CN112690208A - 一种在裙带菜中构建双单倍体(dh)孢子体群体的方法 - Google Patents

一种在裙带菜中构建双单倍体(dh)孢子体群体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及遗传育种，具体的说是一种在裙带菜中构建双单倍体(Doubled haploid,DH)孢子体群体的方法，再进一步的说是利用孤雌生殖和雌雄同体配子体自交获得裙带菜DH孢子体群体的方法。选择具有孤雌生殖能力的雌性配子体克隆及可以产生雌雄同体现象的雄性配子体克隆，将二者进行杂交产生F1孢子体，待其成熟后选择一株释放游孢子，分离获得大量的F2配子体克隆；选择其中的雌性配子体克隆，通过诱导孤雌生殖现象的发生获得雌性DH孢子体株系，选择其中的雄性配子体克隆，通过诱导雌雄同体现象的发生并自交获得雄性DH孢子体株系，从而获得DH孢子体群体。本发明构建的DH群体对于在重要经济褐藻裙带菜中开展基础遗传学研究及新品种培育等具有重要意义。

Description

一种在裙带菜中构建双单倍体(DH)孢子体群体的方法
技术领域
本发明涉及遗传育种，具体的说是一种在裙带菜中构建DH孢子体群体的方法，再进一步的说是一种利用孤雌生殖和雌雄同体配子体自交获得裙带菜DH孢子体群体的方法。
背景技术
裙带菜是我国重要的经济褐藻。它隶属于海带目，具有典型的海带目褐藻的生活史。裙带菜重要的农学性状大多为数量性状，开展遗传育种研究需要对数量性状的遗传学基础进行解析。作图群体的构建是进行数量性状遗传研究的前提之一，但是目前在裙带菜乃至整个海带目褐藻中的作图群体基本为临时性的普通F2群体，不能长期保存，难以在不同时间和地点开展重复性研究，无法评估环境因素对数量性状的影响，使得很多重要的遗传学研究无法开展。
在陆地高等植物中，永久性作图群体主要包括重组自交系和DH群体。重组自交系的构建通常至少要花费6代以上的时间，人力和时间成本较高。DH群体则主要通过花药或花粉培养获得，虽然成功率较低，但由于经过一代即可获得完全纯合的DH株系，因此大幅缩短了育种进程，提高了育种效率。DH群体在高等植物的遗传学和遗传育种研究中应用广泛，由于各海藻物种的生活史存在差异，虽然在经济红藻紫菜中也已得以建立并应用，但在褐藻中尚未见DH群体的报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种在裙带菜中构建DH孢子体群体的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种在裙带菜中构建DH孢子体群体的方法，参见图1，选择具有孤雌生殖能力的F1雌性配子体克隆与可以产生雌雄同体现象的F1雄性配子体克隆进行杂交产生F1孢子体，待其成熟后从释放的游孢子中分离获得F2配子体克隆群体；将F2配子体克隆群体中的雌性配子体克隆，通过诱导孤雌生殖现象的发生获得雌性DH孢子体株系，将F2配子体克隆群体中的雄性配子体克隆，通过诱导雌雄同体现象的发生并自交获得雄性DH孢子体株系，从而获得DH孢子体群体。
进一步的说：
1)选择具有孤雌生殖能力的F1雌性配子体克隆与可以产生雌雄同体现象的F1雄性配子体克隆，按质量比为1:1混合进行杂交产生F1孢子体，，待其成熟后选择一株释放游孢子，分离获得大量的F2配子体克隆；
2)从上述F2配子体克隆中随机选择雌性配子体克隆，通过诱导孤雌生殖现象的发生获得雌性DH孢子体株系，随机选择雄性配子体克隆，通过诱导雌雄同体现象的发生并自交获得雄性DH孢子体株系，从而获得DH孢子体群体。
所述获得的DH孢子体群体可利用微卫星(SSR)标记对群体内的株系进行亲权和纯合度鉴定，可利用流式细胞仪对株系的染色体倍性进行鉴定，确保群体构建的准确性。
按照图1所示，选择的具有孤雌生殖能力的F1雌性配子体克隆在排放卵子后，可通过孤雌生殖形成雌性的DH孢子体(孢子体母本)；选择的F1雄性配子体克隆可发生雌雄同体现象并通过自交形成雄性的DH孢子体(孢子体父本)。
所述步骤2)F2配子体克隆中的雌性个体均能发生孤雌生殖现象，雄性个体均能发生雌雄同体现象，分别获得雌性和雄性DH株系，从而建立DH群体。
所述步骤1)F1雌、雄配子体克隆进行杂交并完成F1孢子体生活史过程为：
将F1雌、雄配子体在PES海水培养基中以温度18-20℃，光照强度50－80μmolphotons m-2s-1，光周期12h白天：12h黑夜；静止培养至幼孢子体达到1mm；并每3-5天更换一次PES海水培养基，
将培养至1mm的幼孢子体在PES海水培养基中，以温度18-20℃,光照强度50－80μmol photons m-2s-1，光周期12h白天：12h黑夜，并充入空气的条件下培养至幼孢子体长度达到1cm，并每2-3天更换一次PES海水培养基；
培养至1cm的幼孢子体在4-18℃，于自然海水中充入空气通过翻滚培养(翻滚培养方式请参考Pang,S.J.,Liu,F.,Shan,T.F.,Gao,S.Q.and Zhang,Z.H.2009.Cultivationof the brown alga Sargassumhorneri:sexual reproduction and seedlingproduction in tank culture under reduced solar irradiance in ambienttemperature.J.Appl.Phycol.21:413-22.)，进而完成孢子体的生活史，形成成熟的孢子体；并每天更新一次自然海水，所述自然海水中添加终浓度为2.5mgL-1的NaNO3和终浓度为0.25mgL-1的KH2PO4。
所述步骤2)F2雌性、雄性配子体克隆分别发生孤雌生殖和雌雄同体现象发生并产生DH孢子体株系的过程为：
将F2雌、雄配子体克隆分别单独在PES海水培养基中以温度15-20℃，光照强度50－80μmol photons m-2s-1，光周期12h白天：12h黑夜；静止培养至幼孢子体达到1mm；并每3-5天更换一次PES海水培养基；之后的孢子体培养过程与步骤1)的F1孢子体的培养过程一致。
上述孢子体的培养在实际遗传学分析的应用中，可根据研究目的在室内或海上将DH群体养至成熟或性状稳定。
所述PES培养基为每1L消毒海水中添加20mL制备液；其中，制备液为每1L蒸馏水中加入NaNO3 3.5g、KH2PO4 0.5g、铁金属液250mL和金属液250mL；经溶解消毒，冷却待用；铁金属液为，每1L蒸馏水中加入Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.702g和Na2EDTA 0.6g；金属液为，每1L蒸馏水中加入Na2EDTA 1g，H3BO3 1.14g，FeCl3·6H2O 49mg，MnSO4·H2O 164mg，ZnSO4·7H2O22mg和CoSO4·7H2O 4.8mg。
所述F1和F2雌或雄性配子体克隆长期保存的条件为温度18-20℃,光照强度3－5μmol photons m-2s-1，光周期12h白天：12h黑夜；并每2个月更换一次PES海水培养基。
一种在裙带菜中构建DH孢子体群体的方法的应用，所述获得的DH孢子体群体是永久性遗传作图群体，可应用于遗传连锁图谱构建和数量性状定位的研究中。
本发明所具有的优点：
本发明充分利用裙带菜独特的生活史特点，提供一套构建DH孢子体群体的方法；进一步的说本发明的构建方法仅需2代便可获得DH群体，该群体每个株系内所有个体的基因型一致而且完全纯合，因此可以长久繁衍而保持基因型不会发生改变，是一种理想的永久性遗传群体。适用于在不同时间和地点开展数量性状的定位研究，评估环境因素对数量性状的影响。具体为：
1.本发明构建DH孢子体群体过程中，充分利用孤雌生殖现象及在裙带菜配子体中发现的独特的雌雄同体现象来获得纯合的DH孢子体，该群体每个株系内的所有个体基因型完全相同而且纯合，其后代的基因型保持不变，因此可以长期保存。
2.本发明构建DH孢子体群体的过程中，F1雌、雄配子体克隆可以长期保存，并且可以分别通过孤雌生殖和雌雄同体自交获得亲本DH孢子体。因此在该培养体系中，DH亲本孢子体、F1孢子体及F2DH孢子体均为永久性的，这些宝贵的材料对于开展数量性状遗传研究具有重要意义。
3.本发明构建的DH孢子体群体每个杂交株系内所有个体的基因型完全一致，在进行数量性状分析时可以取株系内个体的平均值，从而使分析的准确性显著高于临时性作图群体。
4.本发明构建DH孢子体群体每个株系内的个体完全纯合，不存在显性效应，因此更利于数量性状遗传的研究。
5.本发明仅需2代便可构建完全纯合的DH株系，大大缩短了育种周期。开展育种工作时，可直接对DH株系进行选择，也可将DH株系作为亲本进行杂交，对杂交子一代进行选择，因此对开展裙带菜遗传育种具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例提供的获得DH群体的流程图。
图2a为本发明实施例提供的作为参考的单倍配子体的染色体倍性(n)检测图；
图2b为本发明实施例提供的通过雌雄同体自交获得的F2纯合孢子体的染色体倍性(2n)检测图；
图2c为本发明实施例提供的通过孤雌生殖获得的F2纯合孢子体的染色体倍性(2n)检测图；
由图2并结合SSR的分析结果(表1)可见本发明获得F2孢子体为纯合二倍体，即DH孢子体。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明选择具有孤雌生殖能力的F1雌性配子体克隆及可以产生雌雄同体现象的F1雄性配子体克隆，将二者进行杂交产生F1孢子体，待其成熟后选择一株释放游孢子，分离获得大量的F2配子体克隆；选择其中的雌性配子体克隆，通过诱导孤雌生殖现象的发生获得雌性DH孢子体株系，选择其中的雄性配子体克隆，通过诱导雌雄同体现象的发生并自交获得雄性DH孢子体株系，从而获得DH孢子体群体。利用SSR标记对群体内的株系进行亲权和纯合度鉴定，利用流式细胞仪对株系的染色体倍性进行鉴定，确保群体构建的准确性。按照此方法获得的每个DH株系内所有个体的基因型完全一致而且纯合，可以累代繁殖而保持基因型不变，从而可以在不同的时间和地点获得基因型完全相同的DH孢子体株系，因此该群体是一种永久性遗传群体。本发明提出了利用配子体的孤雌生殖和雌雄同体现象构建DH群体的方法。该方法可以在2年内完成DH群体的构建，对于在裙带菜中开展遗传学研究及新品种培育等具有重要意义。该方法同样适用于具有相同生活史特点的其他海带目褐藻。
下述实施例中所述PES培养基为每1L消毒海水中添加20mL制备液；其中，制备液为每1L蒸馏水中加入NaNO3 3.5g、KH2PO4 0.5g、铁金属液250mL和金属液250mL；经溶解消毒，冷却待用；铁金属液为，每1L蒸馏水中加入Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.702g和Na2EDTA 0.6g；金属液为，每1L蒸馏水中加入Na2EDTA 1g，H3BO3 1.14g，FeCl3·6H2O 49mg，MnSO4·H2O164mg，ZnSO4·7H2O 22mg和CoSO4·7H2O 4.8mg。
所述F1和F2雌或雄性配子体克隆长期保存的条件为温度18-20℃,光照强度3－5μmol photons m-2s-1，光周期12h白天：12h黑夜；并每2个月更换一次PES海水培养基。
实施例1
如图1所示，选择具有孤雌生殖能力的F1雌性配子体克隆及可以产生雌雄同体现象的F1雄性配子体克隆，对所选择的配子体克隆的10个SSR位点的遗传亲缘关系分析显示雌、雄配子体克隆在8个位点具有不同的等位基因(80％的差异度)，表明二者的基因型差异明显，适合作为群体构建的亲本。将雌、雄配子体克隆按1：1的质量比混合，混合后进行杂交获得F1杂交孢子体；杂交过程为雌、雄配子体克隆混合后在PES海水培养基中以温度18℃，光照强度50μmol photons m-2s-1，光周期12h白天：12h黑夜；并每3天更换一次培养基的条件下静止培养30天，产生的F1孢子体达到1mm以上，转到2L烧杯中，再以温度18℃,光照强度50μmol photons m-2s-1，光周期12h白天：12h黑夜；并每3天更换一次PES海水培养基及持续充入普通空气的条件下培养至幼孢子体长度达到1cm；将长度达到1cm的幼孢子体再转到80L玻璃水箱利用自然海水作为培养体系并充入空气进行翻滚培养(翻滚培养方式请参考Pang,S.J.,Liu,F.,Shan,T.F.,Gao,S.Q.and Zhang,Z.H.2009.Cultivation of thebrown alga Sargassum horneri:sexual reproduction and seedling production intank culture under reduced solar irradiance in ambienttemperature.J.Appl.Phycol.21:413-22.)，并在培养体系的自然海水中添加终浓度2.5mgL-1的NaNO3和0.25mgL-1的KH2PO4，且每2天更新一次添加终浓度2.5mgL-1的NaNO3和0.25mgL-1的KH2PO4的自然海水，水温的季节变化范围为4-18℃，完成F1杂交孢子体的生活史，形成成熟的孢子体。
待上述F1孢子体成熟，随机选择一株，将孢子叶割下，用消毒纱布反复擦拭孢子叶表面，除去表面附着的杂藻，阴干30－60min，将孢子叶放入经消毒的海水中释放获得游孢子，然后将游孢子接种到含有PES海水培养基的培养皿中，使附着的孢子密度在1个/cm2以下。在光强50μmol photons m-2s-1，水温18－22℃，光周期12h白天：12h黑夜条件下培养10d，萌发的游孢子全部发育成配子体并充分生长，之后降低光强至5μmol photons m-2s-1，使其保持营养生长状态直到形成肉眼可见的F2配子体克隆。在显微镜下从其中逐个辨别每个克隆的性别，并将其逐个转移到50ml离心管中保存。共保存雌、雄配子体克隆各260株。
随机选取F2雌、雄配子体克隆各100株，其中，F2雄配子体克隆进行雌雄同体自交获得F2纯合孢子体，即雄性DH孢子体株系(参见图2b)，F2雌配子体克隆进行孤雌生殖获得F2纯合孢子体，即雌性DH孢子体株系(参见图2c)，从而获得DH孢子体群体,具体分别单独在PES海水培养基中以温度18-20℃，光照强度50－80μmol photons m-2s-1，光周期12h白天：12h黑夜；静止培养至幼孢子体超过1mm；并每3-5天更换一次PES海水培养基；
由上述图2可见，与单倍的F1配子体克隆(参见图2a)相比，F2雄性孢子体株系和雌性孢子体株系的倍性是其2倍(参见图2b和2c)，因此证明它们是二倍体。
从上述培养至1mm以上的各幼孢子体中再随机选择雌、雄各10个株系，在PES海水培养基中，以温度18-20℃,光照强度50－80μmol photons m-2s-1，光周期12h白天：12h黑夜，并充入空气的条件下培养至幼孢子体长度超过5cm，并每2-3天更换一次PES海水培养基；在本实施例中，孢子体的培养到此结束。在实际遗传学分析的应用中，可根据研究目的在室内或海上将DH群体养至成熟。
从每个株系中随机选择4个个体，分别用10个多态性SSR标记对其进行纯合度和亲权鉴定(SSR分析的方法请参考Shan et al.2018.Assessment of the geneticconnectivity between farmed and wild populations of Undaria pinnatifida(Phaeophyceae)in a representative traditional farming region of China byusing newly developed microsatellite markers.J Appl Phycol30:2707-2714.文献中的记载)(参见表1)。表1的遗传分型结果显示所有被检测株系内的随机4个个体均确实来自于其对应的亲本配子体克隆，并且均为纯合体且基因型一致，从而证明所构建的DH孢子体群体是准确的。
表1为从F2孢子体群体中随机挑选的雌、雄各10个株系及其亲本配子体的SSR分型结果。
Figure BDA0002845627980000061
Figure BDA0002845627980000071
注：SSR位点1-10依次为UPN1528,3197,5085,5354,5463,5577,5613,7150,9919,10532。MGP和FGP分别为F1雄性和雌性配子体克隆，F1S为杂交F1孢子体，ML1-10与FL1-10分别为随机挑选的10个雄性和10个雌性F2孢子体株系(即DH株系)。表格中各株系记载的数值均为该株系4个个体定的数值。

Claims (9)

1.一种在裙带菜中构建DH孢子体群体的方法，其特征在于：选择具有孤雌生殖能力的F1雌性配子体克隆与可以产生雌雄同体现象的F1雄性配子体克隆进行杂交产生F1孢子体，待其成熟后从释放的游孢子中分离获得F2配子体克隆群体；将F2配子体克隆群体中的雌性配子体克隆，通过诱导孤雌生殖现象的发生获得雌性DH孢子体株系，将F2配子体克隆群体中的雄性配子体克隆，通过诱导雌雄同体现象的发生并自交获得雄性DH孢子体株系，从而获得DH孢子体群体。
2.按权利要求1在裙带菜中构建DH孢子体群体的方法，其特征在于：
1)选择具有孤雌生殖能力的F1雌性配子体克隆与可以产生雌雄同体现象的F1雄性配子体克隆按质量比为1:1混合进行杂交产生F1孢子体，待其成熟后选择一株释放游孢子，分离获得大量的F2配子体克隆；
2)从上述F2配子体克隆中随机选择雌性配子体克隆，通过诱导孤雌生殖现象的发生获得雌性DH孢子体株系，随机选择雄性配子体克隆，通过诱导雌雄同体现象的发生并自交获得雄性DH孢子体株系，从而获得DH孢子体群体。
3.按权利要求2所述的在裙带菜中构建DH孢子体群体的方法，其特征在于：所述选择的具有孤雌生殖能力的F1雌性配子体克隆在排放卵子后，可通过孤雌生殖形成雌性的DH孢子体(孢子体母本)；选择的F1雄性配子体克隆可发生雌雄同体现象并通过自交形成雄性的DH孢子体(孢子体父本)。
4.按权利要求2所述的在裙带菜中构建DH孢子体群体的方法，其特征在于：所述步骤2)F2配子体克隆中的雌性个体均能发生孤雌生殖现象，雄性个体均能发生雌雄同体现象，分别获得雌性和雄性DH株系，从而建立DH群体。
5.按权利要求2所述的在裙带菜中构建DH孢子体群体的方法，其特征在于：所述步骤1)雌、雄配子体克隆进行杂交并完成F1孢子体生活史的过程为：
将雌、雄配子体克隆在PES海水培养基中以温度18-20℃，光照强度50－80μmolphotons m-2s-1，光周期12h白天：12h黑夜；静止培养至幼孢子体达到1mm；并每3-5天更换一次PES海水培养基；
将培养至1mm的幼孢子体在PES海水培养基中，以温度18-20℃,光照强度50－80μmolphotons m-2s-1，光周期12h白天：12h黑夜，并充入空气的条件下培养至幼孢子体长度达到1cm，并每2-3天更换一次PES海水培养基；
培养至1cm的幼孢子体在4-18℃，于自然海水中充入空气通过翻滚培养，进而完成孢子体的生活史，形成成熟的孢子体；并每天更新一次自然海水，所述自然海水中添加终浓度为2.5mgL-1的NaNO3和终浓度为0.25mgL-1的KH2PO4。
6.按权利要求3所述的在裙带菜中构建DH孢子体群体的方法，其特征在于：所述步骤2)F2雌性、雄性配子体克隆分别发生孤雌生殖和雌雄同体现象发生并产生DH孢子体株系的过程为：
将F2雌、雄配子体克隆分别单独在PES海水培养基中以温度15-20℃，光照强度50－80μmol photons m-2s-1，光周期12h白天：12h黑夜；静止培养至幼孢子体达到1mm；并每3-5天更换一次PES海水培养基；之后的孢子体培养过程与步骤1)的F1孢子体的培养过程一致。
7.按权利要求2所述的在裙带菜中构建DH孢子体群体的方法，其特征在于：所述PES培养基为每1L消毒海水中添加20mL制备液；其中，制备液为每1L蒸馏水中加入NaNO33.5g、KH2PO40.5g、铁金属液250mL和金属液250mL；经溶解消毒，冷却待用；铁金属液为，每1L蒸馏水中加入Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.702g和Na2EDTA 0.6g；金属液为，每1L蒸馏水中加入Na2EDTA 1g，H3BO3 1.14g，FeCl3·6H2O 49mg，MnSO4·H2O 164mg，ZnSO4·7H2O 22mg和CoSO4·7H2O 4.8mg。
8.按权利要求1或2所述的在裙带菜中构建DH孢子体群体的方法，其特征在于：所述F1和F2雌或雄性配子体克隆长期保存的条件为温度18-20℃,光照强度3－5μmol photons m-2s-1，光周期12h白天：12h黑夜；并每2个月更换一次PES海水培养基。
9.一种按权利要求1所述的在裙带菜中构建DH孢子体群体的方法的应用，其特征在于：所述获得的DH孢子体群体是永久性遗传作图群体，可应用于遗传连锁图谱构建和数量性状定位的研究中。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN104094832A (zh) * 2014-06-30 2014-10-15 中国科学院海洋研究所 利用单性游孢子进行裙带菜杂交育种的方法
CN106069717A (zh) * 2016-06-16 2016-11-09 上海海洋大学 一种雌雄同体紫菜双单倍体群体组建的方法
CN112913678A (zh) * 2020-05-15 2021-06-08 中国科学院海洋研究所 一种在裙带菜中构建永久f2孢子体群体的方法

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