CN112694518A - 一种肾损伤分子-1(Kim-1)靶向多肽及其应用 - Google Patents
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- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
Abstract
本发明公开一种肾损伤分子‑1(Kim‑1)靶向多肽及其应用,属于生物医药领域。本发明公开的Kim‑1靶向多肽优选LTH,其氨基酸序列为:LTHVVWL;其特异性结合于损伤肾脏。基于所述靶向多肽LTH,本发明还提供了一种可靶向损伤肾脏的靶向递送系统。
Description
技术领域
本公开属于生物医药领域,具体涉及一种肾损伤分子-1(Kim-1)靶向多肽及其应用。
背景技术
肾损伤分子-1(Kidney injury molecule-1,Kim-1)是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白,由细胞外Ig样结构域、跨膜结构域和细胞内结构域构成。在健康肾脏中,Kim-1 几乎不表达;但是在各种原因导致的肾脏疾病中,Kim-1特异性高表达于损伤的肾小管上皮细胞,已成为多种肾脏病如急性肾损伤的早期诊断标志物。同时, Kim-1的肾脏特异性表达也提示,靶向Kim-1可以作为肾脏病精准治疗的有力策略。因此,本发明利用噬菌体展示技术筛选获得和Kim-1蛋白特异性结合的多肽,并确认靶向多肽和损伤肾脏的结合能力。此外,基于该靶向多肽,我们还提供了一种肾脏靶向递送系统。
近年来,细胞外囊泡作为天然稳定的递送载体,具有低免疫原性、无细胞毒性和较好的生物屏障通透性等优点,在疾病的诊断和治疗中具有广阔的应用前景。现有研究证实,细胞外囊泡可以作为小分子物质、核酸和蛋白质的有效载体。此外,将靶向肽、核酸适配体等连接到细胞外囊泡表面可以提高它们的器官/细胞靶向性。然而,特异性靶向损伤肾脏的方法仍然有限。本发明通过将开发的Kim-1靶向多肽修饰到红细胞来源的细胞外囊泡上,成功构建了肾脏靶向递送系统,为将来肾脏病的诊治提供新的途径。
发明内容
本公开的目的可以通过以下技术方案实现:
本发明的目的在于提供一种Kim-1靶向多肽,可与损伤肾脏高效、特异的结合,并基于该靶向多肽,开发一种肾脏靶向递送系统,为肾脏病的诊断或治疗提供新的策略。
本发明的技术方案如下:
本发明提供一种靶向多肽,包含选自SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或与上述任一序列具有至少80%同源性的序列,再优选为至少具有90%相同性,更优选为至少具有95%、96%、97%、 98%、99%的相同性。
本发明提供一种肾脏靶向递送系统,其特征在于,包括源自红细胞的细胞外囊泡和所述靶向多肽。
本发明还提供所述肾脏靶向递送系统的制备方法,包括以下步骤:
(1)从红细胞中分离提纯细胞外囊泡;
(2)使用点击化学的方法将所述靶向多肽加载到细胞外囊泡膜上形成肾脏靶向递送系统;所述靶向多肽优选SEQ ID NO.5的序列;
(3)将所述肾脏靶向递送系统应用于肾脏病。
本发明所述肾脏靶向递送系统在肾脏病中的应用,其特征在于,肾脏靶向递送系统负载的药物为靶向P65和Snai1基因的siRNA分子。优选地,所述siRNA 分子的序列为:
P65 siRNA:正义链:5’-GGAGUACCCUGAAGCUAUATT-3’
反义链:5’-UAUAGCUUCAGGGUACUCCTT-3’
Snai1 siRNA:正义链:5’-GGAAGAUCUUCAACUGCAATT-3’
反义链:5’-UUGCAGUUGAAGAUCUUCCTT-3’
本发明所述的负载siRNA分子的肾脏靶向递送系统应用于制备改善肾脏炎症和纤维化的药物或制剂。
本发明所述的靶向多肽在制备诊断或治疗肾脏病的药物或制剂中的应用。
本发明所述的肾脏靶向递送系统在制备诊断或治疗肾脏病的药物或制剂中的应用。
本发明的有益成果:
1、本发明首次提供了高效、特异的Kim-1靶向多肽,且由于Kim-1蛋白在多种原因引起的肾脏病中均高表达,因此本发明提供的靶向多肽具有较广的应用范围;
2、本发明提供的肾脏靶向递送系统可以特异性靶向损伤肾脏,且细胞外囊泡可以作为小分子药物、基因类药物和蛋白质类药物的递送载体,在肾脏病的靶向治疗中具有非常可观的应用前景;
3、本发明的制备方法简单、易操作、反应效率高,红细胞数量充足、来源广泛,可以进行规模化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本公开实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Kim-1靶向多肽与Kim-1蛋白的结合力验证结果图;
图2为Kim-1靶向多肽与损伤肾脏的结合力验证结果图;
图3为肾脏靶向递送系统的鉴定结果图:(A)未经修饰的细胞外囊泡(REV) 和连接有选自SEQ ID NO.5靶向多肽(命名为LTH)的细胞外囊泡(REVLTH) 的粒径分布图;透射电镜观察REVLTH的形态;(B)Western blot检测REV和 REVLTH上细胞外囊泡和红细胞的标志蛋白;(B)免疫荧光检测靶向多肽LTH 与REV的共定位情况;
图4为肾脏靶向递送系统与损伤肾脏的结合力验证结果图:(A)肾脏离体成像;(B)免疫荧光检测REVLTH与Kim-1阳性肾小管的共定位情况;
图5为肾脏靶向递送系统负载siRNA分子的鉴定结果图:(A)负载siRNA 分子REVLTH的粒径分布图和透射电镜图;(B)siRNA分子加载效率;
图6为负载siRNA分子的肾脏靶向递送系统治疗急性肾损伤的结果图:(A) HE染色观察肾脏病理改变;(B)RT-PCR检测肾组织中促炎因子和促纤维化因子的mRNA水平。
具体实施方式
下面将结合本公开实施例中的附图,对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本公开中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本公开保护的范围。
实施例1 Kim-1靶向多肽的筛选与验证
1、Kim-1靶向多肽的筛选
实验步骤如下:
(1)体外重组的Kim-1蛋白按40μg包被到ELISA板中,4℃包被过夜;
(2)用含0.05%Tween的PBS洗3次,洗去多余抗原;
(3)加入5%BSA封闭液,30℃封闭2小时;
(4)吸去封闭液,加入噬菌体随机展示文库(1011pfu),37℃孵育2小时;
(5)用含0.05%Tween的PBS洗5次,洗去未结合的噬菌体;
(6)加入Glycine-HCl缓冲液(pH 2.2)洗脱结合的噬菌体,然后加入Tris-HCl 缓冲液(pH 9.1)中和;
(7)对洗脱物进行滴度测定,并用Escherichia coli TG1进行扩增;
(8)按上述方法利用上轮淘选回收扩增所得的噬菌体产物反复对Kim-1蛋白进行淘选;
(9)在进行五轮淘选后,利用多克隆噬菌体ELISA验证每轮淘选获得的噬菌体产物与Kim-1的结合力;
(10)分别挑选96个来自第二轮和第四轮淘选获得的单克隆噬菌体,进行单克隆噬菌体ELISA验证其与Kim-1的结合力;
(11)挑选结合力最高的5个单克隆噬菌体进行二代测序,其氨基酸序列如SEQ IDNO.1-NO.5所示。
2、候选Kim-1靶向多肽与Kim-1蛋白结合力测试
(1)用RIPA裂解液裂解缺血再灌注损伤后的肾组织备用;
(2)由强耀生物科技有限公司合成带有组氨酸(H6)标签的Kim-1靶向多肽和对照肽Scramble(Scrbl);
(3)分别将100μg带有组氨酸标签的Kim-1靶向多肽与镍磁珠(苏州海狸生物医学工程有限公司)在4℃孵育2小时,使Kim-1靶向多肽连接到镍磁珠上;
(4)用Washing buffer[20mM Phosphate Buffer,500mM NaCl,and 75mMimidazole(pH 7.4)]清洗3次去除未结合的多肽;
(5)将300μg肾组织裂解液与上步获得的镍磁珠在4℃孵育1小时;
(6)用Washing buffer[20mM Phosphate Buffer,500mM NaCl,75mM imidazole(pH 7.4)]清洗3次去除多余的肾组织裂解液;
(7)用Elution buffer[20mM Phosphate Buffer,500mM NaCl,500mM imidazole(pH 7.4)]洗脱镍磁珠上结合的蛋白;
(8)用Western blot检测上步洗脱下来的蛋白中Kim-1的含量;
结果见图1,相比于对照肽Scrbl,5条候选多肽均可以结合肾组织中的Kim-1 蛋白;其中,候选多肽LTH结合的Kim-1蛋白最多,提示其与Kim-1的结合力最强。
3、候选Kim-1靶向多肽靶向损伤肾脏的能力测试
小鼠行单侧(右侧)肾脏缺血再灌注手术,肾脏缺血时间为35分钟;在肾脏再灌注后,通过尾静脉注射25mg/kg的带有FITC标记的Kim-1靶向多肽;注射6小时后处死小鼠,留取肾脏进行荧光成像(IVIS Spectrum imaging system, PerkinElmer)。结果见图2,相较于健康肾脏,候选多肽LTI、MFP、IQP、LTH 均可与损伤肾脏高效结合;其中,候选多肽LTH与损伤肾脏结合的效率最高,提示候选多肽LTH可高效、特异的靶向损伤肾脏。
实施例2肾脏靶向递送系统的构建与鉴定
1、红细胞源细胞外囊泡的提取
(1)收集小鼠血液加入含有抗凝剂ACD(1.32%柠檬酸钠,0.48%柠檬酸, 1.47%葡萄糖)的无菌离心管中,并用等量PBS稀释血液;
(2)将稀释后的血液缓慢加入含有相同体积的Ficoll-Paque(GE Healthcare) 分离液中,于500g、4℃离心30min;
(3)小心留取最下层的红细胞,PBS清洗3次后用PBS重悬于无菌离心管中;
(4)加入10μmol/L的钙离子载体(Abcam),于4℃、上下摇摆摇床上处理48小时。
(5)通过超速离心法提取细胞外囊泡:于4℃、2000g离心20分钟以去除红细胞;小心将上清转移到新的无菌离心管中,于4℃、10000g离心30分钟以去除小细胞碎片;小心将上清转移到无菌离心管中(TY70Ti rotor,Beckman),于4℃、100000g离心2小时获得沉淀;再用PBS重悬清洗一次,于4℃、100000g 离心2小时获得沉淀即为细胞外囊泡,PBS重悬用于后续实验。
2、靶向多肽LTH的加载
(1)在1mg/mL的细胞外囊泡中加入10μmol/L DBCO-sulfo-NHS (Sigma),于旋转混匀仪上室温反应4小时,使DBCO连接到细胞外囊泡表面的氨基上;
(2)将上步溶液加入100kD超滤管,5000g离心15分钟,弃去下层溶液,在上层加入适量PBS重复超滤一次,以去除未结合的DBCO-sulfo-NHS;
(3)用1mL PBS重悬上步所得的连接有DBCO的细胞外囊泡,每1mg/mL 的细胞外囊泡中加入2μmol/L叠氮基修饰的靶向多肽LTH,于旋转混匀仪上在 4℃反应12小时;
(4)重复上述步骤(2)后,于4℃、100000g离心2小时获得沉淀,即为连接有靶向多肽LTH的细胞外囊泡,即为我们构建的肾脏靶向递送系统,PBS 重悬用于后续实验和鉴定。
3、肾脏靶向递送系统的鉴定
(1)粒径检测:将上述未经修饰的细胞外囊泡(REV)和连接有靶向多肽 LTH的细胞外囊泡(REVLTH)重悬液送上海逍鹏生物科技有限公司检测粒径分布,所用仪器是德国PMX纳米颗粒跟踪分析仪Zetaview。结果见图3A,LTH 修饰增加了REV的直径,最高峰在118nm左右。
(2)形态检测:通过透射电镜观察REVLTH的形态,用移液枪将所制备的 REVLTH重悬液充分吹打均匀,吸取10μL到200目的载样铜网上,室温静止1 小时,用滤纸小心吸掉多余液体,干燥后于透射电镜成像拍照。结果见图3A,可见双层膜和杯状结构,符合细胞外囊泡的形态特征。
(3)标志物检测:通过Western blot检测细胞外囊泡的表面标志蛋白,结果见图3B,所制备的REV和REVLTH表达囊泡标志物Alix、CD63和CD81,也表达红细胞标志物血红蛋白A(Hb),证明其是来源于红细胞的细胞外囊泡。
(4)进一步地,为了证明靶向多肽LTH成功加载到REV上,将REV用 PKH26(红色荧光)标记、LTH用FITC标记(绿色荧光)后用共聚焦显微镜观察,结果见图3C,REV与LTH存在明显的共定位(黄色荧光),证明REVLTH的构建成功。
实施例3肾脏靶向递送系统靶向损伤肾脏的能力测试
小鼠行单侧(右侧)肾脏缺血再灌注手术,肾脏缺血时间为35分钟;在肾脏再灌注后,通过尾静脉分别注射200μg的REVLTH或REVScrbl作为对照(靶向多肽LTH和对照肽Scrbl均用FITC标记);注射12小时后处死小鼠,留取肾脏进行荧光成像(IVIS Spectrum imagingsystem,PerkinElmer)和免疫荧光检测。结果见图4,相较于对照REVScrbl,REVLTH在损伤肾脏中的积聚增加了4倍,提示REVLTH可以有效的靶向损伤肾脏;此外,REVLTH可以特异性的靶向Kim-1 阳性的肾小管。
实施例4肾脏靶向递送系统负载siRNA分子治疗急性肾损伤
1、siRNA分子的加载和鉴定
(1)靶向P65和Snai1的siRNA分子进行胆固醇和2’-甲氧修饰,序列如下:
P65 siRNA:正义链:5’-GGAGUACCCUGAAGCUAUATT-3’
反义链:5’-UAUAGCUUCAGGGUACUCCTT-3’
Snai1 siRNA:正义链:5’-GGAAGAUCUUCAACUGCAATT-3’
反义链:5’-UUGCAGUUGAAGAUCUUCCTT-3’
(2)在2个无酶、无菌EP管中分别用100μL无RNA酶PBS重悬100μ g的REVLTH,然后分别加入10μg的P65 siRNA(siP65)和10μg的Snai1 siRNA (siSnai1)混匀,于37℃孵育90分钟;
(3)于4℃、100000g离心2小时获得沉淀;再用PBS重悬清洗一次,于 4℃、100000g离心2小时获得沉淀即为负载siRNA分子的REVLTH;
(4)REVLTH-siP65和REVLTH-siSnai1的鉴定:
①粒径和形态检测:按上述实施例2中的方法,分别对REVLTH-siP65和 REVLTH-siSnai1进行粒径和形态检测,结果见图5A,siP65和siSnai1的加载对 REVLTH的粒径分布和形态没有明显影响;
②siRNA分子加载效率检测:为评估siRNA分子的加载效率,siP65和siSnai1 均用荧光素Cy3进行标记,其他加载步骤如上,通过荧光强度的测定推算加载效率。结果见图5B,约73.3%siP65和72.7%siSnai1成功加载到REVLTH上。
2、REVLTH-siP65和REVLTH-siSnai1联合治疗急性肾损伤
小鼠行双侧肾脏缺血再灌注手术,肾脏缺血时间为35分钟;在肾脏再灌注后,siP65/siSnai1联合治疗组小鼠即通过尾静脉注射含有10μg siP65的 REVLTH-siP65和含有10μg siSnai1的REVLTH-siSnai1;siScrbl组小鼠则注射含有 10μg对照siRNA的REVLTH-siScrbl,每隔24小时治疗一次,共5次。Sham组和I/R组通过尾静脉注射相同体积的生理盐水。所有小鼠在造模后5天处死。
通过HE染色观察肾脏病理改变,结果见图6A,siP65/siSnai1联合治疗能显著改善缺血再灌注诱导的急性肾损伤。
通过RT-PCR检测肾组织中炎症因子TNF-α、IL-6、CCL-2和纤维化因子Vimentin、ACTA2、COL1A1的mRNA水平,结果见图6B,siP65/siSnai1联合治疗能抑制促炎因子和促纤维化因子的表达。
本实施例结果说明,本发明所制备的肾脏靶向递送系统可以用于递送siRNA 分子,并且REVLTH-siP65和REVLTH-siSnai1联合治疗可以有效治疗急性肾损伤,抑制肾脏炎症和纤维化。
实施例5靶向多肽LTH与siRNA分子组装在肾脏病中的应用方法
以20:1的摩尔比将1000nM的LTH多肽和50nM的P65 siRNA分别溶于 Opti-MEM培养基中;将P65 siRNA溶液加入LTH多肽溶液中混合均匀,室温静置40分钟形成多肽LTH/P65siRNA组装体用于肾脏病抗炎治疗。
统计学分析
统计数据以平均值±标准误的形式给出,SPSS 13.0统计软件处理数据,组件比较采用单因素方差分析,两组比较采用t检验,p<0.05为具有显著差异。实验结果均重复3次以上。
工作原理:
提供一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5的Kim-1靶向多肽,与损伤肾脏高效、特异的结合,并基于该靶向多肽,开发一种肾脏靶向递送系统,为肾脏病的诊断或治疗提供新的策略。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本公开的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上显示和描述了本公开的基本原理、主要特征和本公开的优点。本行业的技术人员应该了解,本公开不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本公开的原理,在不脱离本公开精神和范围的前提下,本公开还会有各种变化和改进,这些变化和改进都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种肾损伤分子-1(Kim-1)靶向多肽及其应用
<141> 2020-11-20
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 1
Leu Thr Ile Tyr Ser His Asp
1 5
<210> 2
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Met Ser Thr Pro Leu Leu Gly
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 3
Met Phe Pro Ser Ser Phe Leu
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 4
Ile Gln Pro Phe Trp Val Ile
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Leu Thr His Val Val Trp Leu
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工合成
<220>
<223> P65 siRNA 正义链
<400> 6
ggaguacccu gaagcuaua 19
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工合成
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<223> P65 siRNA 反义链
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uauagcuuca ggguacucc 19
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工合成
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<223> Snai1 siRNA反义链
<400> 9
uugcaguuga agaucuucc 19
Claims (7)
1.一种靶向多肽,包含选自SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或与上述任一序列具有至少80%同源性的序列。
2.一种肾脏靶向递送系统,其特征在于,包括源自红细胞的细胞外囊泡和权利要求1的靶向多肽。
3.根据权利要求2所述的肾脏靶向递送系统,其特征在于,所述肾脏靶向递送系统的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)从红细胞中分离提纯细胞外囊泡;
(2)使用点击化学的方法将权利要求1的靶向多肽加载到细胞外囊泡膜上形成肾脏靶向递送系统;
4.根据权利要求3所述的肾脏靶向递送系统的应用,其特征在于,肾脏靶向递送系统负载的药物为靶向P65和Snai1基因的siRNA分子。优选地,所述siRNA分子的序列为:
P65 siRNA:正义链:5’-GGAGUACCCUGAAGCUAUATT-3’
反义链:5’-UAUAGCUUCAGGGUACUCCTT-3’
Snai1 siRNA:正义链:5’-GGAAGAUCUUCAACUGCAATT-3’
反义链:5’-UUGCAGUUGAAGAUCUUCCTT-3’
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,负载siRNA分子的肾脏靶向递送系统应用于制备改善肾脏炎症和纤维化的药物或制剂。
6.一种诊断或治疗肾脏病的药物或制剂中含有权利要求1所述的靶向多肽。
7.一种诊断或治疗肾脏病的药物或制剂中含有权利要求2所述的靶向递送系统。
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CN115404212A (zh) * | 2022-08-18 | 2022-11-29 | 三峡大学 | 小粒径纳米细胞膜囊泡、制备方法、组合物及试剂盒 |
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CN108084268A (zh) * | 2017-03-14 | 2018-05-29 | 武汉尚智堂生物科技有限公司 | 一种肾脏靶向性小核酸递送多肽 |
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