암 조직은 MELK 저해제에 의해 축소 또는 사멸 할 수 있다. 즉, MELK의 발현 수준을 지표로서 이러한 암 세포를 갖는 개체의 MELK 저해제의 효능을 평가할 수있다. MELK 양성 암세포를 가지고 있던 조직에서 분리된 시료의 MELK의 발현 수준이 MELK 저해제 치료 전에 분리 된 시료와 비교하여 감소하고 있으면 MELK 저해제에 의해 MELK 양성 암세포가 감소했다고 간주 할 수 있기 때문이다. 따라서 MELK의 발현 수준을 특이적으로 검출 할 수 있다면 MELK 저해제의 약효 마커로서 유용하다. 본 발명과 관련해서 MELK 저해제의 약효 마커는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과의 결합에 의해 감지되는 MELK 저해제를 투여된 개체에서 분리 된 시료 중의 MELK 단백질로서 발현 수준이 대조군 수준과 비교하여 낮은 경우 해당 개체에서 MELK 저해제의 약효가 있었음을 표시하는 것을 특징으로 한다. 여기서, 상기 대조 수준은 바람직하게는 약 투여 전에 해당 개체의 질환 부위에서 분리된 시료 중의 MELK 단백질의 발현 수준이다.
본 발명은 또한 MELK 저해제 치료 후 약효 판정에 사용하기위한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 또는, 본 발명은 MELK 저해제 치료 후 약효를 판정하기 위한 시약의 제조에 있어서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 사용을 제안한다.
IV. MELK 관련 질환의 진단, MELK 저해제 치료 효과가 높은 개체의 선별 또는 MELK 저해제 치료 후 약효 판정용 시약이나 키트(kit)
본 발명은 MELK 관련 질환의 진단, MELK 저해제 치료 효과가 높은 개체의 선별 또는 MELK 저해제 치료 후 약효 판정용 시약이나 키트(kit)를 제공한다. 구체적으로는, 이 키트(kit)는 MELK 단백질의 검출 시약으로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 한 구체 예에서, 본 발명의 진단 시약 또는 장비에 대한 항체를 형광 물질, 발광 물질 또는 방사성 동위 원소로 표지 할 수 있다. 항체를 표지하는 방법 및 표지 항체를 검출하는 방법은 당 기술 분야에서 주지하며 임의의 표지 및 방법을 본 발명에 사용할 수 있다.
본 키트(kit)는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 다른 마커 검출 시약과의 조합을 포함 할 수 있다. 본 키트(kit)는 또한 MELK에 대한 양성 및 음성 대조 시약 및 본 발명의 항체를 검출하기 위한 이차 항체를 포함 할 수 있다. 예를 들어, MELK를 고 발현하고 있는 것으로 보이는 세포주의 배양 절편(culture section) 또는 조직 시료(tissue sample)는 유용한 양성 대조 시약으로 도움이 될 수 있다. 또한 예를 들어, 정상인 개체 또는 비 암성 조직에서 얻은 조직 시료는 유용한 대조군 시약으로 도움이 될 수 있다. 본 발명의 항체를 검출하기위한 이차 항체는 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위 원소 또는 효소로 표지되는 것이 바람직하다. 본 발명의 키트는 또한 완충액(buffer), 희석액(diluent), 필터(filter), 바늘(needle), 주사기(syringe) 및 사용 설명을 담은 첨부 문서 (예를 들어 서면, 테이프, CD-ROM 등)를 포함하여 상업적인 견지 또는 사용자의 입장 에서 바람직한 다른 물질을 포함 할 수 있다. 이러한 시약 등을 레이블(label) 된 용기에 보존 할 수 있다. 적절한 용기로는 병, 유리병 및 시험관이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱 등 다양한 재료로 만들 수 있다.
본 발명을 특정 실시예에 관하여 본 명세서에서 상세하게 설명하여 왔지만, 위의 설명은 사실상 예시적이고 설명적인 것으로서, 본 발명 및 그 바람직한 구체 예를 설명하기위한 것으로 이해되어야한다. 관례적인 실험을 통해, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고도 다양한 변경 및 수정이 그 속에서 이루어질 수 있다는 것을 쉽게 인식 할 것이다. 따라서 본 발명은 상기의 설명에 의해 규정되는 것이 아니라 첨부 된 특허 청구범위 그 등가물에 의해 규정된다.
이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 재료, 방법 및 실시예는 본 발명의 어떤 모양의 제작 및 사용에 있어서 당업자를 지원하는 데 도움을 줄 수 있는 한편, 본 발명의 국면을 설명하기위한 것에 불과하며, 따라서 본 발명 범위를 결코 한정하는 것을 예정하지 않는다. 당업자는 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 인용된 모든 선행 기술 문헌은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
다음 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[재료 및 방법]
세포배양
GenHunter에서 구입한 인간 태아 신장 세포주인 293T에 MELK 발현 벡터(expression vector)를 도입시킨 MELK 강제 발현 세포주 (MELK / 293T)를 제작하고 대조군으로 Empty Vector를 도입시킨 세포주 (Mock / 293T) 를 제작 하였다. 세포들을 5 % 의 CO2 로 가습한 환경 하의 37 ℃ 에서 10 % 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 보충한 DMEM 내에서 유지했다. ATCC에서 구입한 인간 유방암 세포주 MCF-7은 5 % 의 CO2 로 가습한 환경 하의 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토마이신(penicillin/streptomycin), 비 필수 아미노산, 피루브산 나트륨(sodium pyruvate) 및 인슐린을 보충한 MEM 내에서 유지했다. JCRB에서 구입한 인간 간암 세포주 Hep G2는 5 % 의 CO2 로 가습한 환경 하의 37 ℃ 에서 10 % 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 보충한 DMEM 내에서 유지했다. 동북대학가령의학 연구소에서 입수한 인간 췌장암 세포주 인 PK-45P, 대일본제약에서 구입한 인간 폐암 세포주 A549은 5 % CO2 로 가습한 환경 하의 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 보충 한 RPMI1640내에서 유지했다. ATCC에서 구입 한 인간 유방암 세포주 BT-549은 5 % CO2 로 가습한 환경 하의 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토마이신(penicillin/streptomycin), HEPES, 피루브산 나트륨(sodium pyruvate)과 인슐린을 보충한 RPMI1640내에서 유지했다. ATCC에서 구입 한 인간 대장 암 세포주 인 HT-29은 5 % CO2 로 가습한 환경 하의 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 보충한 McCoy's5A내에서 유지했다. ATCC에서 구입한 인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231은 CO2의 제외한 가습 환경 하의 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 보충한 L-15내에서 유지했다.
임상검체
외과적으로 절제된 유방의 조직 시료 (포르말린 고정 파라핀 절편, 동결 조직) 및 그 대응하는 임상 정보는 서면 동의를 얻은 후, 카나가와 암 센터에서 입수했다.
면역 조직 화학 염색 (IHC)
포르말린으로 고정된 파라핀 절편화 한 MELK / 293T, Mock / 293T, MCF-7, Hep G2, HT-29, PK-45P, BT-549, MDA-MB-231, A549 및 임상 검체를 크실렌(xylene)에 3 분 동안 3 회 침지하여 탈 파라핀화 한 후, 100 % 에탄올에 1 분간 2 회, 90 %, 70 % 및 50 % 에탄올로 각각 1 분간 침지하여 재수화(rehydration)시켰다. 항원 활성화 처리를 위해 항원 활성화 된 용액 pH9 (Nichirei Biosciences Inc.)에 침지시킨 절편을 125 ℃에서 30 초간 배양시켰다. 배양 후 20 분간 실온 방치하고, 흐르는 물에서 5 분간 수세했다. 내인성 퍼옥시다아제(endogenous peroxidase)생성을 차단 하기 위해 3.0 % 과산화수소수로 10 분간 침지한 뒤 , Wash Buffer (TBS-T (Takara Bio))에서 5 분간 3 회 세척 하였다. 또한 비특이적인 반응을 차단할 목적으로 절편에 Protein Block Solution (Dako)를 적당량 떨어트려 10 분간 방치 하였다. 습윤 상자 내에 1 차 항체 (OTSMAb01, MELK (N449) pAb, MELK (HPA017214) pAb)를 각각 적당량 적하하여 60 분간 방치 한 후 Wash Buffer에서 5 분간 3 회 세척 하였다. 습윤 상자에서 2 차 항체로서 Histofine Simple Stain MAX PO (Nichirei Biosciences Inc.) 을 적당량 적하하여 30 분간 방치 하였다. Wash Buffer에서 5 분간 3 회 세척 하였다. DAB 기질 용액 (Nichirei Biosciences Inc.)에 의해 발색 반응을 행했다. 슬라이드 절편을 헤마톡실린(haematoxylin) (Dako)에 20 초간 침지하여 흐르는 물에 세척했다. 50 %, 70 % 및 90 % 에탄올에서 각각 1 분, 100 % 에탄올에 1 분간 2 회 침지하여 탈수를 행했다. 마지막으로, 침투(penetration)를 위해절편을 자일렌(xylene)에서 3 분간 2 회 침지하여 , Mount-Quick (DAIDO SANGYO)에 의해 봉입(enclosing)했다.
RT-PCR
임상 동결 조직(유방암)은 TRIzol Reagent (Invitrogen)에 동결 조직의 절편을 침지시키고, 클로로포름 추출을 실시했다. 얻어진 추출액에 대략 동량의 70 % 에탄올을 가하여 RNeasy Mini kit (QIAGEN)을 이용하여 총 RNA를 추출 하였다. SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen)의 역전사 효소를 이용하여 총 RNA로부터 cDNA를 합성 하였다. cDNA를 주형으로 ExTaq (Takara Bio)를 이용해 PCR 반응을 행했다. 발현 해석 목적 유전자는 MELK, housekeeping 유전자는 β-actin이다. MELK은 MELK-1F : 5'- ATGATCACCTCACGGCTA -3 '(서열번호 12) MELK-1R : 5'- AGGTGTTCTGCATAAGG -3'(서열번호 13)의 프라이머 세트를 이용하여 β-actin은 , Beta-actin Fw : 5'- AGGATGCAGAAGGAGATCAC -3 '(서열번호 14), Beta-actin Re : 5'- AGAAAGGGTGTAACGCAACT -3'(서열번호 15)의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 하였다. 아가로오스겔(agarose gel)에서 PCR 증폭 산물의 전기 영동(electrophoresis)을 행하고, MELK 유전자의 발현량을 비교했다.
웨스턴 블랏(Western blotting)
MCF-7, Hep G2, HT-29, PK-45P, BT-549, MDA-MB-231 및 A549에서 RIPA Lys i s Buffer를 사용하여 단백질을 추출하였다. 목적 단백질을 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법 (SDS-PAGE)에서 분리되었다. 분리된 목적 단백질을 니트로셀룰로오스 (Nitrocellulose, NC)로 옮겼다. 차단 방법으로 Block-Ace (DS Pharma Bio)를 사용하여 막 표면의 비특이적인 결합을 차단 한 후, 이를 목적 단백질에 결합 할 수 있는 시험 항체와 배양시켰다. TBST Wash Buffer를 이용하여 막 표면의 여분의 시험 항체를 세척 한 다음, 시험 항체와 결합 할 수 있는 퍼옥시다아제 (HRP) 표지 된 이차 항체와 함께 배양하고 Wash Buffer에서 막 표면의 여분 이차 항체를 세척 했다. ECL 웨스턴 블랏 탐지 시스템 (GE 헬스 케어)에서 검출 가능한 화학 발광을 일으키게 하고, 필름을 사용하여 기록했다.
항 MELK 단클론 항체(monoclonal antibody)의 제작
(1) 항 MELK 항체 생산 하이브리도마(hybridoma)의 취득
인간 MELK 단백질 (서열번호 22)의 면역 항원 영역 분석을 실시한 결과, 긴 루프 구조(long loop structure)를 취하고 있는 264-601의 아미노산 영역 (서열번호 9)에서 total antigenic score가 유리하게 변화하고 있으며, 서열 특이성도 양호하기 때문에 항원성이 높은 것으로 예측 된다(주 의학 생물학 연구소). 따라서 MELK 특이적 항체를 생산하는 인간 MELK 유전자 (서열번호 21)을 코딩(coding)하는 인간 MELK 단백질 (서열번호 22)의 264-601 아미노산 영역 (서열번호 9)의 재조합 단백질을 면역원으로 했다. Freund Adjuvant에 항원 펩타이드 50μg을 가한 후, 에멀젼 화하여 Balb / c 마우스(mouse) (Japan SLC, Inc.)의 피하에 주사하는 것으로 초기 면역을 실시했다. 2 번째 이후의 면역뿐만 아니라 조제한 25μg 항원 펩타이드 량 상당을 피하에 주사하여 실시했다. 최종 면역 3 일 후에 마우스에서 비장 세포를 무균적으로 조제하여 통상적인 방법에 따라 폴리에틸렌글리콜 법에 의해 마우스 골수종 세포(myeloma cell) SP2 / 0 세포 융합을 실시했다.
(2) 항 MELK 항체 생산 하이브리도마(hybridoma)의 선발
항 MELK 항체 선발은 전체 길이(full-length)의 MELK 단백질 (서열번호 22)을 발현하는 293T 세포주를 이용한 면역 조직 화학 염색으로 하였다. 즉, 전체 길이(full-length)의 MELK 단백질을 강제 발현시킨 293T 세포주를 포르말린 고정하고 파라핀 절편화 한 후, 면역 염색의 실시에 의해 MELK 강제 발현 세포주 (MELK / 293T)에서 강한 반응이 인정된 하이브리도마(hybridoma)를 선발했다 .
시험한 하이브리도마(hybridoma) 중 MELK 특이적 항체를 높은 수준으로 생산하는 것을 확인한 하이브리도마 클론(hybridoma clone) OTSMAb01에 대한 면역 조직 화학 염색 결과를 도 1에 나타냈다. 도 1의 사진 및 그래프에 나타난 바와 같이, OTSMAb01을 이용하여 염색하는 경우, 시판되는 항MELK 폴리클로날(polyclonal antibody) 항체인 MELK (N449) pAb 및 MELK (HPA017214) pAb와 마찬가지로 MELK 강제 발현 세포주 (MELK / 293T)에서 제작 된 파라핀 절편에서는 염색이 확인된, 즉 MELK 양성 세포의 비율이 높은 것으로 나타났다. 한편, 대조군으로 Empty Vector를 도입시킨 세포주 (Mock / 293T)에서 제작 된 파라핀 절편에서는 거의 염색이 되지 않고, MELK 양성 세포의 비율이 낮은 것으로 나타났다. 이러한 결과에서 하이브리도마 클론(hybridoma clone) OTSMAb01은 면역 조직 화학 염색에서 MELK를 특이적으로 검출하는 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)로 유용하다는 것을 보여 주었다.
이 하이브리도마 클론(hybridoma clone) OTSMAb01을 추가 실험용 항체를 생산하기 위하여 하이브리도마(hybridoma)로 선택했다. 하이브리도마 클론(hybridoma clone) OTSMAb01를 대량 배양하여 2 ~ 3 주 후에 배양액을 채취했다. 단백질 A 컬럼 (GE Healthcare, NJ)을 이용하여 배양액으로부터 항체를 정제 하였다. 본 명세서에서 본 발명의 항체는 클론(clone) OTSMAb01 로 불린다.
항MELK 단클론 항체(monoclonal antibody)의 특이성 평가
다음은 MELK의 발현량이 다른 다양한 세포주를 이용하여 OTSMAb01의 특이성을 평가했다. 즉 OTSMAb01을 이용한 면역 조직 화학 염색 및 웨스턴 블랏(western blot)의 결과를 비교하고 MELK 단백질의 발현량에 따라 염색이 인정 될지 검토했다.
먼저 OTSMAb01를 이용한 웨스턴 블랏을 통해 다양한 인간 암 조직 유래 세포주의 내인성 MELK 단백질의 발현량을 확인했다. 도 2에 나타난 바와 같이, 인간 췌장암 세포주 PK-45P, 인간 유방암 세포주 BT-549 및 MDA-MB-231, 인간 폐암 세포주 A549는 MELK 고 발현 세포주였고 인간 유방암 세포주 MCF-7 인간 간암 세포주 Hep G2와 인간 대장 암 세포주 HT-29은 MELK 저 발현 세포주였다.
이어 이들 세포주에서 제작된 파라핀 절편에 대해 OTSMAb01 및 시판되는 항 MELK 폴리클로날 항체(polyclonal antibody)를 사용하여 면역 조직 화학 염색을 실시하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, OTSMAb01을 이용하여 염색하는 경우 MELK을 고 발현하고 있는 것이 확인 된 세포주 PK-45P, BT-549, MDA-MB-231 및 A549에서 제작 파라핀 절편에서 염색이 관찰되었다. 이러한 파라핀 절편은 높은 비율의 세포에서 양성 신호가 검출되었다. 한편 MELK의 발현량이 적은 세포주 인 MCF-7, Hep G2와 HT-29에서 제작 된 파라핀 절편은 거의 염색되지 않고 양성 신호가 거의 검출되지 않았다.
한편, 시판되는 항 MELK 항체인 MELK (N449) pAb (Bioworld Technology)와 MELK (HPA017214) pAb (Sigma-Aldrich)를 사용하여 염색하면 내인성 MELK 단백질의 발현 수준에 관계없이 시험한 모든 세포주에서 높은 비율의 세포에서 신호가 감지되었다. 따라서 이러한 시판되는 항체에 의한 검색 결과는 위양성 신호가 포함되어 있을 가능성이 의심되었다.
이상의 결과로부터 본 발명의 항 MELK 항체 (OTSMAb01)는 면역 조직 화학 염색법에서 시료 중의 MELK 단백질의 발현 수준과 상관관계가 있는 검출 결과를 얻기 위한 유용한 도구로서, 시판되는 항 MELK 항체에 비해 높은 특이성으로 MELK에 결합하는 유리한 특성을 가지고 있음이 밝혀졌다.
임상 검체에서 MELK 단백질의 검출
본 발명의 항 MELK 항체 (OTSMAb01)의 면역 조직 화학 염색의 특이성을 유방암 임상 검체를 이용하여 평가 하였다. 유방암 임상 검체 1 ~ 3의 종양 영역 및 비 종양 영역에서 MELK의 단백질 및 RNA의 발현을 각각 면역 조직 화학 염색 및 반 정량적 RT-PCR로 검출 한 결과를 도 4에 나타냈다. 도 4에 나타난 바와 같이, MELK의 RNA의 발현이 확인 된 종양 영역에서는 OTSMAb01 의해 염색된 세포, 즉 MELK 양성 세포가 발견되었지만, MELK의 RNA의 발현이 확인되지 않은 비 종양 영역은 거의 염색되지 않고 MELK 양성 세포가 발견되지 않았다. 이 결과는 OTSMAb01은 임상 검체에서도 특이적으로 MELK 단백질을 검출 할 수 있는 것을 보여주고 있다.
항MELK 단클론 항체(monoclonal antibody)의 가변영역의 아미노산 서열의 분석
본 발명의 항 MELK 항체 (OTSMAb01)의 가변영역의 아미노산 서열을 분석했다.
RNeasy mini kit (QIAGEN)을 이용하여 총 RNA를 하이브리도마(hybridoma) OTSMAb01에서 추출했다. Super Script II Reverse Transcriptase (Invitrogen)을 이용하여 총 RNA로부터 cDNA를 합성 하였다. cDNA 합성용 프라이머는 다음과 같다.
중쇄 3 '프라이머 mIGCUniRv :
5'-CTGGGAAGGTGTGCACAC-3 '(서열번호 16)
경쇄 3 '프라이머 mIGKRv2 :
5'-GTTGTTCAAGAAGCACACGAC-3 '(서열번호 17)
5 'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends (Invitrogen)를 이용하여 cDNA 말단에 dC의 폴리머를 부가하고 Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen)을 이용하여 단클론 항체(monoclonal antibody)의 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시켰다. 증폭용 프라이머는 다음과 같다. primer 서열 중의 염기 "I"는 이노신을 나타낸다.
중쇄 5 '및 경쇄 5'프라이머의 5 'RACE Abridged Anchor Primer :
5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3 '(서열번호 18)
중쇄 3 '프라이머 mIGCUniRv2 :
5'-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3 '(서열번호 19) 및
경쇄 3 '프라이머 mIGKNesRv2 :
5'-CAGATGTTAACTGCTCACTGGATGG-3 '(서열번호 20).
PCR 산물을 pGEM-T Easy Vector (Promega)에 클로닝(clonning)했다. 삽입 절편 영역의 서열을 결정하고 OTSMAb01의 가변 영역(신호(signal) 서열을 제외)의 핵산 서열을 결정했다.
마우스 단클론 항체(monoclonal antibody)의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 다음과 같이 결정되었다.
OTSMAb01, 중쇄가변영역 아미노산 서열 (신호 서열을 제외) :
EVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGNTIYDPKFQGKASVTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTSHHYSAMDYWGQGTSVTVSS (서열번호 7) (서열번호 10에 표시된 핵산 서열에 의해 코딩된다)
OTSMAb01, 중쇄가변영역 핵산 서열 :
5'-GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTTAGTCAAGTTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTAATACTATATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCAGTGTAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTAGTCACCATTACTCTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA-3 '(서열번호 10)
OTSMAb01, 경쇄가변영역 아미노산 서열 (신호 서열을 제외) :
DVVMTQTPLSLPVSLRDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLIISRVEAEDLGVYFCSQSTYVPLTFGAGTKLELKRAD (서열번호 8) (서열번호 11에 표시된 핵산 서열에 의해 코딩된다)
OTSMAb01, 경쇄가변영역 핵산 서열 :
5'-GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTAGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAACTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCATAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACATATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGAT-3 '(서열번호 11)
Kabat의 정의에 의해 결정되는 본 발명의 항체 (OTSMAb01) CDR의 서열은 다음과 같다.
중쇄 CDR1 (CDR-H1) : DYYMH (서열번호 1);
중쇄 CDR2 (CDR-H2) : WIDPENGNTIYDPKFQG (서열번호 2);
중쇄 CDR3 (CDR-H3) : HHYSAMDY (서열번호 3);
경쇄 CDR1 (CDR-L1) : RSSQSLVHSNGNTYLH (서열번호 4);
경쇄 CDR2 (CDR-L2) : KVSNRFS (서열번호 5); 및
경쇄 CDR3 (CDR-L3) : SQSTYVPLT (서열번호 6)
본 발명은 임상 검체 등의 개체에서 분리된 시료의 MELK 단백질을 높은 특이성으로 검출 할 수 있는 항 MELK 항체를 제작하는 데 성공했다. 본 발명의 항 MELK 항체를 이용하여 민감하고 낮은 백그라운드에서 시료 중의 MELK 단백질을 검출 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 MELK를 발현하는 암 등의 MELK 관련 질환의 진단에 유용하다. 또한, 본 발명의 항체는 시료 중의 MELK의 발현량에 따른 MELK의 검출이 가능한지에 대해 MELK 저해제 치료 효과가 높은 개체 검사 (치료 전 진단)과 개체의 MELK 저해제에 의한 치료 후 약효 판정 (치료 후 진단)에서도 유용하다.
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> ANTI-MELK MONOCLONAL ANTIBODY AND USE THEREOF <130> ONC-A1606P <150> JP 2016-169085 <151> 2016-08-31 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 1 Asp Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 2 Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 3 His His Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 <400> 4 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 <400> 5 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR <400> 6 Ser Gln Ser Thr Tyr Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-chain variable region <400> 7 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Ser Val Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ser His His Tyr Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-chain variable region <400> 8 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Arg 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg Ala Asp 115 <210> 9 <211> 338 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MELK fragment for immunogen <400> 9 Met Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Val Glu Trp Gln Ser Lys Asn Pro Phe 1 5 10 15 Ile His Leu Asp Asp Asp Cys Val Thr Glu Leu Ser Val His His Arg 20 25 30 Asn Asn Arg Gln Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Leu Trp Gln Tyr Asp 35 40 45 His Leu Thr Ala Thr Tyr Leu Leu Leu Leu Ala Lys Lys Ala Arg Gly 50 55 60 Lys Pro Val Arg Leu Arg Leu Ser Ser Phe Ser Cys Gly Gln Ala Ser 65 70 75 80 Ala Thr Pro Phe Thr Asp Ile Lys Ser Asn Asn Trp Ser Leu Glu Asp 85 90 95 Val Thr Ala Ser Asp Lys Asn Tyr Val Ala Gly Leu Ile Asp Tyr Asp 100 105 110 Trp Cys Glu Asp Asp Leu Ser Thr Gly Ala Ala Thr Pro Arg Thr Ser 115 120 125 Gln Phe Thr Lys Tyr Trp Thr Glu Ser Asn Gly Val Glu Ser Lys Ser 130 135 140 Leu Thr Pro Ala Leu Cys Arg Thr Pro Ala Asn Lys Leu Lys Asn Lys 145 150 155 160 Glu Asn Val Tyr Thr Pro Lys Ser Ala Val Lys Asn Glu Glu Tyr Phe 165 170 175 Met Phe Pro Glu Pro Lys Thr Pro Val Asn Lys Asn Gln His Lys Arg 180 185 190 Glu Ile Leu Thr Thr Pro Asn Arg Tyr Thr Thr Pro Ser Lys Ala Arg 195 200 205 Asn Gln Cys Leu Lys Glu Thr Pro Ile Lys Ile Pro Val Asn Ser Thr 210 215 220 Gly Thr Asp Lys Leu Met Thr Gly Val Ile Ser Pro Glu Arg Arg Cys 225 230 235 240 Arg Ser Val Glu Leu Asp Leu Asn Gln Ala His Met Glu Glu Thr Pro 245 250 255 Lys Arg Lys Gly Ala Lys Val Phe Gly Ser Leu Glu Arg Gly Leu Asp 260 265 270 Lys Val Ile Thr Val Leu Thr Arg Ser Lys Arg Lys Gly Ser Ala Arg 275 280 285 Asp Gly Pro Arg Arg Leu Lys Leu His Tyr Asn Val Thr Thr Thr Arg 290 295 300 Leu Val Asn Pro Asp Gln Leu Leu Asn Glu Ile Met Ser Ile Leu Pro 305 310 315 320 Lys Lys His Val Asp Phe Val Gln Lys Gly Tyr Thr Leu Lys Cys Gln 325 330 335 Thr Gln <210> 10 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-chain variable region nucleic acid sequence <400> 10 gaggttcagc tgcagcagtc tggggctgag cttgtgaggc caggggcctt agtcaagttg 60 tcctgcaaag cttctggctt caacattaaa gactactata tgcactgggt gaagcagagg 120 cctgaacagg gcctggagtg gattggatgg attgatcctg agaatggtaa tactatatat 180 gacccgaagt tccagggcaa ggccagtgta acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240 ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtac tagtcaccat 300 tactctgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351 <210> 11 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-chain variable region nucleic acid sequence <400> 11 gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttagaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaaa ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcataatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac atatgttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacggg ctgat 345 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized forward primer sequence for MELK <400> 12 atgatcacct cacggcta 18 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized reverse primer sequence for MELK <400> 13 aggtgttctg cataagg 17 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized forward primer sequence for beta-actin <400> 14 aggatgcaga aggagatcac 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized reverse primer sequence for beta-actin <400> 15 agaaagggtg taacgcaact 20 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized 3' primer sequence for VH <400> 16 ctgggaaggt gtgcacac 18 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized 3' primer sequence for VL <400> 17 gttgttcaag aagcacacga c 21 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized 5' primer sequence for VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is inosine <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is inosine <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is inosine <400> 18 ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng 36 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized 3' primer sequence for VH <400> 19 tggacaggga tccagagttc c 21 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized 3' primer sequence for VL <400> 20 cagatgttaa ctgctcactg gatgg 25 <210> 21 <211> 2486 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (185)..(2140) <300> <308> NCBIacc#NM_014791.3 <309> 2015-09-25 <313> 1-2486 <400> 21 gagatttgat tcccttggcg ggcggaagcg gccacaaccc ggcgatcgaa aagattctta 60 ggaacgccgt accagccgcg tctctcagga cagcaggccc ctgtccttct gtcgggcgcc 120 gctcagccgt gccctccgcc cctcaggttc tttttctaat tccaaataaa cttgcaagag 180 gact atg aaa gat tat gat gaa ctt ctc aaa tat tat gaa tta cat 226 Met Lys Asp Tyr Asp Glu Leu Leu Lys Tyr Tyr Glu Leu His 1 5 10 gaa act att ggg aca ggt ggc ttt gca aag gtc aaa ctt gcc tgc cat 274 Glu Thr Ile Gly Thr Gly Gly Phe Ala Lys Val Lys Leu Ala Cys His 15 20 25 30 atc ctt act gga gag atg gta gct ata aaa atc atg gat aaa aac aca 322 Ile Leu Thr Gly Glu Met Val Ala Ile Lys Ile Met Asp Lys Asn Thr 35 40 45 cta ggg agt gat ttg ccc cgg atc aaa acg gag att gag gcc ttg aag 370 Leu Gly Ser Asp Leu Pro Arg Ile Lys Thr Glu Ile Glu Ala Leu Lys 50 55 60 aac ctg aga cat cag cat ata tgt caa ctc tac cat gtg cta gag aca 418 Asn Leu Arg His Gln His Ile Cys Gln Leu Tyr His Val Leu Glu Thr 65 70 75 gcc aac aaa ata ttc atg gtt ctt gag tac tgc cct gga gga gag ctg 466 Ala Asn Lys Ile Phe Met Val Leu Glu Tyr Cys Pro Gly Gly Glu Leu 80 85 90 ttt gac tat ata att tcc cag gat cgc ctg tca gaa gag gag acc cgg 514 Phe Asp Tyr Ile Ile Ser Gln Asp Arg Leu Ser Glu Glu Glu Thr Arg 95 100 105 110 gtt gtc ttc cgt cag ata gta tct gct gtt gct tat gtg cac agc cag 562 Val Val Phe Arg Gln Ile Val Ser Ala Val Ala Tyr Val His Ser Gln 115 120 125 ggc tat gct cac agg gac ctc aag cca gaa aat ttg ctg ttt gat gaa 610 Gly Tyr Ala His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Phe Asp Glu 130 135 140 tat cat aaa tta aag ctg att gac ttt ggt ctc tgt gca aaa ccc aag 658 Tyr His Lys Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Leu Cys Ala Lys Pro Lys 145 150 155 ggt aac aag gat tac cat cta cag aca tgc tgt ggg agt ctg gct tat 706 Gly Asn Lys Asp Tyr His Leu Gln Thr Cys Cys Gly Ser Leu Ala Tyr 160 165 170 gca gca cct gag tta ata caa ggc aaa tca tat ctt gga tca gag gca 754 Ala Ala Pro Glu Leu Ile Gln Gly Lys Ser Tyr Leu Gly Ser Glu Ala 175 180 185 190 gat gtt tgg agc atg ggc ata ctg tta tat gtt ctt atg tgt gga ttt 802 Asp Val Trp Ser Met Gly Ile Leu Leu Tyr Val Leu Met Cys Gly Phe 195 200 205 cta cca ttt gat gat gat aat gta atg gct tta tac aag aag att atg 850 Leu Pro Phe Asp Asp Asp Asn Val Met Ala Leu Tyr Lys Lys Ile Met 210 215 220 aga gga aaa tat gat gtt ccc 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tcc tgt gga caa gcc agt gct acc cca ttc aca gac atc 1234 Ser Ser Phe Ser Cys Gly Gln Ala Ser Ala Thr Pro Phe Thr Asp Ile 335 340 345 350 aag tca aat aat tgg agt ctg gaa gat gtg acc gca agt gat aaa aat 1282 Lys Ser Asn Asn Trp Ser Leu Glu Asp Val Thr Ala Ser Asp Lys Asn 355 360 365 tat gtg gcg gga tta ata gac tat gat tgg tgt gaa gat gat tta tca 1330 Tyr Val Ala Gly Leu Ile Asp Tyr Asp Trp Cys Glu Asp Asp Leu Ser 370 375 380 aca ggt gct gct act ccc cga aca tca cag ttt acc aag tac tgg aca 1378 Thr Gly Ala Ala Thr Pro Arg Thr Ser Gln Phe Thr Lys Tyr Trp Thr 385 390 395 gaa tca aat ggg gtg gaa tct aaa tca tta act cca gcc tta tgc aga 1426 Glu Ser Asn Gly Val Glu Ser Lys Ser Leu Thr Pro Ala Leu Cys Arg 400 405 410 aca cct gca aat aaa tta aag aac aaa gaa aat gta tat act cct aag 1474 Thr Pro Ala Asn Lys Leu Lys Asn Lys Glu Asn Val Tyr Thr Pro Lys 415 420 425 430 tct gct gta aag aat gaa gag tac ttt atg ttt cct gag cca aag act 1522 Ser Ala Val Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Met Phe Pro Glu Pro Lys Thr 435 440 445 cca gtt aat aag aac cag cat aag aga gaa ata ctc act acg cca aat 1570 Pro Val Asn Lys Asn Gln His Lys Arg Glu Ile Leu Thr Thr Pro Asn 450 455 460 cgt tac act aca ccc tca aaa gct aga aac cag tgc ctg aaa gaa act 1618 Arg Tyr Thr Thr Pro Ser Lys Ala Arg Asn Gln Cys Leu Lys Glu Thr 465 470 475 cca att aaa ata cca gta aat tca aca gga aca gac aag tta atg aca 1666 Pro Ile Lys Ile Pro Val Asn Ser Thr Gly Thr Asp Lys Leu Met Thr 480 485 490 ggt gtc att agc cct gag agg cgg tgc cgc tca gtg gaa ttg gat ctc 1714 Gly Val Ile Ser Pro Glu Arg Arg Cys Arg Ser Val Glu Leu Asp Leu 495 500 505 510 aac caa gca cat atg gag gag act cca aaa aga aag gga gcc aaa gtg 1762 Asn Gln Ala His Met Glu Glu Thr Pro Lys Arg Lys Gly Ala Lys Val 515 520 525 ttt ggg agc ctt gaa agg ggg ttg gat aag gtt atc act gtg ctc acc 1810 Phe Gly Ser Leu Glu Arg Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Leu Thr 530 535 540 agg agc aaa agg aag ggt tct gcc aga gac ggg ccc aga aga cta aag 1858 Arg Ser Lys Arg Lys Gly Ser Ala Arg Asp Gly Pro Arg Arg Leu Lys 545 550 555 ctt cac tat aac gtg act aca act aga tta gtg aat cca gat caa ctg 1906 Leu His Tyr Asn Val Thr Thr Thr Arg Leu Val Asn Pro Asp Gln Leu 560 565 570 ttg aat gaa ata atg tct att ctt cca aag aag cat gtt gac ttt gta 1954 Leu Asn Glu Ile Met Ser Ile Leu Pro Lys Lys His Val Asp Phe Val 575 580 585 590 caa aag ggt tat aca ctg aag tgt caa aca cag tca gat ttt ggg aaa 2002 Gln Lys Gly Tyr Thr Leu Lys Cys Gln Thr Gln Ser Asp Phe Gly Lys 595 600 605 gtg aca atg caa ttt gaa tta gaa gtg tgc cag ctt caa aaa ccc gat 2050 Val Thr Met Gln Phe Glu Leu Glu Val Cys Gln Leu Gln Lys Pro Asp 610 615 620 gtg gtg ggt atc agg agg cag cgg ctt aag ggc gat gcc tgg gtt tac 2098 Val Val Gly Ile Arg Arg Gln Arg Leu Lys Gly Asp Ala Trp Val Tyr 625 630 635 aaa aga tta gtg gaa gac atc cta tct agc tgc aag gta taa 2140 Lys Arg Leu Val Glu Asp Ile Leu Ser Ser Cys Lys Val *** 640 645 650 ttgatggatt cttccatcct gccggatgag tgtgggtgtg atacagccta cataaagact 2200 gttatgatcg ctttgatttt aaagttcatt ggaactacca acttgtttct aaagagctat 2260 cttaagacca atatctcttt gtttttaaac aaaagatatt attttgtgta tgaatctaaa 2320 tcaagcccat ctgtcattat gttactgtct tttttaatca tgtggttttg tatattaata 2380 attgttgact ttcttagatt cacttccata tgtgaatgta agctcttaac tatgtctctt 2440 tgtaatgtgt aatttctttc tgaaataaaa ccatttgtga atatag 2486 <210> 22 <211> 651 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Lys Asp Tyr Asp Glu Leu Leu Lys Tyr Tyr Glu Leu His Glu Thr 1 5 10 15 Ile Gly Thr Gly Gly Phe Ala Lys Val Lys Leu Ala Cys His Ile Leu 20 25 30 Thr Gly Glu Met Val Ala Ile Lys Ile Met Asp Lys Asn Thr Leu Gly 35 40 45 Ser Asp Leu Pro Arg Ile Lys Thr Glu Ile Glu Ala Leu Lys Asn Leu 50 55 60 Arg His Gln His Ile Cys Gln Leu Tyr His Val Leu Glu Thr Ala Asn 65 70 75 80 Lys Ile Phe Met Val Leu Glu Tyr Cys Pro Gly Gly Glu Leu Phe Asp 85 90 95 Tyr Ile Ile Ser Gln Asp Arg Leu Ser Glu Glu Glu Thr Arg Val Val 100 105 110 Phe Arg Gln Ile Val Ser Ala Val Ala Tyr Val His Ser Gln Gly Tyr 115 120 125 Ala His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Phe Asp Glu Tyr His 130 135 140 Lys Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Leu Cys Ala Lys Pro Lys Gly Asn 145 150 155 160 Lys Asp Tyr His Leu Gln Thr Cys Cys Gly Ser Leu Ala Tyr Ala Ala 165 170 175 Pro Glu Leu Ile Gln Gly Lys Ser Tyr Leu Gly Ser Glu Ala Asp Val 180 185 190 Trp Ser Met Gly Ile Leu Leu Tyr Val Leu Met Cys Gly Phe Leu Pro 195 200 205 Phe Asp Asp Asp Asn Val Met Ala Leu Tyr Lys Lys Ile Met Arg Gly 210 215 220 Lys Tyr Asp Val Pro Lys Trp Leu Ser Pro Ser Ser Ile Leu Leu Leu 225 230 235 240 Gln Gln Met Leu Gln Val Asp Pro Lys Lys Arg Ile Ser Met Lys Asn 245 250 255 Leu Leu Asn His Pro Trp Ile Met Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Val Glu 260 265 270 Trp Gln Ser Lys Asn Pro Phe Ile His Leu Asp Asp Asp Cys Val Thr 275 280 285 Glu Leu Ser Val His His Arg Asn Asn Arg Gln Thr Met Glu Asp Leu 290 295 300 Ile Ser Leu Trp Gln Tyr Asp His Leu Thr Ala Thr Tyr Leu Leu Leu 305 310 315 320 Leu Ala Lys Lys Ala Arg Gly Lys Pro Val Arg Leu Arg Leu Ser Ser 325 330 335 Phe Ser Cys Gly Gln Ala Ser Ala Thr Pro Phe Thr Asp Ile Lys Ser 340 345 350 Asn Asn Trp Ser Leu Glu Asp Val Thr Ala Ser Asp Lys Asn Tyr Val 355 360 365 Ala Gly Leu Ile Asp Tyr Asp Trp Cys Glu Asp Asp Leu Ser Thr Gly 370 375 380 Ala Ala Thr Pro Arg Thr Ser Gln Phe Thr Lys Tyr Trp Thr Glu Ser 385 390 395 400 Asn Gly Val Glu Ser Lys Ser Leu Thr Pro Ala Leu Cys Arg Thr Pro 405 410 415 Ala Asn Lys Leu Lys Asn Lys Glu Asn Val Tyr Thr Pro Lys Ser Ala 420 425 430 Val Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Met Phe Pro Glu Pro Lys Thr Pro Val 435 440 445 Asn Lys Asn Gln His Lys Arg Glu Ile Leu Thr Thr Pro Asn Arg Tyr 450 455 460 Thr Thr Pro Ser Lys Ala Arg Asn Gln Cys Leu Lys Glu Thr Pro Ile 465 470 475 480 Lys Ile Pro Val Asn Ser Thr Gly Thr Asp Lys Leu Met Thr Gly Val 485 490 495 Ile Ser Pro Glu Arg Arg Cys Arg Ser Val Glu Leu Asp Leu Asn Gln 500 505 510 Ala His Met Glu Glu Thr Pro Lys Arg Lys Gly Ala Lys Val Phe Gly 515 520 525 Ser Leu Glu Arg Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Leu Thr Arg Ser 530 535 540 Lys Arg Lys Gly Ser Ala Arg Asp Gly Pro Arg Arg Leu Lys Leu His 545 550 555 560 Tyr Asn Val Thr Thr Thr Arg Leu Val Asn Pro Asp Gln Leu Leu Asn 565 570 575 Glu Ile Met Ser Ile Leu Pro Lys Lys His Val Asp Phe Val Gln Lys 580 585 590 Gly Tyr Thr Leu Lys Cys Gln Thr Gln Ser Asp Phe Gly Lys Val Thr 595 600 605 Met Gln Phe Glu Leu Glu Val Cys Gln Leu Gln Lys Pro Asp Val Val 610 615 620 Gly Ile Arg Arg Gln Arg Leu Lys Gly Asp Ala Trp Val Tyr Lys Arg 625 630 635 640 Leu Val Glu Asp Ile Leu Ser Ser Cys Lys Val 645 650

Claims (15)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
    서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및
    서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
    서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역 중 하나 또는 둘을 포함하고,
    MELK 단백질 또는 그 일부 펩타이드에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment).
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역 중 하나 또는 둘을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment).
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment).
  4. MELK 단백질에 대한 특이적 결합에 대해서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체와 경쟁하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment).
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 친화도(affinity) 표지, 효소 표지, 방사성 동위 원소 표지 또는 형광 표지로 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment).
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)을 코딩(coding)하는 폴리뉴클레오티드(Polynucleotide).
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)을 포함하는, MELK 관련 질환의 진단, MELK 저해제에 의한 치료 후 약효를 판정, MELK 저해제에 의해 높은 치료 효과를 가지는 개체를 선별 하기 위한 시약.
  8. 하기의 단계를 포함하는 개체에서 MELK 관련 질환 또는 그 질환의 발병 소인(predisposition)을 진단하는 방법 :
    (a) 상기 개체로부터 분리된 시료를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 시료와 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)의 결합을 검출하여 상기 시료 내의 MELK 단백질을 검출하는 단계; 및
    (c) 상기 시료 내 MELK 단백질 수준을 대조군과 비교하는 단계로서, 대조군과 비교하여 MELK 단백질 수준이 높을 때, 상기 개체가 상기 질환을 앓고 있거나 발병 위험이 있을 것으로 나타내는 단계.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 MELK 관련 질환이 MELK가 발현되는 암 또는 자궁 내막증인 시약 또는 진단하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 암은 유방암, 방광암, 자궁 경부암, 담관 세포암, 만성 골수성 백혈병 (Chronic Myelogenous Leukemia, CML), 대장암, 식도암, 위암, 간암, 비소 세포 폐암 (Non-Small-Cell Lung Carcinoma, NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암 및 소세포 폐암 (Small-Cell Lung Carcinoma, SCLC)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 시약 또는 진단하는 방법.
  11. 하기의 단계를 포함하는 시료 내의 MELK 단백질을 검출하는 방법 :
    (a) 개체로부터 분리된 시료를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 시료와 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)의 결합을 검출하여 시료 내의 MELK 단백질을 검출하는 단계.
  12. 하기의 단계를 포함하는 개체의 MELK 저해제에 의한 치료 후 약물 효과를 판정하는 방법 :
    (a) 개체로부터 분리된 시료를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 시료와 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)의 결합을 검출하여 시료 내의 MELK 단백질을 검출하는 단계; 및
    (c) 상기 시료 내 MELK 단백질 수준을 약물 투여 전의 발현 수준과 비교하는 단계로서, 약물 투여 전과 비교하여 상기 MELK 단백질 수준이 낮을 때 상기 개체에서 약물 효능이 있는 것으로 나타나는 단계.
    .
  13. 하기의 단계를 포함하는 MELK 저해제에 의한 치료 효과가 높은 개체를 선별 하는 방법 :
    (a) 개체로부터 분리된 시료를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 시료와 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)의 결합을 검출하여 상기 시료 내의 MELK 단백질을 검출하는 단계; 및
    (c) 상기 시료 내 MELK 단백질 수준을 대조군과 비교하는 단계로서, 대조군과 비교하여 상기 MELK 단백질 수준이 유사하거나 그보다 높을 때, 상기 개체에서 MELK 억제제에 의한 치료 효과가 높은 것으로 나타나는 단계.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료는 상기 개체로부터 분리된 세포 또는 조직인 방법.
  15. 하기의 단계를 포함하는 MELK 단백질 또는 이의 일부 펩타이드에 결합할 수 있는 항체를 제조하는 방법 :
    (a) 제6항의 폴리뉴클레오티드(Polynucleotide)가 삽입된 벡터(vector)를 포함하는 세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 세포 배양물 또는 배양배지로부터 상기 항체를 회수하는 단계.





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