CN112697901B - 用于筛选抗热应激肉羊的血清代谢标志物及筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于筛选抗热应激肉羊的血清代谢物标志物及筛选方法和应用，属于畜牧生产和应用生物技术领域，本发明通过收集抗热应激肉羊和非抗热应激肉羊外周血样本，采用超高效液相色谱‑质谱技术，结合系统的生物信息学分析方法，从而对抗热应激和非抗应激肉羊血清样本中差异代谢物进行筛选。所述标志物为反式茴香醚，通过所述代谢物标志物以及检测该代谢标志物的试剂，可以筛选耐热肉羊，结果准确客观可靠，且无需提供其他组织样品，为耐热肉羊的筛选奠定基础，具有较好的推广价值。
Description
技术领域
本发明属于畜牧生产和应用生物技术领域，尤其涉及一种用于筛选抗热应激肉羊的血清代谢标志物及筛选方法和应用。
背景技术
羊肉肉质鲜美，具有性温热、补气滋阴、暖中补胃的效能，其营养价值日益受到消费者重视，这使得市场对羊肉的需求量持续增加。
随着羊肉市场需求量的增加以及对生态环境保护的日益重视，肉羊养殖业已由传统的以家庭为单位的散养逐步转化成集约化养殖。我国南方热带和亚热带地区，夏季温度可达38℃以上，且持续时间较长，高温条件下集约化养殖，极易造成肉羊热应激。热应激会降低肉羊干物质采食量、增加呼吸频率和心率、降低瘤胃微生物菌群丰度，最终降低营养物质消化率，影响生产性能，给南方肉羊养殖业带来较大损失。
代谢物是基因表达的终产物。代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，它直接将动物体液作为样品进行检测，借助高通量、高灵敏度与高精确度的现代分析技术对内源代谢物进行定量检测，挖掘整体代谢物及代谢物质的变化规律，寻找机体发生的生物学变化与代谢物变化的相对关系，反映机体变化的本质。因此，具有快速、准确、灵敏度高等特点。目前尚无筛选抗热应激肉羊生物标志物的相关报道，且血清的检测是无创的，非侵入的，因此如何通过研究肉羊血清代谢物，筛选抗热应激肉羊生物标志物并加以应用，对解决肉羊热应激，选育耐热肉羊新品种具有重要意义。
发明内容
本发明旨在于提供一种用于抗热应激肉羊筛选的血清代谢标志物及筛选方法和应用，以提供一种利用血清无创筛选抗热应激肉羊的方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供了一种用于筛选抗热应激肉羊的血清代谢标志物，所述血清代谢标志物为反式茴香醚。
本发明还提供了上述血清代谢标志物在筛选抗热应激肉羊中的应用，具体为：通过血清代谢标志物在肉羊血清样本中的浓度判断肉羊的抗热应激性，浓度越高，该肉羊具有抗热应激的概率越大，反之，非抗热应激的概率越大。
本发明还提供了利用上述血清代谢标志物筛选抗热应激肉羊的方法，步骤包括：
(1)以已知抗热应激肉羊或非抗热应激肉羊血液为标准供试品，以待测肉羊血液作为检测样品，经离心获取血清样本；
(2)检测血清样本中的反式茴香醚浓度；
(3)计算标准供试品反式茴香醚浓度平均值，作为参考水平，若检测样品相比较参考水平高，则检测样品具有比标准供试品更高的抗热应激概率，反之，具有比标准供试品更高的非抗热应激概率。
作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(2)中，采用超高效液相色谱-质谱联用分析方法检测血清样本中的反式茴香醚浓度，步骤包括：
步骤一：血清代谢物的提取
在血清样本中加入3倍体积提取液和内标，混匀后-20℃静置2h，4℃下4000转离心20min，取上清，获得血清代谢物；
步骤二：反式茴香醚标准品的制备
取反式茴香醚标准品溶解配置10nmol/L的标品储备液，取上述储备液配置混合标准液，梯度稀释得到校准溶液；
步骤三：样品质谱分析
用超高效液相色谱-质谱联用分析方法检测血清代谢物和校准溶液；
液相色谱条件：采用Waters 2D UPLC串联Q Exactive高分辨质谱仪来进行代谢物的分离和检测，所使用的色谱柱为BEH C18色谱柱，正离子模式流动相为含0.1％体积比甲酸的水溶液作为A液和含0.1％体积比甲酸的100％甲醇作为B液，负离子模式流动相为含10mM甲酸氨的水溶液作为A液和含10mM甲酸氨的95％甲醇作为B液，按体积百分比计，采用以下梯度进行洗脱：0～1min，2％B液；1～9min，2％～98％B液；9～12min，98％B液；12～12.1min,98％B液～2％B液；12.1～15min，2％B液。流速为0.35mL/min，柱温45℃，进样量为5μL。
质谱条件：利用Q Exactive质谱仪进行一级、二级质谱数据采集，质谱扫描质核比范围为70～1050，一级分辨率为70,000，AGC为3e6，最大注入时间为100ms。按照母离子强度，选择Top3进行碎裂，采集二级信息，二级分辨率为17,500，AGC为1e5，最大注入时间为50ms，碎裂能量设置为：20，40，60eV，离子源参数设置：鞘气流速为40，辅助气流速为10，喷雾电压正离子模式为3.80，负离子模式为3.20，离子传输管温度为320℃，辅助气加热温度为350℃；
步骤四：根据校准溶液的超高效液相色谱串联质谱检测结果绘制标准曲线图，根据标准曲线图计算得到待测样品中反式茴香醚含量数据。
作为本发明的进一步优化方案，所述提取液为由体积比为2:1的甲醇:CAN组成。
作为本发明的进一步优化方案，所述内标为茴香醚(Anethole)。
作为本发明的进一步优化方案，所述已知抗热应激肉羊为湖羊，非抗热应激肉羊为杜泊羊。
本发明的有益效果在于：
目前还没有指征抗热应激肉羊的血液标志物，本发明利用代谢组学数据，首次从血清代谢层次提出抗热应激肉羊的代谢标志物及筛选方法和应用，所述代谢标志物为反式茴香醚，利用反式茴香醚作为标志物进行检测，具有准确性高，灵敏度高(AUC大于0.800)的特点，可以直接作为抗热应激肉羊的评估指标。
附图说明
图1所示为抗热应激组(HS)和非抗热应激组(DS)血清中代谢谱PCA分类散点图，其中A为负离子模式下PCA图，B为正离子模式下PCA图。
图2为血清代谢物反式茴香醚在湖羊(HS)和杜泊羊(DS)的相对表达量柱状图。
图3为反式茴香醚标准品检测图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1血清中抗热应激相关代谢物的筛选
(1)血清样品采集：
收集热应激条件下6只抗热应激肉羊(HS，湖羊)和6只非抗热应激肉羊(DS,杜泊羊)血液置于不含肝素的负压管中，1500g离心15-20min后取上清液，上清液即为所需要的12个血清样品；血清样品储存于-80℃冰箱，备用。
(2)血清代谢物的提取
在上述12个血清样品中加入3倍体积提取液(甲醇：乙腈＝2:1，v:v，-20℃预冷)和内标(茴香醚)，混匀后-20℃静置2h，4℃下4000转离心20min,取上清置于上样瓶中，获得血清代谢物。
(3)样品质谱分析
对12个血清样本依次进行超高效液相色谱质谱联用分析，其实验条件如下：
液相色谱条件：采用Waters 2D UPLC(waters,USA)串联Q Exactive高分辨质谱仪(Thermo Fisher Scientific,USA)来进行代谢物的分离和检测。所使用的色谱柱为BEHC18色谱柱(1.7μm 2.1*100mm,Waters,USA)。正离子模式流动相为含0.1％体积比甲酸的水溶液(A液)和含0.1％体积比甲酸的100％甲醇(B液)，负离子模式流动相为含10mM甲酸氨的水溶液(A液)和含10mM甲酸氨的95％甲醇(B液)。按体积百分比计，采用以下梯度进行洗脱：0～1min，2％B液；1～9min，2％～98％B液；9～12min，98％B液；12～12.1min,98％B液～2％B液；12.1～15min，2％B液。流速为0.35mL/min，柱温45℃，进样量为5μL。
质谱条件：利用Q Exactive质谱仪(Thermo Fisher Scientific,USA)进行一级、二级质谱数据采集。质谱扫描质核比范围为70～1050，一级分辨率为70,000，AGC为3e6，最大注入时间(IT,injection time)为100ms。按照母离子强度，选择Top3进行碎裂，采集二级信息，二级分辨率为17,500，AGC为1e5，最大注入时间(IT,injection time)为50ms，碎裂能量(stepped nce)设置为：20，40，60eV。离子源(ESI)参数设置：鞘气流速(Sheath gas flowrate)为40，辅助气流速(Aux gas flow rate)为10，喷雾电压(Spray voltage(KV))正离子模式为3.80，负离子模式为3.20，离子传输管温度(Capillary temp)为320℃，辅助气加热温度(Aux gas heater temp)为350℃；最终得到12个样本总离子流图，即为血清代谢指纹图谱。
(4)多元变量统计分析，筛选生物标志物：
采用Compound Discoverer 3.0(Thermo Fisher Scientific,USA)对样品血清代谢指纹图谱数据进行峰提取、组内及组间的保留时间校正、加合离子合并、缺失值填充、背景峰标记以及代谢物鉴定，最后导出化合物分子量、保留时间、峰面积和鉴定结果等信息。根据非抗热应激和抗热应激动物谱图的差异性比较，应用SPSS统计软件采用多元统计分析(PCA)和单变量分析(差异变化倍数(Fold-Change,FC)和T检验(Student’s t test))相结合的方式筛选组间差异代谢物，这些代谢物可被认为是可能对抗热应激动物代谢产生影响的生物标志物。
结果发现，抗热应激组(HS)和非抗热应激组(DS)具有明显的区分度，主要沿横轴区分，抗热应激组(HS)样本主要聚集在右侧，非抗热应激组(DS)主要聚集在左侧(图1)。且抗热应激组相对非抗热应激组，血清代谢物中反式茴香醚(Trans-anethole)含量显著上升，预测反式茴香醚为一种与肉羊抗热应激相关的血清代谢物，以此利用反式茴香醚作为筛选抗热应激肉羊的血清代谢标志物来实现抗热应激肉羊的筛选。
上述标志物在抗热应激肉羊中的变化及对应的预测下面积(AUC)如下表1所示：
表1：血清代谢标志物的相关信息
| 代谢物 | 分子式 | 分子量 | 出峰时间 | 抗热应激浓度方向 | 差异倍数 | P值 | AUC |
| 反式茴香醚 | C<sub>10</sub>H<sub>12</sub>O | 148.089 | 8.578 | 高表达 | 2.17 | 0.0048 | 0.857 |
上述血清代谢标志物在非抗热应激和抗热应激肉羊血清中的详细变化柱状图如附图2所示，反式茴香醚在抗热应激肉羊中代谢物浓度显著上升。
实施例2
本实施例提供了以反式茴香醚为标志物进行抗热应激肉羊的筛选方法，步骤包括：
(1)抽取一种已知抗热应激肉羊或非抗热应激肉羊血液作为标准供试品，取待测肉羊血液作为检测样品，经离心获取血清样本，放入-80℃保存。
(2)检测血清样本中的反式茴香醚浓度；本实施例采用超高效液相色谱-质谱联用的定量分析方法，来获得反式茴香醚的表达量，详细步骤如下：
a)血清代谢物的提取：在上述血清样品中加入3倍体积提取液(甲醇：ACN＝2:1,v:v，-20℃预冷)和2种内标，混匀后-20℃静置2h，4℃，4000g离心20min,取上清置于上样瓶中。
b)取反式茴香醚标准品溶解配置10nmol/L的标品储备液，取上述储备液配置混合标准液，梯度稀释得到校准溶液，将反式茴香迷校准液2倍稀释后进行超高效液相色谱质谱联用监测分析。
c)超高效液相色谱质谱联用分析，具体液相色谱条件和质谱条件参照实施例1的步骤(3)，获得样品代谢物中反式茴香醚的浓度信息。
d)根据校准溶液的超高效液相色谱串联质谱检测结果绘制标准曲线图，根据标准曲线图计算得到待测样品中反式茴香醚含量数据。
图2展示反式茴香醚标准品检测结果图，横坐标表示出峰时间，纵坐标表示峰的高度，箭头所指位置为反式茴香醚出峰位置。
(3)以标准供试品反式茴香醚浓度平均值作为参考水平，将待测肉羊的反式茴香醚浓度与平均值进行比较，若高于平均值，说明该待测肉羊具有比标准供试品更高的抗热应激概率，反之，说明该待测肉羊具有比标准供试品更高的非抗热应激概率。
如本实施例2中，随机从实施例1中的6个非抗热应激肉羊中随机取3只个体，分别为受试a、受试b、受试c，它们的血清相对浓度分别为：11171.4、12931.1、8767.3。计算所有受试者的代谢物浓度平均值为10956.6，作为反式茴香醚在这一组受试羊中的参考水平。对于其中某一个受试羊如受试羊b，其反式茴香迷的浓度为12931.1，高于10956.6，即抗热应激肉羊血清这一代谢物浓度较高，推测受试b具有更高抗热应激的概率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种血清代谢标志物在筛选抗热应激肉羊中的应用，其特征在于，所述血清代谢标志物为反式茴香醚，采用超高效液相色谱-质谱联用分析方法检测肉羊血清样本中的反式茴香醚浓度从而应用于筛选抗热应激肉羊。
2.根据权利要求1所述的一种血清代谢标志物在筛选抗热应激肉羊中的应用，其特征在于，通过血清代谢标志物在肉羊血清样本中的浓度判断肉羊的抗热应激性，浓度越高，该肉羊具有抗热应激的概率越大，反之，具有非抗热应激的概率越大。
3.一种筛选抗热应激肉羊的方法，其特征在于，步骤包括：
(1)以已知抗热应激肉羊或非抗热应激肉羊血液为标准供试品，以待测肉羊血液作为检测样品，经离心获取血清样本；
(2)采用超高效液相色谱-质谱联用分析方法检测血清样本中的反式茴香醚浓度；
(3)计算标准供试品反式茴香醚浓度平均值，作为参考水平，若检测样品相比较参考水平高，则检测样品具有比标准供试品更高的抗热应激概率，反之，具有比标准供试品更高的非抗热应激概率。
4.根据权利要求3所述的一种筛选抗热应激肉羊的方法，其特征在于，超高效液相色谱-质谱联用分析方法的步骤包括：
步骤一：血清代谢物的提取
在血清样本中加入3倍体积提取液和内标，混匀后-20℃静置2h，4℃下4000转离心20min，取上清，获得血清代谢物；
步骤二：反式茴香醚标准品的制备
取反式茴香醚标准品溶解配置10nmol/L的标品储备液，取上述储备液配置混合标准液，梯度稀释得到校准溶液；
步骤三：样品质谱分析
用超高效液相色谱-质谱联用分析方法检测血清代谢物和校准溶液；
液相色谱条件：采用Waters 2D UPLC串联Q Exactive高分辨质谱仪来进行代谢物的分离和检测，所使用的色谱柱为BEH C18色谱柱，正离子模式流动相为含0.1％体积比甲酸的水溶液作为A液和含0.1％体积比甲酸的100％甲醇作为B液，负离子模式流动相为含10mM甲酸氨的水溶液作为A液和含10mM甲酸氨的95％甲醇作为B液，按体积百分比计，采用以下梯度进行洗脱：0～1min，2％B液；1～9min，2％～98％B液；9～12min，98％B液；12～12.1min,98％B液～2％B液；12.1～15min，2％B液，流速为0.35mL/min，柱温45℃，进样量为5μL；
质谱条件：利用Q Exactive质谱仪进行一级、二级质谱数据采集，质谱扫描质核比范围为70～1050，一级分辨率为70,000，AGC为3e6，最大注入时间为100ms；按照母离子强度，选择Top3进行碎裂，采集二级信息，二级分辨率为17,500，AGC为1e5，最大注入时间为50ms，碎裂能量设置为：20，40，60eV，离子源参数设置：鞘气流速为40，辅助气流速为10，喷雾电压正离子模式为3.80，负离子模式为3.20，离子传输管温度为320℃，辅助气加热温度为350℃；
步骤四：根据校准溶液的超高效液相色谱串联质谱检测结果绘制标准曲线图，根据标准曲线图计算得到待测样品中反式茴香醚含量数据。
5.根据权利要求4所述的一种筛选抗热应激肉羊的方法，其特征在于，所述提取液为由体积比为2:1的甲醇:CAN组成。
6.根据权利要求4所述的一种筛选抗热应激肉羊的方法，其特征在于，所述内标为茴香醚。
7.根据权利要求3所述的一种筛选抗热应激肉羊的方法，其特征在于，所述已知抗热应激肉羊为湖羊，非抗热应激肉羊为杜泊羊。
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