CN112683971B - 一种氯霉素光电化学适配体传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种氯霉素光电化学适配体传感器及其制备方法和应用，它涉及光电化学适配体传感器及其制法和应用。它是要解决现有的检测氯霉素的光电化学适配体传感器的检测限高、灵敏度低的技术问题。该传感器是将巯基修饰的氯霉素适配体负载于Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物修饰的ITO电极表面而成。制法：一、制备TiO2纳米花；二、制备MoS2/TiO2异质结；三、制备Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物；四、制备Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极；五、制备光电化学适配体传感器。用标准曲线法对氯霉素进行检测。检测限低至0.5pM，检测范围5.0pM～100.0nM。可用于食品检测领域。
Description
技术领域
本发明涉及氯霉素光电化学适配体传感器及其制备方法和应用。
背景技术
食品质量安全一直是当前社会关注的热点，这主要是由于动物衍生性食品中一些残留抗生素给人类健康带来的巨大隐患。氯霉素(Chloramphenicol，CAP)作为一种广谱性抗生素类药物，凭借良好的抑菌抗炎作用而被广泛用于治疗革兰氏阳性及阴性细菌所致的人畜感染性疾病。然而，摄入剂量过高的CAP会对人体产生严重的毒副作用和潜在致癌性，如抑制骨髓造血机能、引起消化机能紊乱和诱发白血病等。另外，CAP也被广泛用作兽药中的抗生素，这导致其在动物源性食品如蜂蜜，牛奶和肉类产品中残存积累，其可通过食物链进入人体，对人体健康造成巨大威胁。目前，世界各国已经逐渐禁止其在动物性食品中的使用。中国农业部规定CAP在所有食品动物的可食用组织中不得检出。欧盟进口食品卫生标准规定在动物源性食品中CAP的最低检测限为0.3ug/kg。因此，为满足在食品中有效检测CAP残留量，研发灵敏度高、特异性强的分析方法尤其重要。
迄今为止，常规检测CAP的方法有：液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)和电化学检测法等。然而，这些测定方法普遍存在技术含量高、耗时长、仪器设备庞大和灵敏度不佳等缺点。例如，HPLC法检测灵敏度高，但是操作繁锁，需要对目标待测物进行预处理，且检测成本高；ELISA法特异性强，但使用的抗体易受外界条件的干扰，呈现假阳性；电化学检测虽响应快，检测成本低，但限制于检测范围窄，检测限低。因此，研发灵敏度高、价格低廉、易微型化，且能够快速检测CAP含量的方法具有非常现实的意义。
适配体(Aptamer)作为一种新兴的生物识别元件，可以与目标检测物发生特异性结合，且具有稳定性高、价格低廉、易体外修饰加工等优点。近年来，基于适配体出众的特异性识别能力，将适配体应用于光电化学传感器的方法被逐渐应用。
申请号为201610506537.4的中国专利《一种快速检测氯霉素的电化学适配体传感器》中公开了一种光电化学适配体传感器，它是将适配体与纳米复合物上的银纳米粒子通过银硫键固定在玻碳电极上组装面成，样品中的氯霉素被定量捕捉至传感器表面，在纳米复合物的催化作用下产生电信号而被测量。其中纳米复合物是由聚二烯二甲基氯化铵功能能的还原石墨烯表面静电组装银纳米粒子制成。该电化学适配体传感器的线性范围为0.01～35μM，最低检测限为2nM。
发明内容
本发明是要解决现有的检测氯霉素的光电化学适配体传感器的检测限高、灵敏度低的技术问题，而提拱一种氯霉素光电化学适配体传感器及其制备方法和应用。
本发明的氯霉素光电化学适配体传感器是将巯基修饰的氯霉素适配体负载于AuNPs/MoS2/TiO2三元复合物修饰的ITO电极表面而成。
其中所述的巯基修饰的氯霉素适配体含有的碱基序列是5′-HS-ACT TCA GTG AGTTGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTAG-3′。
上述的氯霉素光电化学适配体传感器的制备方法，按以下步骤进行：
一、多级分层TiO2纳米花的制备：按二乙烯三胺(DETA)、异丙醇(IPA)和双乙酰丙酮基二异丙氧基钛酸酯(TIPD)的体积比为(2.0×10-3～4.0×10-3)：(15～35)：(1～3)量取二乙烯三胺、异丙醇和双乙酰丙酮基二异丙氧基钛酸酯，并混合均匀，得到混合液；将混合液转移至水热反应釜中，在温度为200～220℃的条件下水热反应为20～24h；将水热反应后的沉淀物分别用无水乙醇和去离子水洗涤，离心收集后，干燥；再将干燥后的产物倒入坩埚，置于马弗炉中，升温至450～500℃退火3～5h，得到多级分层TiO2纳米花；
二、MoS2/TiO2异质结复合纳米材料的制备：按摩尔比为(3～5)：(2～4)：(13～15)称取多级分层TiO2纳米花、钼酸钠和硫脲；先将多级分层TiO2纳米花分散在超纯水中，然后依次加入钼酸钠和硫脲，搅拌均匀后，转移至水热反应釜中，在温度为180℃～200℃的条件下水热反应20～24h，将水热反应后的沉淀物分别用去离子水和无水乙醇洗涤，离心收集后，干燥，得到MoS2/TiO2异质结复合纳米材料；
三、Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物的制备：首先称取0.05～0.1g MoS2/TiO2异质结复合纳米材料超声分散到20mL超纯水中，得到分散液；然后量取1～2mL 10mM三水氯金酸水溶液和1～2mL 10mM柠檬酸钠水溶液，在搅拌条件下依次加入上述分散液中，得到悬浊液；最后将此悬浊液转移至300W的氙灯下，光照60min，通过光催化作用将吸附在MoS2/TiO2表面的Au3+还原为Au NPs；待静置沉淀后，将反应沉淀物分别用去离子水和无水乙醇反复洗涤，离心收集后，干燥，得到Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物；
四、Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极的制备：将1～3mg步骤三中制备的Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物，均匀分散在1～5ml质量百分浓度为0.2％的壳聚糖醋酸溶液中，得到悬浮液；然后量取20～30μL悬浮液均匀涂于ITO电极表面，室温下下自然干燥1～3h，即得到AuNPs/MoS2/TiO2/ITO电极；
五、氯霉素光电化学适配体传感器的制备：将巯基修饰的氯霉素适配体溶液逐滴滴加在Au NPs/MoS2/TiO2/ITO表面，并在室温下孵育1～3h，通过Au-S键将适配体锚定在电极材料表面；随后用Tris-HCl缓冲溶液冲洗电极，以去掉未能结合在电极表面上的氯霉素适配体，得到Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO；再将Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极置于质量百分浓度为1％～3％的牛血清白蛋白溶液中保持1～3h，以封闭电极表面剩余的活性位点，防止结合氯霉素时发生附着位置的错乱；待封闭结束后，用pH 7.0的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，得到BSA/aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极，即氯霉素光电化学适配体传感器。
更进一步地，步骤一中所述的干燥是在50～60℃条件下干燥10～12h；
更进一步地，步骤一中所述的马弗炉的升温速度为3～5℃/min；
更进一步地，步骤二中所述的干燥是在50～60℃条件下干燥10～12h；
更进一步地，步骤三中所述的干燥是在50～60℃条件下干燥10～12h；
本发明的氯霉素光电化学适配体传感器的应用，是将氯霉素光电化学适配体传感器用于检测氯霉素。它是基于空间位阻效应对氯霉素进行检测，具有检测成本低、灵敏性高、抗干扰能力强、检测范围宽、检测限低等优点。
利用氯霉素光电化学适配体传感器定量检测氯霉素的方法，为标准曲线法。具体按以下步骤进行：
一、将氯霉素光电化学适配体传感器，置于不同浓度的CAP标准溶液中孵育10～80min，干燥后，再用pH值为7.4的PBS缓冲溶液冲洗掉电极表面未能结合的CAP，获得CAP/BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极；
二、将电化学工作站与氙灯联用，其中电化学工作站采用标准三电极体系，以CAP/BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极为工作电极，Ag/AgC1电极为参比电极，Pt片电极为对电极，pH值为7.4的PBS缓冲溶液做为测试电解液，并在电解液中加入0.1M抗坏血酸(AA)作为光电化学测试过程中的电子供体；测试前用400nm的截止滤光片将氙灯发出的紫外光源过滤，固定激发光源与工作电极的距离为10cm，并与工作电极表面垂直，以使激发光源发射出的可见光全部聚焦在工作电极的有效检测面积(1cm2)上；测试时，在氙灯光照20s、关闭20s的间歇式开关条件下，以0.6V的外加偏压进行安培瞬态光电流-时间(i-t)测试，得到不同CAP的浓度下的光电流值I；再在相同条件下，以BSA/aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极为工作电极，测试结合CAP前的光电流值I0；最后，以光电流差值ΔI为纵作标，其中ΔI＝I0-I，以CAP的浓度对数为横作标，拟合出光电流差值ΔI与CAP的浓度对数之间的变化关系曲线，即标准曲线；
三、将氯霉素光电化学适配体传感器置于待测溶液中，室温下干燥后，再用pH值为7.0的PBS缓冲溶液冲洗掉电极表面未能结合的CAP，获得CAP/BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极；以该电极为工作电极，采用步骤二的方法测试光电流差值ΔI，再从标准曲线上查出CAP的浓度，完成氯霉素的检测。
更进一步地，步骤二中所述的有效检测面积为1cm2。
本发明针对CAP的痕量分析建立了一种基于空间位阻效应型的CAP光电化学适配体传感器。光电化学传感器是一种基于物质的光电转换特性而进行痕量检测的新型检测技术，它具有灵敏度高、选择性好、操作简单、响应时间短和易微型化等优点，是目前最具发展前景的检测技术之一。在光电化学检测中光作为激发源，通过光激发产生的电信号为检测信号，由于激发源和检测信号属于不同能量形式，因此极大地减少了检测过程中背景信号的干扰，较低的信噪比使其检测限比传统电化学检测进一步降低。修饰在电极表面的光电活性材料是组成光电化学传感器的核心部分，它主要接受光激发而产生电荷分离和传递，在检测系统中起到信号发生作用。因此，光电活性材料的选择和制备对提高光电化学传感器的光电转化效率和检测灵敏度至关重要。二氧化钛(TiO2)凭借其良好的生物相容性、优异的化学稳定性、廉价无毒和容易制备等优点，在生物传感领域得到了广泛应用。但是，TiO2作为宽带隙半导体材料，可见光响应范围短，光生电子-空穴对复合快限制了其进一步在光电化学领域的应用。因此，为了更好地将TiO2应用于光电活性材料，可将其匹配不同带隙宽度的半导体材料，复合形成具有化学梯度的异质结构，以提高TiO2对可见光的利用效率，加快光生载流子的传递与分离。二硫化钼(MoS2)是二维过渡金属硫族化合物的代表，其禁带宽度较窄，可以吸收大范围的可见光，同时Mo原子之间的良好的电子流动性和高电子态密度，可以加快二维平面间电荷的转移，为光电流响应提供良好的传导界面。因此，将TiO2与间隙能级相互配备的MoS2复合成异质结构，不但能够很好地利用TiO2的光催化活性，而且可以令MoS2表现出更优异的性能。此外，由于在检测过程中光电化学传感器对目标待测物氧化能力过强，导致其对目标分析物的选择性较差，因此将电极材料与适配体生物敏感元件相结合，以提高检测过程中对不同目标分析物的特异性识别能力。
本发明中，首先采用溶剂热法制备出具有高活性表面的TiO2纳米花，其特有的空间结构为MoS2的大量负载提供了有效平台，随后采用原位光还原法将Au NPs沉积在其表面，通过引入Au NPs来提高复合半导体纳米材料的光电转化效率和生物相容性。最后，将此三元复合物作为光电化学传感器的光电活性材料修饰在ITO电极表面；巯基化修饰的适配体交联在光电活性材料表面，构建出光电化学适配体传感器。
和现有技术比，本发明具有以下有益效果：
(1)MoS2/TiO2异质结复合纳米材料相对于单一的光电活性材料来说，具有更高的光生电子-空穴对分离效率，显著的光电流信号响应。
(2)相比传统化学还原法，采用原位光还原法沉积Au NPs，避免了使用有机分散剂和稳定剂，在保证了Au NPs高度活性的同时，也保证了Au NPs在MoS2/TiO2异质结表面的分散性和均匀性，避免了Au NPs的大量团聚。同时，利用原位光还原法在MoS2/TiO2异质结表面沉积Au NPs，还可以进一步加速材料界面间的电子的转移效率；Au NPs良好的生物兼容性也会将大量生物分子负载到电极表面，有利于提高光电化学适配体传感器的灵敏度，本发明的氯霉素光电化学适配体传感器的检测极限低至0.5pM，检测范围为5.0pM～100.0nM。
(3)本发明选择适配体作为传感器的生物识别元件，其对目标分析物的特异性识别能力，不仅提高了传感器对CAP的选择性，同时适配体作为生物识别元件还兼具稳定性高、价格低廉、易体外修饰加工等优点，相比于现有技术中存在的预处理过程繁琐、成本高、耗时长、检测性能差等缺点，具有更佳优异的检测性能。
本发明的氯霉素光电化学适配体传感器可应用于食品质量安全检测领域。
附图说明
图1为实施例1中制备的不同纳米材料的SEM图，其中图a为TiO2纳米花的SEM图；图b为MoS2的SEM图；图c为MoS2/TiO2异质结的SEM图；图d为Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物的SEM图；
图2为实施例1中制备的不同纳米材料的XRD图谱，其中曲线a为TiO2纳米花的XRD图；曲线b为MoS2的的XRD图；曲线c为MoS2/TiO2异质结的XRD图，曲线d为Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物的XRD图；
图3为实施例1中制得的光电化学适配体传感器的交流阻抗谱图；
图4为实施例1中制得的光电化学适配体传感器的瞬态光电流曲线图；其中，a为裸ITO电极；b为TiO2/ITO电极；c为MoS2/TiO2/ITO电极；d为AuNPs/MoS2/TiO2/ITO电极；e为Aptamer/AuNPs/MoS2/TiO2/ITO电极；f为BSA/Aptamer/AuNPs/MoS2/TiO2/ITO电极；
图5为实施例1中适配体浓度的优化图；
图6为实施例1中孵育时间的优化图；
图7为实施例1中检测不同浓度氯霉素溶液时对应的光电流响应曲线图；
图8为实施例1中不同氯霉素浓度与光电流变化值关系的线性曲线图；
图9为实施例2中光电化学适配体传感器稳定性测试图；
图10为实施例2中不同干扰物对光电化学适配体传感器的抗干扰测试图。
具体实施方式
用下面的实施例验证本发明的有益效果。
实施例1：本实施例的氯霉素光电化学适配体传感器的制备方法，按以下步骤进行：
一、多级分层TiO2纳米花的制备：用移液枪吸取25.0μl二乙烯三胺(DETA)分散于30.0ml异丙醇(IPA)中，然后再在搅拌条件下加入1.0ml双乙酰丙酮基二异丙氧基钛酸酯(TIPD)，搅拌30min，得到混合液；将混合液转移至水热反应釜中，在温度为200℃的条件下水热反应24h；将水热反应后的黄色沉淀物分别用无水乙醇和去离子水洗涤，离心收集后，在60℃下干燥12h；再将干燥后的产物倒入坩埚，置于马弗炉中，以5℃/min的升温速度升温至450℃退火3h，得到多级分层TiO2纳米花；
二、MoS2/TiO2异质结复合纳米材料的制备：将0.16g TiO2纳米花超声分散在40ml超纯水中，然后依次加入0.70g钼酸钠和1.20g硫脲，搅拌30min后，转移至水热反应釜中，在温度为220℃的条件下水热反应24h，将水热反应后的黑色沉淀物分别用去离子水和无水乙醇洗涤，离心收集后，在60℃下干燥12h，得到MoS2/TiO2异质结复合纳米材料；单独MoS2在不加入TiO2条件下，采用上述相同反应条件制备；
三、Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物的制备：先将0.05g MoS2/TiO2异质结复合纳米材料分散在50ml超纯水中，并在搅拌条件下依次加入1mL 0.01M的三水氯金酸水溶液和1mL0.01M的柠檬酸钠水溶液，得到悬浊液；然后将悬浊液转移至300W的氙灯下，光照60min，通过光催化作用将吸附在MoS2/TiO2表面的Au3+还原为Au NPs；静置沉淀后，将沉淀物分别用去离子水和无水乙醇反复洗涤，离心收集后，在60℃下干燥12h，得到Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物；
四、Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极的制备：将ITO电极依次用丙酮、无水乙醇和超纯水清洗，以去除表面残留污渍，自然干燥；将质量百分浓度为0.2％的壳聚糖醋酸溶液为分散剂，将0.02g Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物加入到1mL的分散剂中，超声分散，得到悬浮液；用移液枪吸取20μL悬浮液旋涂于ITO电极表面，室温下自然干燥，得到Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极；将制备好的电极储存在4℃的冰箱内，备用；
同时，制备TiO2/ITO电极：将ITO电极依次用丙酮、无水乙醇和超纯水清洗，以去除表面残留污渍，自然干燥；将质量百分浓度为0.2％的壳聚糖醋酸溶液为分散剂，将0.02克TiO2粉加入到1mL的分散剂中，超声分散，得到悬浮液；用移液枪吸取20μL悬浮液旋涂于ITO电极表面，室温下自然干燥，得到TiO2/ITO电极；将制备好的电极储存在4℃的冰箱内，备用；
制备MoS2/TiO2/ITO电极：将ITO电极依次用丙酮、无水乙醇和超纯水清洗，以去除表面残留污渍，自然干燥；将质量百分浓度为0.2％的壳聚糖醋酸溶液为分散剂，将0.02克MoS2/TiO2异质结复合纳米材料粉加入到1mL的分散剂中，超声分散，得到悬浮液；用移液枪吸取20μL悬浮液旋涂于ITO电极表面，室温下自然干燥，得到MoS2/TiO2/ITO电极；将制备好的电极储存在4℃的冰箱内，备用；
五、氯霉素光电化学适配体传感器的制备：用移液枪吸取20.0μl 2μM巯基修饰的氯霉素适配体溶液，逐滴滴加在Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极表面，并于室温下孵育12h，通过Au-S键将适配体锚定在电极材料表面；接着用Tris-HCl缓冲溶液冲洗，以去掉未能结合在电极表面上的氯霉素适配体，得到Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极；再将Aptamer/AuNPs/MoS2/TiO2/ITO电极置于20mL质量百分浓度为5％的牛血清白蛋白溶液中保持1h，以封闭电极表面剩余的活性位点，最后，用pH 7.0的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，得到BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极，即氯霉素光电化学适配体传感器；其中步骤五中所述的巯基修饰的氯霉素适配体的序列为(5′-HS-ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGCGAG TCG GTG GTAG-3′)，购买于生物工程(上海)有限公司。
本实施例中在步骤一～三中制备的材料的扫描电镜照片如图1所示，其中图1a为步骤一得到的多级分层TiO2纳米花的SEM图，从图1a可以看出多级分层TiO2纳米花的直径约为700nm，其具有较大的比表面积，很适合作为载体负载其他纳米材料。图1b为步骤二中制备的MoS2样品的SEM图，从图1b可以看出，单独MoS2样品直径约为1μm，具有明显的片状结构。图1c是步骤二中得到的MoS2/TiO2异质结复合纳米材料的SEM图，从图1c中可以看出MoS2纳米片很好地将TiO2纳米花包裹在一起，且团簇直径有所增加，平均直径大约850nm。图1d是步骤三中得到的Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物的SEM图，从图1d中可以看到MoS2/TiO2复合物表面负载许多细小Au NPs，且Au NPs的直径大约在5nm左右，MoS2/TiO2复合物的表面粗糙程度进一步增强。
本实施例中在步骤一～三中制备的材料的XRD图如图2所示，表征制备材料的晶型结构及组成，图5中，曲线a为多级分层TiO2纳米花的XRD图，其中在25.3°、38.0°、48.0°、53.9°、55.1°和62.7°处的衍射峰分别对应锐钛矿型TiO2的(101)、(004)、(200)、(105)、(211)和(204)晶面。曲线b为单独的MoS2纳米片的XRD图，其中14.2°、33.3°、39.5°、58.6°处的衍射峰属于MoS2的特征峰，可分别对应六方晶型MoS2的(002)、(100)、(103)和(110)晶面。曲线c为MoS2/TiO2异质结复合纳米材料的XRD图，其中在14.2°、33.3°、39.5°和58.6°处的特征衍射峰归源于MoS2，而位于25.3°、48.0°处的两个特征衍射峰对应锐钛矿型TiO2的(101)和(200)晶面。这里锐钛矿型TiO2衍射峰强度变弱的原因可能是TiO2纳米花被MoS2纳米片紧密包裹在里面的缘故。曲线d为Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物的XRD图，从此图中不仅可以看到锐钛矿型TiO2和六方晶型MoS2的特征衍射峰，同时Au NPs的特征衍射峰也可以被清晰地观察到，其中位于38.6°、44.8°、64.9°和77.8°处的特征衍射峰分别对应Au NPs的(101)、(110)、(220)和(311)晶面。
将裸的ITO电极、本实施例中制备的TiO2/ITO电极、MoS2/TiO2/ITO电极、Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极、Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极和BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极同时进行交流阻抗测试。电化学阻抗图谱(EIS)测试是在含有0.1M KCl电解质的5mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中进行，设置初始电压为0.20V，高频到低频扫描范围为105Hz到0.1Hz，振幅为10mV；结果如图3所示，其中半圆直径表示电荷转移电阻(Rct)，Rct值越小代表电荷的转移效率越高。从图3中可以看出，裸ITO电极半圆直径最小，而TiO2/ITO半圆直径最大，这表明裸的TiO2/ITO电极导电性差。MoS2/TiO2异质结复合纳米材料的Rct明显减小，这表明构建的MoS2/TiO2异质结构有助于电子在修饰电极表面的转移和传递。当在MoS2/TiO2表面沉积Au NPs后，修饰电极的Rct值又进一步减小，这表明Au NPs的引入能够有效增加半导体复合材料的导电性能，提高氧化还原探针的电荷迁移速率。然而，当在AuNPs/MoS2/TiO2/ITO上固定适配体和牛血清白蛋白后，Rct值明显增加，这主要是因为生物大分子产生的空间位阻效应，以及适配体与氧化还原物质之间的静电排斥阻碍了氧化还原探针在电极和电解液界面间的电荷传递，同时这也间接说明了氯霉素光电化学适配体传感器构建成功。
将裸ITO电极、TiO2/ITO电极、MoS2/TiO2/ITO电极、步骤四得到的Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极以及步骤五得到的Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极和BSA/Aptamer/AuNPs/MoS2/TiO2/ITO电极同时进行安培瞬态光电流测试来进一步监测光电化学适配体传感器的组装过程和光电化学性能。得到不同修饰电极在间歇式开关条件下的光电流响应曲线如图4所示，裸ITO电极的光电流密度很小，这归因为锐钛矿型TiO2的带隙宽度较宽，可见光吸收范围短，因此纯的TiO2/ITO电极产生的光电流也仅有2.3μA。相较于纯TiO2/ITO，MoS2/TiO2/ITO电极的光电流(5.2μA)明显增强，这是由于将MoS2纳米片负载在TiO2表面，有效抑制了MoS2自聚现象，暴露出更多的活性位点，从而使复合后的材料具有更强的光电催化活性。当在MoS2/TiO2复合物表面沉积Au NPs后，光电流密度又进一步增加(7.2μA)，这可归因为Au NPs具有极强的导电性和可见光响应能力，提高了载流子的传递速率，从而展示出较高的光电流响应。然而，当适配体和牛血清白蛋白修饰Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极后，其光电流密度明显减小，这是因为BSA和适配体修饰后，电极表面产生的空间位阻效应极大地阻碍了载流子的传递，增加了光生电子-空穴对的复合几率，从而导致光电流强度下降，同时这也与交流阻抗测试结果相一致，再次验证了光电化学适配体传感器的构建成功。
将本实施例1步骤四得到的Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极制备不同氯霉素适配体浓度的Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极，具体步骤是：将用移液枪吸取20.0μl不同浓度(0M、0.05M、0.10M、0.15M、0.20M、0.25M)的巯基化修饰的适配体溶液，逐滴滴加在Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极表面，在室温下孵育1h，通过Au-S键将适配体锚定在电极材料表面；接着用Tris-HCl缓冲溶液冲洗，以去掉未能结合在电极表面上的氯霉素适配体，得到不同氯霉素适配体浓度修饰的Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极。然后，对这一系列电极进行瞬态光电流测试，得到不同浓度适配体所对应的光电流变化关系曲线图。如图5所示，随着适配体浓度的增加，光电流呈现出上升的趋势，这是因为固定在Au NPs/MoS2/TiO2光电极表面的适配体浓度越大，可以捕获的CAP就越多，光电流变化就越明显。但是，当适配体的浓度超过2μM时，光电流则呈现出下降的趋势，这表明过量的适配体产生的位阻效应阻碍了电子的传递。因此，可以证明本实施例选择的2μM作为适配体的浓度是最佳的。
将本实施例1步骤五得到的BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极制备不同氯霉素孵育时间的CAP/BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极，具体步骤是：将10nM氯霉素样品逐滴滴加在BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极表面，在不同孵育时间内(10min、20min、40min、60min、70min、80min)结合相同浓度的氯霉素样品。然后，对这一系列电极进行瞬态光电流测试，得到不同孵育时间电极所对应的光电流变化关系曲线图。从图6可以看出在10～60min范围内，修饰电极的光电流呈现上升的趋势，而当孵育时间达到60min后，光电流强度趋于平稳，这说明较短的孵育时间不利于适配体与氯霉素的结合，当孵育时间达到60min时二者的相互作用达到饱和状态。为了符合光电化学检测方便，对适配体的孵育时间也要尽量控制较短时间范围内。因此，选择60min作为底物CAP的最佳孵育时间。
用实施例1制备的氯霉素光电化学适配体传感器定量检测氯霉素的方法，为标准曲线法。具体按以下步骤进行：
一、将氯霉素光电化学适配体传感器，置于10mL不同浓度的CAP标准溶液中，CAP标准溶液的浓度为0.005nM、0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、50nM和100nM；结合目标待检测样品60min，室温下干燥后，再用pH值为7.0的PBS缓冲溶液冲洗掉电极表面未能结合的CAP，获得CAP/BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极；
二、将电化学工作站与氙灯联用，其中电化学工作站采用标准三电极体系，以CAP/BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极为工作电极，以Ag/AgC1电极为参比电极，以Pt片电极为对电极，以0.1M pH值为7.0的PBS缓冲液为电解液，并在电解液中填加AA，AA的浓度为0.1M，以用作捕获光生空穴的电子供体，保证测试中光电流的输出稳定性；测试前用400nm的截止滤光片将氙灯发出的紫外光源过滤，固定激发光源与工作电极的距离为15cm，并与工作电极表面垂直，使激发光源发射出的可见光全部聚焦在工作电极的有效检测面积(0.1cm2)上；测试时，在氙灯光照20s、关闭20s的间歇式开关条件下，即光照20s，黑暗：20s；以0.6V的外加偏压进行安培瞬态光电流-时间(i-t)测试，得到不同CAP的浓度下的光电流值I，得到的不同浓度氯霉素溶液时对应的光电流响应曲线图如图7所示，从图7可以观察到，光电流值I随着CAP浓度(从a到j依次为：0.005，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50，100nM)的增加而增加；再在相同条件下，以BSA/aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极为工作电极，测试结合CAP前的光电流值I0；最后，以光电流差值ΔI为纵作标，其中ΔI＝I0-I，以CAP的浓度对数为横作标，拟合出光电流差值ΔI与CAP的浓度对数之间的变化关系曲线，即标准曲线，如图8所示；从图8可以看出，在5.0pM～100.0nM范围内，ΔI与CAP浓度的对数之间呈现良好的线性关系。因此，可以得出构建的光电化学适配体传感器检测范围为5.0pM～100.0nM，线性方程为ΔI(μA)＝0.618log CCAP(nM)+2.682，相关系数R2＝0.996。在信噪比为3(S/N＝3)时，检测极限低至0.5pM；
三、将氯霉素光电化学适配体传感器置于目标待测溶液中，室温下干燥后，再用pH值为7.0的PBS缓冲溶液冲洗掉电极表面未能结合的CAP，获得CAP/BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极；以该电极为工作电极，采用步骤二的方法测试光电流差值ΔI，再从标准曲线上查出CAP的浓度，完成目标待测物氯霉素的检测。
从图8的标准曲线可以看出，构建的光电化学适配体传感器可以用来检测氯霉素，并可以根据线性回归方程计算出氯霉素的浓度。同时，本实施例制备的传感器相比于已报道的其他类型传感器表现出更优越的检测性能，这归因于Au NPs/MoS2/TiO2复合物优异的光电化学性能，以及适配体作为分子识别元件对目标待测物的特异性，使得构建的传感器展现出较低的检测限和较宽的检测范围。
实施例2：为了考察光电化学适配体传感器稳定性、重现性和选择性，在相同的条件下制备了五根同样的工作电极，在相同的测试条件下，检测相同浓度的CAP样品。具体的氯霉素光电化学适配体传感器的制备方法，按以下步骤进行：
一、多级分层TiO2纳米花的制备：用移液枪吸取20.0μL二乙烯三胺(DETA)分散于20.0mL异丙醇(IPA)中，然后再在搅拌条件下加入1.0ml双乙酰丙酮基二异丙氧基钛酸酯(TIPD)，均匀搅拌30min，得到混合液；将混合液转移至水热反应釜中，在温度为200℃的条件下水热反应24h；将水热反应后的黄色沉淀物分别用无水乙醇和去离子水洗涤，离心收集后，在60℃下干燥12h；再将干燥后的产物倒入坩埚，置于马弗炉中，以3℃/min的升温速度升温至450℃退火3h，得到多级分层TiO2纳米花；
二、MoS2/TiO2异质结复合纳米材料的制备：将0.16g TiO2纳米花超声分散在40ml超纯水中，然后依次加入0.70g钼酸钠和1.20g硫脲，搅拌30min后，转移至水热反应釜中，在温度为220℃的条件下水热反应24h，将水热反应后的黑色沉淀物分别用去离子水和无水乙醇洗涤，离心收集后，在60℃下干燥12h，得到MoS2/TiO2异质结复合纳米材料；
三、Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物的制备：先将0.05g MoS2/TiO2异质结复合纳米材料分散在50mL超纯水中，并在搅拌条件下依次加入1mL 0.01M的三水氯金酸水溶液和1mL0.01M的柠檬酸钠水溶液，得到悬浊液；然后将悬浊液转移至300W的氙灯下，光照60min，通过光催化作用将吸附在MoS2/TiO2表面的Au3+还原为Au NPs；静置沉淀后，将沉淀物分别用去离子水和无水乙醇反复洗涤，离心收集后，在60℃下干燥12h，得到Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物；
四、Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极的制备：将ITO电极依次用丙酮、无水乙醇和超纯水清洗，以去除表面残留污渍，自然干燥；将质量百分浓度为0.2％的壳聚糖醋酸溶液为分散剂，将0.02g Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物加入到1mL的分散剂中，超声分散，得到悬浮液；用移液枪吸取20μL悬浮液分别涂于五个ITO电极表面，室温下自然干燥，得到五支Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极；将制备好的电极储存在4℃下的冰箱内，备用；
五、氯霉素光电化学适配体传感器的制备：用移液枪吸取20.0μL 2μM巯基修饰的氯霉素适配体溶液，逐滴滴加在五支Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极表面，并于室温下孵育12h，通过Au-S键将适配体锚定在电极材料表面；接着用Tris-HCl缓冲溶液冲洗，以去掉未能结合在电极表面上的氯霉素适配体，得到五支Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极；再将五支Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极置于20mL质量百分浓度为5％的牛血清白蛋白溶液中保持1h，以封闭电极表面剩余的活性位点，最后，用pH 7.0的PBS缓冲溶液冲洗电极表面；得到五支BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极，即氯霉素光电化学适配体传感器；
其中步骤五中所述的巯基修饰的氯霉素适配体的序列为(5′-HS-ACT TCA GTGAGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTAG-3′)，购买于生物工程(上海)有限公司。
用实施例2制备的五支氯霉素光电化学适配体传感器，在相同的测试条件下，检测相同浓度的CAP样品，具体的检测过程如下：
一、将五支氯霉素光电化学适配体传感器，分别置于10mL浓度为10nM的CAP标准溶液中；结合目标待检测样品1h，室温下干燥后，再用pH值为7.0的PBS缓冲溶液冲洗掉电极表面未能结合的CAP，获得CAP/BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极；
二、将电化学工作站与氙灯联用，其中电化学工作站采用标准三电极体系，以CAP/BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极为工作电极，以Ag/AgC1电极为参比电极，以Pt片电极为对电极，以0.1M pH值为7.0的PBS缓冲液为电解液，并在电解液中填加AA，AA的浓度为0.1M，以用作捕获光生空穴的电子供体，保证测试中光电流的输出稳定性；测试前用400nm的截止滤光片将氙灯发出的紫外光源过滤，固定激发光源与工作电极的距离为10cm，并与工作电极表面垂直，使激发光源发射出的可见光全部聚焦在工作电极的有效检测面积(0.1cm2)上；在间歇式开关条件，即光照20s，黑暗：20s；0.6V外加偏压下进行瞬态光电流测试；交流阻抗(EIS)测试是在含有0.1M KCl电解质的5mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中进行，设置初始电压为0.20V，高频到低频扫描范围为105Hz到0.1Hz，振幅为10mV；通过光电流响应的相对标准偏差(RSD)来评估传感器的重新性，经计算，5根工作电极的RSD为4.3％，表明本实施例制备的光电化学适配体传感器具有较好的重现性。此外，从图9的光电化学适配体传感器稳定性测试图中，可以看到经过10次周期循环后光电流响应几乎保持不变，这表明本实施例制备的光电化学适配体传感器具备较好的测试稳定性。
为了验证实施例2制备的配体传感器的特异性，选择了一些具有代表性的干扰物，即卡那霉素、土霉素、四环素、链霉素和环丙沙星来测试实施例2制备的光电化学适配体传感器的抗干扰能力。用实施例2制备的五支氯霉素光电化学适配体传感器，在相同的测试条件下，检测相同浓度的CAP样品，具体的检测过程如下：
一、将卡那霉素、土霉素、四环素、链霉素和环丙沙星来分别加入10mL浓度为10pM的CAP标准溶液中，混合均匀，其中干扰物的浓度为100pM，得到五种加了干扰物的CAP溶液；将五支氯霉素光电化学适配体传感器，分别置于五种加了干扰物的CAP溶液中；结合目标待检测样品1h，室温下干燥后，再用pH值为7.0的PBS缓冲溶液冲洗掉电极表面未能结合的CAP，获得CAP/BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极；
二、将电化学工作站与氙灯联用，其中电化学工作站采用标准三电极体系，以CAP/BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极为工作电极，以Ag/AgC1电极为参比电极，以Pt片电极为对电极，以0.1M pH值为7.0的PBS缓冲液为电解液，并在电解液中填加AA，AA的浓度为0.1M，以用作捕获光生空穴的电子供体，保证测试中光电流的输出稳定性；测试前用400nm的截止滤光片将氙灯发出的紫外光源过滤，固定激发光源与工作电极的距离为10cm，并与工作电极表面垂直，使激发光源发射出的可见光全部聚焦在工作电极的有效检测面积(0.1cm2)上；在间歇式开关条件，即光照20s，黑暗：20s；0.6V外加偏压下进行瞬态光电流测试；通过对比不同样品的光电流响应变化值来考察传感器的抗干扰能力，得到的光电化学适配体传感器的抗干扰测试图如图10所示，从图10中可以看出，实施例2制备的光电化学适配体传感器只对目标待测物氯霉素产生了明显的光电流变化，而其它干扰物所产生的光电流信号变化相对很小，由此证明了本实施例制备的光电化学适配体传感器只对氯霉素具有较高的选择性。
Claims (8)
1.一种氯霉素光电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、多级分层TiO2纳米花的制备：按二乙烯三胺、异丙醇和双乙酰丙酮基二异丙氧基钛酸酯的体积比为(2.0×10-3～4.0×10-3)：(15～35)：(1～3)量取二乙烯三胺、异丙醇和双乙酰丙酮基二异丙氧基钛酸酯，并混合均匀，得到混合液；将混合液转移至水热反应釜中，在温度为200～220℃的条件下水热反应20～24h；将水热反应后的沉淀物分别用无水乙醇和去离子水洗涤，离心收集后，干燥；再将干燥后的产物倒入坩埚，置于马弗炉中，升温至450～500℃退火3～5h，得到多级分层TiO2纳米花；
二、MoS2/TiO2异质结复合纳米材料的制备：按摩尔比为(3～5)：(2～4)：(13～15)称取多级分层TiO2纳米花、钼酸钠和硫脲；先将多级分层TiO2纳米花分散在超纯水中，然后依次加入钼酸钠和硫脲，搅拌均匀后，转移至水热反应釜中，在温度为180℃～200℃的条件下水热反应20～24h，将水热反应后的沉淀物分别用去离子水和无水乙醇洗涤，离心收集后，干燥，得到MoS2/TiO2异质结复合纳米材料；
三、Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物的制备：首先称取0.05～0.1g MoS2/TiO2异质结复合纳米材料超声分散到20mL超纯水中，得到分散液；然后量取1～2mL 10mM三水氯金酸水溶液和1～2mL 10mM柠檬酸钠水溶液，在搅拌条件下依次加入上述分散液中，得到悬浊液；最后将此悬浊液转移至300W的氙灯下，光照60min，通过光催化作用将吸附在MoS2/TiO2表面的Au3+还原为Au NPs；待静置沉淀后，将反应沉淀物分别用去离子水和无水乙醇反复洗涤，离心收集后，干燥，得到Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物；
四、Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极的制备：将1～3mg步骤三中制备的Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物，均匀分散在1～5ml质量百分浓度为0.2％的壳聚糖醋酸溶液中，得到悬浮液；然后量取20～30μL悬浮液均匀涂于ITO电极表面，室温下自然干燥1～3h，即得到Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极；
五、氯霉素光电化学适配体传感器的制备：将巯基修饰的氯霉素适配体溶液逐滴滴加在Au NPs/MoS2/TiO2/ITO表面，并在室温下孵育1～3h，通过Au-S键将适配体锚定在电极材料表面；随后用Tris-HCl缓冲溶液冲洗电极，以去掉未能结合在电极表面上的氯霉素适配体，得到Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO；再将Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极置于质量百分浓度为1％～3％的牛血清白蛋白溶液中保持1～3h，以封闭电极表面剩余的活性位点，防止结合氯霉素时发生附着位置的错乱；待封闭结束后，用pH 7.0的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，得到BSA/aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极，即氯霉素光电化学适配体传感器；该传感器是将巯基修饰的氯霉素适配体负载于Au NPs/MoS2/TiO2三元复合物修饰的ITO电极表面而成。
2.根据权利要求1所述的一种氯霉素光电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于步骤一中所述的干燥是在50～60℃条件下干燥10～12h。
3.根据权利要求1或2所述的一种氯霉素光电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于步骤一中所述的马弗炉的升温速度为3～5℃/min。
4.根据权利要求1或2所述的一种氯霉素光电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于步骤二中所述的干燥是在50～60℃下干燥10～12h。
5.根据权利要求1或2所述的一种氯霉素光电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于步骤三中所述的干燥是在50～60℃下干燥10～12h。
6.权利要求1所述方法制备的一种氯霉素光电化学适配体传感器的应用，其特征在于该应用是将氯霉素光电化学适配体传感器用于检测氯霉素。
7.根据权利要求6所述的一种氯霉素光电化学适配体传感器的应用，其特征在于利用氯霉素光电化学适配体传感器定量检测氯霉素的方法，为标准曲线法。
8.根据权利要求6所述的一种氯霉素光电化学适配体传感器的应用，其特征在于利用氯霉素光电化学适配体传感器定量检测氯霉素的标准曲线法，具体步骤如下：
一、将氯霉素光电化学适配体传感器，置于不同浓度的CAP标准溶液中孵育10～80min，干燥后，再用pH值为7.4的PBS缓冲溶液冲洗掉电极表面未能结合的CAP，获得CAP/BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极；
二、将电化学工作站与氙灯联用，其中电化学工作站采用标准三电极体系，以CAP/BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极为工作电极，Ag/AgC1电极为参比电极，Pt片电极为对电极，pH值为7.4的PBS缓冲溶液作为测试电解液，并在电解液中加入0.1M抗坏血酸作为光电化学测试过程中的电子供体；测试前用400nm的截止滤光片将氙灯发出的紫外光源过滤，固定激发光源与工作电极的距离为10cm，并与工作电极表面垂直，以使激发光源发射出的可见光全部聚焦在工作电极的有效检测面积；测试时，在氙灯光照20s、关闭20s的间歇式开关条件下，以0.6V的外加偏压进行安培瞬态光电流-时间测试，得到不同CAP的浓度下的光电流值I；再在相同条件下，以BSA/aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极为工作电极，测试结合CAP前的光电流值I0；最后，以光电流差值ΔI为纵作标，其中ΔI＝I0-I，以CAP的浓度对数为横作标，拟合出光电流差值ΔI与CAP的浓度对数之间的变化关系曲线，即标准曲线；
三、将氯霉素光电化学适配体传感器置于待测溶液中，室温下干燥后，再用pH值为7.0的PBS缓冲溶液冲洗掉电极表面未能结合的CAP，获得CAP/BSA/Aptamer/Au NPs/MoS2/TiO2/ITO电极；以该电极为工作电极，采用步骤二的方法测试光电流差值ΔI，再从标准曲线上查出CAP的浓度，完成氯霉素的检测。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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