CN112725387A - 一种生物转化制备长链二元酸的方法 - Google Patents

一种生物转化制备长链二元酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生物转化制备长链二元酸的方法，在发酵罐内一次性添加烷烃，通过通气量和罐内压力的组合方式，调控发酵过程，发酵尾气进入烷烃分离器，产生的液化烷烃返回发酵罐；发酵结束后，经破乳、膜过滤、酸析、过滤、烘干后，获得长链二元酸产品。本发明方法在长链二元酸发酵过程中，在高通气量条件下，并结合发酵特征对罐压进行阶段性调整，提高了烷烃转化率和二元酸收率，易于大规模生产应用。

Description

一种生物转化制备长链二元酸的方法
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种生物转化制备长链二元酸的方法。
背景技术
长链二元酸（Long chain dicarboxylic acids）是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二元酸（简称DCn），包括饱和及不饱和二羧酸，是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品，是化学工业中合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温电介质、高级油漆和涂料、高级润滑油、耐寒性增塑剂、树脂、医药和农药等的重要原料。
发酵法生产长链二元酸是利用微生物特有的氧化能力和微生物胞内酶的作用，在常温常压下分别通过α、ω-氧化，将长链正烷烃两端的两个甲基，氧化成为羧基，生成相应链长的各种长链二元酸。由于长链二元酸发酵采用好氧发酵模式，因此发酵体系是由气相（空气）—液相（发酵液）—油相（烷烃）—固相（菌体）组成的四相体系，其中液相与油相间的乳化现象增加了相间混合的复杂性。
正构烷烃存在挥发性，在通气式反应器中，烷烃会随尾气从发酵体系中排出，从而降低了底物烷烃的转化率。因此目前为了减少烷烃损失，提高烷烃的转化率，通常采用在发酵过程中添加乳化剂，以及批次添加烷烃的方案。中国专利CN102115768A公开了一种微生物同步发酵正十六烷生产十六碳二元酸的方法，其通过添加表面活性剂吐温60 0.1～2g/L以增强油相的乳化效果。一般情况下乳化剂并非微生物代谢所需成分，因此这种外源添加乳化剂的方式会对正常的微生物发酵产生不利影响。
由于发酵初期菌体生物量较低，并且细菌生长量与烷烃吸收存在一定的相关性，因此通常采用批次补加烷烃的形式，以减少烷烃的损失。中国专利CN102115767A公开了一种微生物同步发酵正十一烷生产十一碳二羧酸方法，其通过在60、90、120小时补加正十一烷，使发酵液中正烷烃浓度始终≥5%（V/V）。但是由于长链二元酸发酵为好氧发酵模式，部分烷烃会随通气从发酵体系中排出，因此在实际生产过程中，由于汽提作用还是会产生烷烃损失，降低烷烃转化率。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种生物转化制备长链二元酸的方法。本发明方法在长链二元酸发酵过程中，在高通气量条件下，并结合发酵特征对罐压进行阶段性调整，提高了烷烃转化率和二元酸收率，易于大规模生产应用。
本发明生物转化制备长链二元酸的方法，包括如下步骤：
（1）在发酵罐内加入发酵菌种子液和发酵培养基，一次性添加烷烃，启动发酵过程；
（2）通过通气量和罐内压力的组合方式，调控发酵过程，发酵尾气进入烷烃分离器，产生的液化烷烃返回发酵罐；
（3）发酵结束后，经破乳、膜过滤、酸析、过滤、烘干后，获得长链二元酸产品。
本发明方法中，步骤（1）所采用发酵菌来自能利用烷烃生长的微生物，以及具有完整α、ω-氧化途径的微生物，其中优选假丝酵母属、隐球酵母属、内孢霉属、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母属、红酵母属、球拟酵母属、丝孢酵母属等中的至少一种。
本发明方法中，步骤（1）所述的发酵菌种子液是将斜面保藏的菌种经摇瓶扩大培养及种子罐扩大培养，获得发酵菌种子液。所述的摇瓶扩大培养，从摇瓶种子开始，进入下一级培养接种量一般按照7～15倍进行扩大培养，优选10～12倍扩大。所述的种子罐扩大培养需要采用通入空气的培养方式，通气量为0.5～1.2vvm，发酵温度为25～37℃，优选28～32℃；搅拌转速为120～500rpm，优选150～300rpm；培养时间为18～24小时。
本发明方法中，步骤（1）所述的发酵培养基配方为：蔗糖20～28g/L、玉米浆0.8～1.5g/L、酵母膏2.0～4.0g/L、氯化钠0.8～1.2g/L、磷酸二氢钾3.0～3.5g/L、硫酸镁1.2～1.8g/L、尿素1.2～4.8g/L，硫酸铵1.5～2g/L、醋酸钠1.5～1.8g/L。
本发明方法中，步骤（1）所述的发酵菌种子液的添加量为发酵液体积的5%～20%，优选10%～15%。
本发明方法中，步骤（1）所述的烷烃为C11-C16的正构烷烃，添加量为发酵液体积的20%～25%。
本发明方法中，步骤（2）所述发酵过程中发酵温度为25～37℃，优选28～32℃；搅拌转速为120～500rpm，优选150～300rpm，发酵时间为138～144小时。
本发明方法中，步骤（2）所述发酵过程中控制通气量为0.5～1.2vvm，罐内压力为0.02～0.12MPa。优选的，通气量和罐内压力的组合方式具体为：在发酵0～24h内，通气量为0.5～0.7vvm，罐内压力控制为0.10～0.12MPa；24～96h内，通气量为1.1～1.2vvm，罐内压力控制为0.08～0.09MPa；96h～发酵结束，通气量为0.8～1.0vvm，罐内压力控制为0.1～0.11MPa。
进一步的，步骤（2）同时采用逐级调整pH的方式调控发酵过程，具体为：在发酵0～24h内，不进行pH控制；24h后将pH调整至6.8～7.0；随后每间隔24h将pH控制值提高0.1～0.3，直至发酵结束。
本发明方法中，步骤（2）所述发酵尾气通过尾气管道水平延伸进入烷烃分离器内部，进入烷烃分离器内部的管道底部设流通小孔，尾气经流通小孔进行液化，液化烷烃流入烷烃分离器底部，经底部排放孔流出后通过泵返回发酵罐中。流通小孔与管道连接处的横截面积总和为尾气管道横截面积的80%，流通小孔出口总横截面积为管道横截面积的60%，烷烃分离器可以进行2～4级串联连接，以提升尾气中烷烃的回收效果。
本发明方法中，步骤（2）为避免尾气污染，可以在烷烃分离器之后设碱洗设备，以净化气体。其中碱洗采用质量浓度为5%～10%强碱溶液，如氢氧化钠溶液等。
本发明方法中，步骤（3）所述破乳是将发酵液进行碱性pH调节同时持续升温；其中pH调节为8～11，优选为9～10，持续升温是将温度控制在80～90℃，优选85～90℃后，恒温20～40min，优选20～30min。所述的碱性pH调节剂是强碱，如可以是氢氧化钠、氢氧化钾等中的至少一种。
本发明方法中，步骤（3）膜过滤的膜孔直径为10～50nm，优选20～25nm；过滤温度40～60℃，优选40～50℃。然后将发酵清液室温静置分层，静置时间为20min以上，优选20～30min，获得水相清液。
本发明方法中，步骤（3）所述酸析是将水相清液进行酸性pH调节，控制pH为3～5，优选4.5～5，使长链二元酸析出。使用的酸性pH调节剂为强酸，如可以是硫酸、盐酸、硝酸等中的至少一种。
本发明方法中，步骤（3）所述过滤是采用板框过滤等，过滤压力为0.1～1.0MPa，过滤温度为10～30℃。所述的烘干条件是烘干温度为80～105℃，烘干时间为5～20h。
与现有技术相比，本发明方法具有以下有益效果：
（1）本发明在高通气量条件下，能够高效收集由汽提作用产生的烷烃，并形成烷烃液化回补方案，同时将通气量和罐内压力联锁组合，针对发酵过程阶段性特征，进行阶段性调整，既提高底物烷烃转化率，又提高了发酵水平。
（2）本发明在高通气量下高效收集由汽提作用产生的烷烃，解决了尾气直排造成的环境污染和尾气直接回用影响发酵效果的问题。
（3）本发明实现烷烃一次添加，相比传统批次补加烷烃的方法，既能提高烷烃在发酵体系中的停留时间，提高烷烃乳化效果，利于菌种利用，又简化操作过程，适用于工业应用。
附图说明
图1为本发明的一种工艺流程图；
其中1-发酵罐，2-烷烃分离器，3-碱洗设备；
图2为本发明烷烃分离器的细节图；
其中2-1尾气管道，2-2流通小孔，2-3烷烃回流管，2-4排气孔。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明方法和效果。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可从生化试剂商店购买得到。
长链二元酸的提取总收率T的计算公式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中，V为长链二元酸发酵液经膜过滤，除去未反应烷烃后获得的清液体积，L；M为提取的长链二元羧酸干重，g；C为长链二元羧酸的下罐浓度，g/L。
烷烃转化率K计算公式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
其中，M1为发酵过程中加入的烷烃总质量，g；M2为膜过滤过程中回收的烷烃总质量，g。
烷烃吨消耗R计算公式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
本发明实施例中发酵菌选用热带假丝酵母（Candida tropicalis）突变株PF-UV-56，该突变株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.0356。
发酵菌种子液制备：将斜面保藏的热带假丝酵母CGMCC No.0356经两级摇瓶活化后扩大培养10倍，转入种子罐扩大培养。种子培养罐采用1m3和10m3两级培养，培养温度为32℃，转数为120rpm，通气量为0.8vvm，培养时间24h，一级种子培养罐转入二级种子培养罐的接种比例为10%。
发酵培养基配方为：蔗糖20g/L、玉米浆0.8g/L、酵母膏2.0g/L、氯化钠0.8g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、硫酸镁1.2g/L、尿素1.2g/L，硫酸铵1.5g/L、醋酸钠1.5g/L。
本发明实施例采用附图1所述流程中，其中烷烃分离器的结构如图2所示。发酵尾气管道（2-1）与烷烃分离器2内腔贯通，并在尾气管道（2-1）下缘有数个尾气流通小孔（2-2）；烷烃分离器底部设置烷烃回流管（2-3），烷烃分离器顶部设置排气孔（2-4）。发酵尾气经尾气管道（2-1）进入烷烃分离器2，在流通小孔（2-2）作用下，实现烷烃液化，烷烃在分离器底部汇集并通过烷烃回流管（2-3）进入发酵罐，初步分离的尾气通过排气孔（2-4）进入碱洗设备。
实施例1
将5.25m3发酵菌种子液和发酵培养基接入50m3发酵罐中，并加入8.75m3十二碳正构烷烃，发酵液体积共计35m3。
采用通气量和罐内压力联锁控制，在发酵0～24h内，通气量为0.5vvm，罐内压力控制为0.12MPa；24～96h内，通气量为1.2vvm，罐内压力控制为0.08MPa；96～144h内，通气量为1.0vvm，罐内压力控制为0.1MPa，直至发酵结束。
从24h后开始进行pH调整，初期控制7.0，随后每间隔24h将pH控制值提高0.3，直至发酵结束。
发酵144h结束，将pH调至9，并持续升温至90℃后，恒温30min。将发酵液降温至40℃，经膜过滤进行固液分离，膜孔直径20nm。然后将发酵清液静置30min，分层后获得水相清液。将水相清液流加浓硫酸，pH调至4.5，使长链二元酸结晶析出。经板框过滤及烘干后获得长链二元酸产品，过滤压力1.0MPa，过滤温度30℃；烘干温度105℃，烘干时间20h。
经检测分析和计算，发酵液中十二碳二元酸浓度为156g/L，长链二元酸提取收率90%，烷烃转化率95%，烷烃吨消耗1.11t/t。
实施例2
将3.5m3发酵菌种子液和发酵培养基接入50m3发酵罐中，并加入7m3十二碳正构烷烃，发酵液体积共计35m3。
采用通气量和罐内压力联锁控制，在发酵0～24h内，通气量为0.7vvm，罐内压力控制为0.1MPa；24～96h内，通气量为1.1vvm，罐内压力控制为0.09MPa；96～133h内，通气量为0.8vvm，罐内压力控制为0.11MPa，直至发酵结束。
从24h后开始进行pH调整，初期控制7.0，随后每间隔24h将pH控制值提高0.2，直至发酵结束。
发酵133h结束，将pH调至10，并持续升温至85℃后，恒温20min。将发酵液降温至50℃，经膜过滤进行固液分离，膜孔直径25nm。然后将发酵清液静置20min，分层后获得水相清液。将水相清液流加浓硫酸，pH调至5，长链二元酸结晶析出。经板框过滤及烘干后获得长链二元酸产品，过滤压力0.1MPa，过滤温度20℃；烘干温度80℃，烘干时间20h。
经检测分析和计算，发酵液中十二碳二元酸浓度为142g/L，长链二元酸提取收率85%，烷烃转化率99%，烷烃吨消耗1.13t/t。
实施例3
将4.55m3发酵菌种子液和发酵培养基接入50m3发酵罐中，并加入8.05m3十二碳正构烷烃，发酵液体积共计35m3。
采用通气量和罐内压力联锁控制，在发酵0～24h内，通气量为0.6vvm，罐内压力控制为0.11MPa；24～96h内，通气量为1.1vvm，罐内压力控制为0.09MPa；96～144h内，通气量为0.9vvm，罐内压力控制为0.1MPa，直至发酵结束。
从24h后开始进行pH调整，初期控制6.8，随后每间隔24h将pH控制值提高0.1，直至发酵结束。发酵周期144h。
发酵144h结束，将pH调至9.5，并持续升温至85℃后，恒温30min。将发酵液降温至50℃，经膜过滤进行固液分离，膜孔直径25nm。然后将发酵清液静置20min，分层后获得水相清液。将水相清液流加浓硫酸，pH调至5，使长链二元酸结晶析出。经板框过滤及烘干后获得长链二元酸产品，过滤压力0.1MPa，过滤温度20℃；烘干温度80℃，烘干时间20h。
经检测分析和计算，发酵液中十二碳二元酸浓度为152g/L，长链二元酸提取收率86%，烷烃转化率99%，烷烃吨消耗1.12t/t。
实施例4
将5.25m3发酵菌种子液和发酵培养基接入50m3发酵罐中，并加入8.75m3十三碳正构烷烃，发酵液体积共计35m3。
采用通气量和罐内压力联锁控制，在发酵0～24h内，通气量为0.5vvm，罐内压力控制为0.12MPa；24～96h内，通气量为1.2vvm，罐内压力控制为0.08MPa；96～144h内，通气量为1.0vvm，罐内压力控制为0.1MPa，直至发酵结束。
从24h后开始进行pH调整，初期控制7.0，随后每间隔24h将pH控制值提高0.3，直至发酵结束。
发酵144h结束，将pH调至9，并持续升温至90℃后，恒温30min。将发酵液降温至40℃，经膜过滤进行固液分离，膜孔直径20nm。然后将发酵清液静置30min，分层后获得水相清液。将水相清液流加浓硫酸，pH调至4.5，使长链二元酸结晶析出。经板框过滤及烘干后获得长链二元酸产品，过滤压力1.0MPa，过滤温度30℃；烘干温度105℃，烘干时间20h。
经检测分析和计算，发酵液中十三碳二元酸浓度为146g/L，长链二元酸提取收率90%，烷烃转化率94%，烷烃吨消耗1.23t/t。
实施例5
将5.25m3发酵种子液和发酵培养基接入50m3发酵罐中，并加入8.75m3十二碳正构烷烃，发酵液体积共计35m3。
采用通气量和罐内压力联锁控制，在发酵0～24h内，通气量为0.5vvm，罐内压力控制为0.12MPa；24～96h内，通气量为1.2vvm，罐内压力控制为0.08MPa；96～144h内，通气量为1.0vvm，罐内压力控制为0.1MPa，直至反应结束。
发酵过程中pH始终控制在7.6，直至发酵结束。
发酵144h结束，将pH调至9，并持续升温至90℃后，恒温30min。将发酵液降温至40℃后，经膜过滤进行固液分离，膜孔直径20nm。然后将发酵清液静置30min，分层后获得水相清液。将水相清液流加浓硫酸，pH调至4.5，使长链二元酸结晶析出。经板框过滤及烘干后获得长链二元酸产品，过滤压力1.0MPa，过滤温度30℃；烘干温度105℃，烘干时间20h。
经检测分析和计算，发酵液中十二碳二元酸浓度为109g/L，长链二元酸提取收率90%，烷烃转化率75%，烷烃吨消耗1.39t/t。
实施例6
将5.25m3发酵种子液和发酵培养基接入50m3发酵罐中，并加入8.75m3十二碳正构烷烃，发酵液体积共计35m3。
发酵周期内，通气量始终为1vvm，罐内压力控制为0.1MPa。
从24h后开始进行pH调整，初期控制7.0，随后每间隔24h将pH控制值提高0.3，直至反应结束。发酵周期144h。
发酵结束后，将pH调至9，并持续升温至90℃后，恒温30min。
将发酵液降温至40℃后，经膜过滤进行固液分离，膜孔直径20nm。然后将发酵清液静置30min，分层后获得水相清液。将过滤水相清液流加浓硫酸，pH调至4.5，使长链二元酸结晶析出。经板框过滤及烘干后获得长链二元酸产品，过滤压力1.0MPa，过滤温度30℃；烘干温度105℃，烘干时间20h。
经检测分析和计算，发酵液中十二碳二元酸浓度为142g/L，长链二元酸提取收率90%，烷烃转化率90%，烷烃吨消耗1.28t/t。
实施例7
同实施例1，不同在于：烷烃分离器设置两级。发酵液中十二碳二元酸浓度为162g/L，长链二元酸提取收率90%，烷烃转化率93%，烷烃吨消耗1.05t/t。
比较例1
同实施例1，不同在于：尾气不经过烷烃分离器，直接以气体形式回用至发酵罐中。发酵液中十二碳二元酸浓度为142.1g/L，长链二元酸提取收率90%，烷烃转化率75%，烷烃吨消耗1.43t/t。
比较例2
同实施例1，不同在于：不进行通气量和罐内压力联锁控制，发酵过程中通气量始终为1.0vvm，罐内压力自然。发酵液中十二碳二元酸浓度为151.6g/L，长链二元酸提取收率90%，烷烃转化率80%，烷烃吨消耗1.36t/t。

Claims (13)

1.一种生物转化制备长链二元酸的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）在发酵罐内加入发酵菌种子液和发酵培养基，一次性添加烷烃，启动发酵过程；
（2）通过通气量和罐内压力的组合方式，调控发酵过程，发酵尾气进入烷烃分离器，产生的液化烷烃返回发酵罐；
（3）发酵结束后，经破乳、膜过滤、酸析、过滤、烘干后，获得长链二元酸产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所采用发酵菌来自能利用烷烃生长的微生物，以及具有完整α、ω-氧化途径的微生物，优选假丝酵母属、隐球酵母属、内孢霉属、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母属、红酵母属、球拟酵母属、丝孢酵母属中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的发酵菌种子液是将斜面保藏的菌种经摇瓶扩大培养及种子罐扩大培养，获得发酵菌种子液；所述的摇瓶扩大培养，从摇瓶种子开始，进入下一级培养接种量按照7～15倍进行扩大培养，优选10～12倍扩大；所述的种子罐扩大培养采用通入空气的培养方式，通气量为0.5～1.2vvm，发酵温度为25～37℃，优选28～32℃；搅拌转速为120～500rpm，优选150～300rpm；培养时间为18～24小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的发酵菌种子液的添加量为发酵液体积的5%～20%，优选10%～15%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的发酵培养基配方为：蔗糖20～28g/L、玉米浆0.8～1.5g/L、酵母膏2.0～4.0g/L、氯化钠0.8～1.2g/L、磷酸二氢钾3.0～3.5g/L、硫酸镁1.2～1.8g/L、尿素1.2～4.8g/L，硫酸铵1.5～2g/L、醋酸钠1.5～1.8g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的烷烃为C11-C16的正构烷烃，添加量为发酵液体积的20%～25%。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述发酵过程中发酵温度为25～37℃，优选28～32℃；搅拌转速为120～500rpm，优选150～300rpm，发酵时间为138～144小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述发酵过程中控制通气量为0.5～1.2vvm，罐内压力为0.02～0.12MPa。
9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述发酵过程中通气量和罐内压力的组合方式具体为：在发酵0～24h内，通气量为0.5～0.7vvm，罐内压力控制为0.10～0.12MPa；24～96h内，通气量为1.1～1.2vvm，罐内压力控制为0.08～0.09MPa；96h～发酵结束，通气量为0.8～1.0vvm，罐内压力控制为0.1～0.11MPa。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）采用逐级调整pH的方式调控发酵过程，具体为：在发酵0～24h内，不进行pH控制；24h后将pH调整至6.8～7.0；随后每间隔24h将pH控制值提高0.1～0.3，直至发酵结束。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述发酵尾气通过尾气管道水平延伸进入烷烃分离器内部，进入烷烃分离器内部的管道底部设流通小孔，尾气经流通小孔进行液化，液化烷烃流入烷烃分离器底部，经底部排放孔流出后通过泵返回发酵罐中。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：流通小孔与管道连接处的横截面积总和为尾气管道横截面积的80%，流通小孔出口总横截面积为管道横截面积的60%。
13.根据权利要求1、11或12所述的方法，其特征在于：烷烃分离器进行2～4级串联连接，以提升尾气中烷烃的回收效果。
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