CN112708604A

CN112708604A - 玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体及其高产菌株

Info

Publication number: CN112708604A
Application number: CN202110124609.XA
Authority: CN
Inventors: 张静静; 程斯达; 康丽华; 李宾; 郭瑞; 黄亦钧; 李玉强
Original assignee: Weifang Kdn Biotech Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Weifang Kdn Biotech Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2041-01-29
Also published as: CN112708604B

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体提供了一种玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体及其高产菌株。所述突变体YU‑A1、YU‑A2、YU‑A3在毕赤酵母中重组表达，比酶活分别提高了118.6%、120.4%和232.2%，取得了意料不到的技术效果。

Description

玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体及其高产菌株

技术领域

本发明属于基因工程和微生物改造技术领域，具体内容涉及一种玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体及其高产菌株。

背景技术

霉菌毒素（mycotoxin）是霉菌在生长过程中产生的有毒次级代谢产物，主要包括黄曲霉毒素（aflatoxin，AF）、单端孢霉烯族毒素（trichothecenes，如T-2毒素、新茄病镰刀菌烯醇NEO和呕吐毒素 DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素A（ochratoxinA，OTA）及烟曲霉毒素（fumonisins）等。谷物等原料在田间就会被霉菌污染，在运输、加工、储存过程中如果环境温度、湿度适合，霉菌会继续生长，毒素含量也会相继增加。据联合国粮农组织（FAO）估计，全世界每年有25%的谷物受到霉菌毒素的污染，平均有2%不能食用；加之因毒素污染导致动物中毒引起的疾病和死亡，给粮食工业和畜牧业造成巨大的经济损失。

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN），又称F-2毒素，1962年由Stob等人于受赤霉病污染的玉米中分离得到。主要由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、黄色镰刀菌（Fusarum culmorum）和克地镰刀菌（Fusarum rookwellense）产生，镰刀菌既营寄生又营腐生生活，生态适应性强，分布广泛，玉米、小麦、大麦和燕麦等谷物发生霉变易感染镰刀菌而被ZEN污染。动物由于食用受ZEN污染的饲料吸收ZEN，ZEN具有类雌激素作用，在体内能与雌激素竞争结合相应受体（ER），激活下游反应元件，引发雌激素受体二聚化，进而产生一系列的拟雌激素效应，造成动物体内雌激素水平紊乱，破坏动物尤其是母猪的生殖系统。主要表现为食欲下降、免疫抑制以及生长缓慢，持续中毒会使母畜产生繁殖障碍，引发不孕不育、流产和死胎现象。ZEN还具有很强的致癌性，可通过动物的摄入影响人类可食用的肉制品和奶制品，对人类的健康造成严重威胁。

为了避免ZEN通过饲料、食品原料等方式进入食物链，除了加大对于饲料、食品原料等的监管和检测力度，还可以通过一些方法降低或去除ZEN。降解ZEN及其衍生物的方法主要包括化学法、物理法和生物法。化学法主要是通过强酸强碱如臭氧、过氧化氢、碳酸钠等化学试剂与ZEN发生化学反应，将其转变成其他低毒甚至无毒物质。物理法主要是高温法、辐射法、高压法及吸附法等。然而，这些技术只是部分有效，不能完全去除ZEN，并且由于其高成本和低效率而使工业应用受到阻碍。化学和物理处理也会破坏谷物和饲料的营养成分，会引入二次污染。相比之下，生物法具有环保，高效，成本低等优点，更重要的是不会对食品或饲料原料造成二次污染。因此，这种方法在食品和饲料工业中显示出巨大的前景。

生物法主要包括微生物吸附和酶降解法。对于微生物吸附法，研究发现酵母菌和乳酸菌等真菌的细胞壁主要成分为肽聚糖，它们通过糖苷键连接，在细胞壁表面形成网状结构，对于ZEN等真菌毒素具有显著的吸附作用。生物酶降解法主要是微生物代谢产生的酶（内酯水解酶、蛋白酶和过氧化物酶等）能通过水解或氧化等方式破坏ZEN的结构使其转化成低毒或无毒物质。例如，YU等筛选到不动杆菌Acinetobacter sp. SM04可对ZEN脱毒，随后鉴定出是该菌的过氧化物酶对ZEN有脱毒功能。TAKAHASHI-ANDO等首次报道了来源于Clonostachys rosea IFO 7063 的ZEN内酯水解酶ZHD101，该酶具有降解ZEN的能力。

由于酶降解法具有处理条件温和、产品品质高、特异性强等优点，因此酶法降解玉米赤霉烯酮毒素是目前研究的一个热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体及其高产菌株。所述突变体的比酶活得到显著提高，有利于降低该酶的生产成本，促进其在饲料领域中的推广和应用。

本发明涉及一种玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体，其包含与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：37，156，225。

在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少96%，97%，98%，或至少99%的同一性。

在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。

在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：Q37V，N156K，I225W。

在本发明的一些实施例中，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：Q37V，Q37V/N156K，Q37V/N156K/I225W。

所述突变体具有如SEQ ID NO:3或 SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

本发明还涉及编码上述黄曲霉毒素降解酶突变体的DNA分子。

所述的DNA分子具有如SEQ ID NO:4或 SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

本发明还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。

本发明还涉及一种毕赤酵母（Pichia pastoris），包含上述重组表达载体。

将上述的质粒转入毕赤酵母中，重组表达的玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体的比酶活水平得到显著提升。

在本发明的一些实施例中，所述毕赤酵母还包含乙酰辅酶A合成酶C2基因。

所述乙酰辅酶A合成酶C2基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO：9。

将上述乙酰辅酶A合成酶C2基因转入毕赤酵母中，重组表达的玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体的酶活水平得到显著提高。

所述毕赤酵母命名为毕赤酵母YU-A3-25（Pichia pastoris YU-A3-25），已于2020年12月2日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020817。

与野生型相比，本发明提供的玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体YU-A1、YU-A2、YU-A3在毕赤酵母中重组表达，比酶活分别提高了118.6%、120.4%和232.2%，取得了意料不到的技术效果。

此外，通过在毕赤酵母工程菌中胞内共表达乙酰辅酶A合成酶C2基因能显著提高其表达玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体的酶活。改造后的毕赤酵母YU-A3-25发酵酶活最高达到23210U/ml，比改造前提高了60%。所述毕赤酵母菌株可广泛应用于玉米赤霉烯酮毒素降解酶的生产，有助于降低该酶的生产成本，从而促进其在饲料领域中的广泛应用。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

菌株与载体：大肠杆菌DH5α本公司保藏，毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、pPICZA、Amp、G418、Zeocin购自Invitrogen公司。

酶与试剂盒：DNA聚合酶购买自Takara公司，T4连接酶、限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司，玉米赤霉烯酮毒素降解酶检测试剂盒RIDASCREEN Aflatoxin B1 30/15 R1211购自R-Biopharm公司。

培养基配方：

大肠杆菌培养基（LB培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；

LB+Amp培养基：LB培养基加100μg/mL氨苄青霉素；

酵母培养基（YPD培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；

YPD+Zeocin培养基：YPD培养基加100μg/ml Zeocin；

酵母筛选培养基（MD培养基）：1.34% YNB，4×10^-5生物素，1%甘油、2%琼脂糖；

BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10^-5生物素，1%甘油；

BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10^-5生物素，0.5%甲醇。

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1、玉米赤霉烯酮毒素降解酶YU基因的合成

申请人将来源于粉红粘帚霉（Clonostachys rosea）的玉米赤霉烯酮毒素降解酶基因，命名为YU，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2，编码氨基酸序列为SEQ ID NO:1。由华大基因公司进行全基因合成。

实施例2、玉米赤霉烯酮降解酶YU突变体的筛选

为了进一步提高玉米赤霉烯酮降解酶YU的比酶活，通过定向进化技术对该酶的基因进行了大量突变的筛选；以玉米赤霉烯酮毒素降解酶YU为模板，利用引物1(F)和引物1(R)用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（Stratagene）进行PCR扩增；

引物1(F)：GCGCGAATTCATGAGAACTCGCAGTACTATTTCTA；

引物1(R)：TAAAGCGGCCGCTTACAAATGCTTTTGAGTAGTTTCA。

胶回收PCR产物，EcoRI、Not I进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养；待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150 ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃、220rpm培养6 h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有玉米赤霉烯酮毒素降解酶的大肠杆菌细胞裂解液。再离心去除菌体，将上清液分别进行玉米赤霉烯酮毒素降解酶活力和蛋白含量测定，计算比酶活。

实验结果表明，有些突变对玉米赤霉烯酮毒素降解酶H1的比酶活没有影响，有些突变甚至使其比酶活变得更低了。最终，申请人得到比酶活显著提高的突变位点的组合：Q37V单点突变，Q37V/N156K两点突变，Q37V/N156K/I225W三点突变。

将含Q37V单点突变的玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体命名为YU-A1，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。

将含Q37V/N156K两点突变的玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体命名为YU-A2，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：6。

将含Q37V/N156K/I225W三点突变的玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体命名为YU-A3，其氨基酸序列为SEQ ID NO：7，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：8。

以上核苷酸序列由华大基因公司合成。

用引物1(F)和引物1(R)对YU-A1、YU-A2、YU-A3进行PCR扩增，PCR条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃保温10min。YU-A1、YU-A2、YU-A3基因长度与YU基因相同，全长795bp。

实施例3、表达重组玉米赤霉烯酮毒素降解酶的毕赤酵母工程菌的构建

1、重组质粒的构建

将克隆得到的玉米赤霉烯酮毒素降解酶基因YU和突变体基因YU-A1、YU-A2、YU-A3分别用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，100 μl酶切体系如下：玉米赤霉烯酮毒素降解酶基因YU（YU-A1、YU-A2、YU-A3）的 PCR产物40 μl、10×H buffer 10 μl、10×BSA 10μl、EcoR I 5 μl、Not I 5 μl、ddH₂O 30 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。

将表达载体pPIC9K先用限制性内切酶EcoR I进行单酶切，100 μl酶切体系如下：表达载体pPIC9K 20 μl、10×H buffer 10 μl、EcoR I 5 μl、ddH₂O 65 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。将回收片段再用限制性内切酶Not I进行单酶切，100 μl酶切体系如下：pPIC9K回收片段20 μl、10×H buffer 10 μl、10×BSA 10 μl、10×Triton 10 μl、Not I 5 μl、ddH₂O 45 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。

将经EcoR I和Not I双酶切的YU、YU-A1、YU-A2、YU-A3片段分别与经同样酶切后的表达载体pPIC9K连接，构建重组表达质粒pPIC9K-YU、pPIC9K- YU-A1、pPIC9K- YU-A2、pPIC9K- YU-A3。连接体系如下：表达载体pPIC9K双酶切产物5 μl、YU（YU-A1、YU-A2、YU-A3）基因双酶切产物3 μl、10×T₄ ligase buffer 1 μl、T₄ ligase 1 μl。22 ℃连接过夜，转化到大肠杆菌DH5α，挑取转化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到LB+Amp液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒pPIC9K-YU（pPIC9K- YU-A1、pPIC9K-YU-A2、pPIC9K- YU-A3）。

、转化与筛选

将重组酵母表达质粒pPIC9K-YU和pPIC9K- YU-A1、pPIC9K- YU-A2、pPIC9K- YU-A3分别用Sal I进行线性化，线性化产物用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板。在MD平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株，然后涂布含不同浓度遗传霉素G418的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。

、摇瓶发酵验证

挑取单个多拷贝转化子分别接入BMGY培养基中，30℃、220rpm振荡培养24小时后，再转入BMMY培养基中，30℃、220rpm振荡培养，每24小时添加0.5%的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，将上清液分别进行玉米赤霉烯酮毒素降解酶酶活力和蛋白含量测定，计算比酶活。

结果显示，在摇瓶条件下，重组表达野生型玉米赤霉烯酮毒素降解酶基因YU的转化子发酵酶活最高达到4519U/ml，蛋白含量为0.98g/l，比酶活为4611.2U/mg。将该转化子命名为毕赤酵母YU-78（Pichia pastoris YU-78）；

重组表达玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体基因YU-A1的转化子发酵酶活最高达到9477U/ml，蛋白含量为0.94g/l，比酶活为10081.9 U/mg。将该转化子命名为毕赤酵母YU-A1-15（Pichia pastoris YU-A1-15）；

重组表达玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体基因YU-A2的转化子发酵酶活最高达到9858U/ml，蛋白含量为0.97g/l，比酶活为10162.9U/mg。将该转化子命名为毕赤酵母YU-A2-67（Pichia pastoris YU-A2-67）。

重组表达玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体基因YU-A3的转化子发酵酶活最高达到15012U/ml，蛋白含量为0.98g/l，比酶活为15318.4U/mg。将该转化子命名为毕赤酵母YU-A3-154（Pichia pastoris YU-A3-154）。

从上述结果可以看出，与野生型相比，本发明提供的突变体基因YU-A1、YU-A2、YU-A3在毕赤酵母中重组表达，比酶活分别提高了118.6%、120.4%和232.2%，取得了意料不到的技术效果。

（一）玉米赤霉烯酮毒素降解酶酶活检测方法

1、酶活力单位定义

在pH7.0，37℃条件下，每分钟降解1pmol ZEN所需的酶量为一个酶活力单位。

2、样品处理方法

液体样品：离心取上清，直接用于后续测定。

3、酶反应实验步骤

表1 酶反应步骤

注: 酶反应试验操作时，可先精密取缓冲液（0.02 M柠檬酸-0.04 M磷酸氢二钠，pH=7.0）45ml与ZEN标准储备液2.5ml混匀（即为18:1），再精密量取1.9ml，以缩小检验偏差

4、酶活计算方法

式中：

U为酶活，U/ml；

F为稀释倍数；

C_对照：对照组ZEN浓度，ppb；

C_试验：试验组ZEN浓度，ppb；

A：取样体积，ml。

（二）考马斯亮蓝法检测蛋白含量

1、试剂

（1）考马斯亮蓝G-250染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升，常温可使用1个月；

（2）标准蛋白溶液：用牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度，配制成1 mg/ml的蛋白质标准溶液；

（3）标准原液的配制：在分析天平上精确称取0.05g结晶牛血清蛋白，于小烧杯中，加入少量蒸馏水溶解后转入50ml容量瓶中，烧杯内残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度。配制成标准原液，其中牛血清蛋白浓度为1000μg/ml。

2、标准曲线的绘制。

（1）分别取6支试管，编号，按下表加入试剂，混匀。

管号	1	2	3	4	5	6
							样品（ml）	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
水（ml）	2.0	1.9	1.8	1.7	1.6	1.5
							蛋白质含量（mg/ml）	0	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25

准确吸取2.5ml 考马斯亮蓝溶液于6支干净试管中，准确吸取上述各管溶液0.1ml，对应放于各自编号的试管中，涡旋混匀，室温放置5min后，以1号试管调零，测定在595nm处比色，记录吸光值。

（2）绘制标准曲线：记录1-6管所读吸光值，以蛋白质含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。注意，由于考马斯亮蓝染色能力强，比色杯一定要洗干净。不可用石英杯测定。

3、样品的测定

样品的准备：

（1）液体样品：将待测样品稀释至蛋白含量0.1-0.3mg/ml，控制除去空白后的吸光值（减去空白以后）在0.2-0.4之间；

（2）固体样品：准确称取1.0000g样品于100ml三角瓶中，用移液枪加入20ml去离子水，磁力搅拌10min，4000rpm离心10min，取上清进一步稀释测定蛋白含量，稀释方法参见液体样品。

样品检测：

取干净试管，加入到含有2.5ml考马斯亮蓝溶液，然后加入待测样品，涡旋震荡摇匀，室温放置5min，以标准曲线空白作对照，用1cm光径的微量比色杯在595nm测定吸光度，根据标曲求得蛋白含量。

4、蛋白含量计算

蛋白含量=X*稀释倍数*标样折算系数。

X：根据标曲求出的蛋白含量（mg/ml）

标样折算值：标样为47mg/ml，根据实测值折算一个系数。

（三）比酶活的计算

“比酶活 (Specific Activity)”是指：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用U/mg蛋白质来表示。一般来说，比酶活越高，酶越纯。

比活力计算公式：比酶活（U/mg）=酶活（U/mL）/ 蛋白含量（mg/mL）。

实施例4 毕赤酵母YU-A3-154的调控基因改造

1、乙酰辅酶A合成酶C2的克隆

以毕赤酵母GS115的基因组为模板，用PCR反应克隆乙酰辅酶A合成酶C2基因，引物和反应条件如下：

引物1(F)：GCGCGAATTCATGACTTTTCCAGAGCCAAGAGAACACAAA；

引物1(R)：TAAAGCGGCCGCCTACTTCTTGAAGAACTGGTTATCAACAG。

PCR条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸2min30s，35个循环后，72℃保温10min。乙酰辅酶A合成酶C2基因全长2019bp，其核苷酸序列为SEQ IDNO：7。

、乙酰辅酶A合成酶C2基因的表达质粒构建

将克隆得到的乙酰辅酶A合成酶C2基因用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，50 μl酶切体系如下：乙酰辅酶A合成酶C2基因43μl、10×FastDigest Buffer 5 μl、EcoR I 1 μl、Not I 1 μl。37℃酶切2h后，琼脂糖凝胶电泳回收。

将表达载体pPICZA用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，50 μl酶切体系如下：载体pPICZA 43μl、10×FastDigest Buffer 5 μl、EcoR I 1 μl、Not I 1 μl。37℃酶切2h后，琼脂糖凝胶电泳回收。

将经EcoR I和Not I双酶切的乙酰辅酶A合成酶C2基因片段与经同样酶切后的表达载体pPICZA连接，构建重组表达质粒pPICZA-C2。连接体系如下：表达载体pPICZA双酶切产物5 μl、乙酰辅酶A合成酶C2基因双酶切产物3 μl、10×T₄ ligase buffer 1 μl、T₄ligase 1 μl。22 ℃连接过夜，转化到大肠杆菌DH5α，挑取转化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到LC+Zeocin液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为酵母胞内表达质粒pPICZA-C2。

、调控基因C2转入毕赤酵母YU-A3-154

将重组质粒pPICZA-C2用限制性内切酶SacI进行线性化，线性化产物用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母工程菌YU-A3-154，涂布YPD+Zeocin平板。在YPD+Zeocin平板上生长出的菌落即为转入C2的毕赤酵母工程菌株。

、菌株摇瓶发酵筛选验证

挑取多个阳性转化子分别接入BMGY培养基中，30℃、220rpm振荡培养24小时后，再转入BMMY培养基中，30℃、220rpm振荡培养，以YU-A3-154菌株为对照，每24小时添加0.5%的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，将上清液进行玉米赤霉烯酮毒素降解酶活力测定。

结果显示，在摇瓶条件下，转入C2基因的转化子中发酵酶活最高的达到23210 U/ml，，比改造前的毕赤酵母YU-A3-154提高了60%。申请人将该转化子命名为毕赤酵母YU-A3-25（Pichia pastoris YU-A3-25）。从而说明，通过在毕赤酵母工程菌中胞内共表达C2基因能显著提高其表达玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体YU-A3的酶活，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2020年12月2日将毕赤酵母YU-A3-25（Pichia pastoris YU-A3-25）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020817。

序列表

<110> 潍坊康地恩生物科技有限公司

青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体及其高产菌株

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 264

<212> PRT

<213> 粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)

<400> 1

Met Arg Thr Arg Ser Thr Ile Ser Thr Pro Asn Gly Ile Thr Trp Tyr

1 5 10 15

Tyr Glu Gln Glu Gly Thr Gly Pro Asp Val Val Leu Val Pro Asp Gly

20 25 30

Leu Gly Glu Cys Gln Met Phe Asp Ser Ser Val Ser Gln Ile Ala Ala

35 40 45

Gln Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met Ser Arg Ser

50 55 60

Ala Lys Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Thr Glu Val Thr Ala Gln Lys Leu

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Val Ile Ser Val Leu Asp Ala Leu Asp Ile Lys His Ala

85 90 95

Thr Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Leu Leu

100 105 110

Leu Gly Tyr Pro Asp Arg Ile Arg Asn Ala Met Cys His Glu Leu Pro

115 120 125

Thr Lys Leu Leu Asp His Leu Ser Asn Thr Ala Val Leu Glu Asp Glu

130 135 140

Glu Ile Ser Lys Ile Leu Ala Asn Val Met Leu Asn Asp Val Ser Gly

145 150 155 160

Gly Ser Glu Ala Trp Gln Ala Met Gly Asp Glu Val His Ala Arg Leu

165 170 175

His Lys Asn Tyr Pro Val Trp Ala Arg Gly Tyr Pro Arg Thr Ile Pro

180 185 190

Pro Ser Ala Pro Val Lys Asp Leu Glu Ala Leu Arg Gly Lys Pro Leu

195 200 205

Asp Trp Thr Val Gly Ala Ala Thr Pro Thr Glu Ser Phe Phe Asp Asn

210 215 220

Ile Val Thr Ala Thr Lys Ala Gly Val Asn Ile Gly Leu Leu Pro Gly

225 230 235 240

Met His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Asp Val Phe Ala Lys Tyr Val

245 250 255

Val Glu Thr Thr Gln Lys His Leu

260

<210> 2

<211> 795

<212> DNA

<213> 粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)

<400> 2

atgagaactc gcagtactat ttctactcca aacggtatta cttggtacta cgaacaagaa 60

ggtactggtc cagatgttgt tttggttcca gatggtttgg gtgaatgtca aatgtttgat 120

tcttctgttt ctcaaattgc tgctcaaggt tttagagtta ctacttttga tatgccaggt 180

atgtctcgtt ctgctaaggc tccaccagaa acttacactg aagttactgc tcaaaagttg 240

gcttcttacg ttatttctgt tttggatgct ttggatatta agcacgctac tgtttggggt 300

tgttcttctg gtgcttctac tgttgttgct ttgttgttgg gttacccaga tagaattaga 360

aacgctatgt gtcatgaatt gccaactaag ttgttggatc atttgtctaa cactgctgtt 420

ttggaagatg aagaaatttc taagattttg gctaacgtta tgttgaacga tgtttctggt 480

ggttctgagg cttggcaagc tatgggtgac gaagttcatg ctagattgca taagaactac 540

ccagtttggg ctagaggtta cccaagaact attccaccat ctgctccagt taaagatttg 600

gaggctttga gaggtaaacc attggattgg actgttggtg ctgctactcc aactgaatcg 660

ttctttgata acattgttac tgctactaag gctggtgtta acattggttt gttgccaggt 720

atgcattttc catacgtttc tcatccagat gtttttgcta aatatgttgt tgaaactact 780

caaaagcatt tgtaa 795

<210> 3

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Arg Thr Arg Ser Thr Ile Ser Thr Pro Asn Gly Ile Thr Trp Tyr

1 5 10 15

Tyr Glu Gln Glu Gly Thr Gly Pro Asp Val Val Leu Val Pro Asp Gly

20 25 30

Leu Gly Glu Cys Val Met Phe Asp Ser Ser Val Ser Gln Ile Ala Ala

35 40 45

Gln Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met Ser Arg Ser

50 55 60

Ala Lys Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Thr Glu Val Thr Ala Gln Lys Leu

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Val Ile Ser Val Leu Asp Ala Leu Asp Ile Lys His Ala

85 90 95

Thr Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Leu Leu

100 105 110

Leu Gly Tyr Pro Asp Arg Ile Arg Asn Ala Met Cys His Glu Leu Pro

115 120 125

Thr Lys Leu Leu Asp His Leu Ser Asn Thr Ala Val Leu Glu Asp Glu

130 135 140

Glu Ile Ser Lys Ile Leu Ala Asn Val Met Leu Asn Asp Val Ser Gly

145 150 155 160

Gly Ser Glu Ala Trp Gln Ala Met Gly Asp Glu Val His Ala Arg Leu

165 170 175

His Lys Asn Tyr Pro Val Trp Ala Arg Gly Tyr Pro Arg Thr Ile Pro

180 185 190

Pro Ser Ala Pro Val Lys Asp Leu Glu Ala Leu Arg Gly Lys Pro Leu

195 200 205

Asp Trp Thr Val Gly Ala Ala Thr Pro Thr Glu Ser Phe Phe Asp Asn

210 215 220

Ile Val Thr Ala Thr Lys Ala Gly Val Asn Ile Gly Leu Leu Pro Gly

225 230 235 240

Met His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Asp Val Phe Ala Lys Tyr Val

245 250 255

Val Glu Thr Thr Gln Lys His Leu

260

<210> 4

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagaactc gcagtactat ttctactcca aacggtatta cttggtacta cgaacaagaa 60

ggtactggtc cagatgttgt tttggttcca gatggtttgg gtgaatgtgt tatgtttgat 120

tcttctgttt ctcaaattgc tgctcaaggt tttagagtta ctacttttga tatgccaggt 180

atgtctcgtt ctgctaaggc tccaccagaa acttacactg aagttactgc tcaaaagttg 240

gcttcttacg ttatttctgt tttggatgct ttggatatta agcacgctac tgtttggggt 300

tgttcttctg gtgcttctac tgttgttgct ttgttgttgg gttacccaga tagaattaga 360

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ttggaagatg aagaaatttc taagattttg gctaacgtta tgttgaacga tgtttctggt 480

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ccagtttggg ctagaggtta cccaagaact attccaccat ctgctccagt taaagatttg 600

gaggctttga gaggtaaacc attggattgg actgttggtg ctgctactcc aactgaatcg 660

ttctttgata acattgttac tgctactaag gctggtgtta acattggttt gttgccaggt 720

atgcattttc catacgtttc tcatccagat gtttttgcta aatatgttgt tgaaactact 780

caaaagcatt tgtaa 795

<210> 5

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Arg Thr Arg Ser Thr Ile Ser Thr Pro Asn Gly Ile Thr Trp Tyr

1 5 10 15

Tyr Glu Gln Glu Gly Thr Gly Pro Asp Val Val Leu Val Pro Asp Gly

20 25 30

Leu Gly Glu Cys Val Met Phe Asp Ser Ser Val Ser Gln Ile Ala Ala

35 40 45

Gln Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met Ser Arg Ser

50 55 60

Ala Lys Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Thr Glu Val Thr Ala Gln Lys Leu

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Val Ile Ser Val Leu Asp Ala Leu Asp Ile Lys His Ala

85 90 95

Thr Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Leu Leu

100 105 110

Leu Gly Tyr Pro Asp Arg Ile Arg Asn Ala Met Cys His Glu Leu Pro

115 120 125

Thr Lys Leu Leu Asp His Leu Ser Asn Thr Ala Val Leu Glu Asp Glu

130 135 140

Glu Ile Ser Lys Ile Leu Ala Asn Val Met Leu Lys Asp Val Ser Gly

145 150 155 160

Gly Ser Glu Ala Trp Gln Ala Met Gly Asp Glu Val His Ala Arg Leu

165 170 175

His Lys Asn Tyr Pro Val Trp Ala Arg Gly Tyr Pro Arg Thr Ile Pro

180 185 190

Pro Ser Ala Pro Val Lys Asp Leu Glu Ala Leu Arg Gly Lys Pro Leu

195 200 205

Asp Trp Thr Val Gly Ala Ala Thr Pro Thr Glu Ser Phe Phe Asp Asn

210 215 220

Ile Val Thr Ala Thr Lys Ala Gly Val Asn Ile Gly Leu Leu Pro Gly

225 230 235 240

Met His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Asp Val Phe Ala Lys Tyr Val

245 250 255

Val Glu Thr Thr Gln Lys His Leu

260

<210> 6

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgagaactc gcagtactat ttctactcca aacggtatta cttggtacta cgaacaagaa 60

ggtactggtc cagatgttgt tttggttcca gatggtttgg gtgaatgtgt tatgtttgat 120

tcttctgttt ctcaaattgc tgctcaaggt tttagagtta ctacttttga tatgccaggt 180

atgtctcgtt ctgctaaggc tccaccagaa acttacactg aagttactgc tcaaaagttg 240

gcttcttacg ttatttctgt tttggatgct ttggatatta agcacgctac tgtttggggt 300

tgttcttctg gtgcttctac tgttgttgct ttgttgttgg gttacccaga tagaattaga 360

aacgctatgt gtcatgaatt gccaactaag ttgttggatc atttgtctaa cactgctgtt 420

ttggaagatg aagaaatttc taagattttg gctaacgtta tgttgaaaga tgtttctggt 480

ggttctgagg cttggcaagc tatgggtgac gaagttcatg ctagattgca taagaactac 540

ccagtttggg ctagaggtta cccaagaact attccaccat ctgctccagt taaagatttg 600

gaggctttga gaggtaaacc attggattgg actgttggtg ctgctactcc aactgaatcg 660

ttctttgata acattgttac tgctactaag gctggtgtta acattggttt gttgccaggt 720

atgcattttc catacgtttc tcatccagat gtttttgcta aatatgttgt tgaaactact 780

caaaagcatt tgtaa 795

<210> 7

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Arg Thr Arg Ser Thr Ile Ser Thr Pro Asn Gly Ile Thr Trp Tyr

1 5 10 15

Tyr Glu Gln Glu Gly Thr Gly Pro Asp Val Val Leu Val Pro Asp Gly

20 25 30

Leu Gly Glu Cys Val Met Phe Asp Ser Ser Val Ser Gln Ile Ala Ala

35 40 45

Gln Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met Ser Arg Ser

50 55 60

Ala Lys Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Thr Glu Val Thr Ala Gln Lys Leu

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Val Ile Ser Val Leu Asp Ala Leu Asp Ile Lys His Ala

85 90 95

Thr Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Leu Leu

100 105 110

Leu Gly Tyr Pro Asp Arg Ile Arg Asn Ala Met Cys His Glu Leu Pro

115 120 125

Thr Lys Leu Leu Asp His Leu Ser Asn Thr Ala Val Leu Glu Asp Glu

130 135 140

Glu Ile Ser Lys Ile Leu Ala Asn Val Met Leu Lys Asp Val Ser Gly

145 150 155 160

Gly Ser Glu Ala Trp Gln Ala Met Gly Asp Glu Val His Ala Arg Leu

165 170 175

His Lys Asn Tyr Pro Val Trp Ala Arg Gly Tyr Pro Arg Thr Ile Pro

180 185 190

Pro Ser Ala Pro Val Lys Asp Leu Glu Ala Leu Arg Gly Lys Pro Leu

195 200 205

Asp Trp Thr Val Gly Ala Ala Thr Pro Thr Glu Ser Phe Phe Asp Asn

210 215 220

Trp Val Thr Ala Thr Lys Ala Gly Val Asn Ile Gly Leu Leu Pro Gly

225 230 235 240

Met His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Asp Val Phe Ala Lys Tyr Val

245 250 255

Val Glu Thr Thr Gln Lys His Leu

260

<210> 8

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgagaactc gcagtactat ttctactcca aacggtatta cttggtacta cgaacaagaa 60

ggtactggtc cagatgttgt tttggttcca gatggtttgg gtgaatgtgt tatgtttgat 120

tcttctgttt ctcaaattgc tgctcaaggt tttagagtta ctacttttga tatgccaggt 180

atgtctcgtt ctgctaaggc tccaccagaa acttacactg aagttactgc tcaaaagttg 240

gcttcttacg ttatttctgt tttggatgct ttggatatta agcacgctac tgtttggggt 300

tgttcttctg gtgcttctac tgttgttgct ttgttgttgg gttacccaga tagaattaga 360

aacgctatgt gtcatgaatt gccaactaag ttgttggatc atttgtctaa cactgctgtt 420

ttggaagatg aagaaatttc taagattttg gctaacgtta tgttgaaaga tgtttctggt 480

ggttctgagg cttggcaagc tatgggtgac gaagttcatg ctagattgca taagaactac 540

ccagtttggg ctagaggtta cccaagaact attccaccat ctgctccagt taaagatttg 600

gaggctttga gaggtaaacc attggattgg actgttggtg ctgctactcc aactgaatcg 660

ttctttgata actgggttac tgctactaag gctggtgtta acattggttt gttgccaggt 720

atgcattttc catacgtttc tcatccagat gtttttgcta aatatgttgt tgaaactact 780

caaaagcatt tgtaa 795

<210> 9

<211> 2019

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgacttttc cagagccaag agaacacaaa gtggtgcacg aagccaacgg cgtaagggct 60

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tctggccacc gtttatccac ttctgaaatt gaaagtgctt tactggaaaa tggcaaagtt 1680

gctgaagctg ctgtgattgg tatttccgat gagctaactg gtcaagctgt tattgctttt 1740

gtcgccttga aagatgccac tgactctgag aatttagacg ctctcagacg tgccttagtc 1800

ttgcatgttc gtggagaaat tggtccattt gcagctccta agtccgtgat tgtggttgat 1860

gacttgccta agacccgatc aggtaagatc atgcgtagag ttttaagaaa gatttcttgc 1920

catgaagctg atcaattggg tgatatgtct actttggcca atcctgaatc ggtagactct 1980

ataatcggag ctgttgataa ccagttcttc aagaagtag 2019

Claims

1.一种玉米赤霉烯酮毒素降解酶突变体，其特征在于，所述的突变体包含与SEQ IDNO:1具有至少95%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：37，156，225。

2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：Q37V，N156K，I225W。

3.如权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：Q37V，Q37V/N156K，Q37V/N156K / I225W。

4.如权利要求3所述的突变体，其特征在于，所述突变体具有如SEQ ID NO:3或 SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

5.编码权利要求1-4任一所述突变体的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子具有如SEQID NO:4或 SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

6.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求5所述的DNA分子。

7.一种毕赤酵母（Pichia pastoris），其特征在于，所述毕赤酵母包含权利要求6所述的重组表达载体。

8.如权利要求7所述的毕赤酵母，其特征在于，所述毕赤酵母还包含乙酰辅酶A合成酶C2基因。

9.如权利要求8所述的毕赤酵母，其特征在于，所述乙酰辅酶A合成酶C2基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO：9。

10.如权利要求9所述的毕赤酵母，其特征在于，所述毕赤酵母的保藏编号为CCTCC NO：M2020817。