CN112662705B - 一种经基因修饰提高胰岛细胞分泌胰岛素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种经基因修饰提高胰岛细胞分泌胰岛素的方法，采用ERRγ基因修饰胰腺相关细胞。本发明将特定的ERRγ蛋白带入胰岛细胞内，激活糖代谢相关通路，提高胰岛细胞分泌ERRγ蛋白含量以及胰岛素的量。本发明含有ERRγ基因的病毒感染胰腺相关细胞培养7‑9后得到的胰岛细胞，分泌的ERRγ蛋白含量为3.2‑3.5 ng/ml；22mmol葡萄糖刺激下分泌的胰岛素含量为71.2‑75 ng/ml，2mmol葡萄糖刺激下分泌的胰岛素含量为11.6‑12 ng/ml。

Description

一种经基因修饰提高胰岛细胞分泌胰岛素的方法

技术领域

本发明涉及一种经基因修饰提高胰岛细胞分泌胰岛素的方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

胰腺是分泌胰脂肪酶、胰蛋白酶、弹性酶、胰淀粉酶等消化酶的外分泌腺，也是分泌胰高血糖素、胰岛素、生长抑素、胰多肽等胰腺激素的内分泌腺。胰腺激素是由胰腺中被称为“胰岛”的细胞群分泌的，它包括四种类型的细胞，分别为α细胞、β细胞、δ细胞、 pp细胞。

糖尿病是一种由于胰岛素缺乏或工作不足引起的疾病。这种病一旦在病人身上发生，就很难完全治愈。糖尿病有两种主要类型，胰岛素依赖型的I型糖尿病和胰岛素不依赖型的II型糖尿病。II型糖尿病是一种慢性疾病，是在机体获得胰岛素抵抗时发生的。II型糖尿病也被认为是一种生活方式相关的疾病，是由于不良的生活方式习惯，包括过度饮食或缺乏锻炼引起的肥胖或压力而导致的。II型糖尿病常发生在中老年人群，许多糖尿病患者患有II型糖尿病。

I型糖尿病是由自身免疫性疾病或病毒感染破坏β细胞或胰岛素分泌细胞引起的。胰岛素分泌细胞被破坏，胰岛素不能在体内分泌。I型糖尿病患者用胰岛素作为对症治疗。此外，应用胰腺或胰岛移植，使患者获得自动控制血糖水平的能力。血糖水平经常波动，胰腺或胰岛移植可以减轻患者的负担，本治疗可使患者血糖达到正常水平。然而，目前可供移植的胰腺和胰岛数量不足，且接受移植的病人必须终生服用免疫抑制剂，这种药物可能会引起其他副作用。

随着干细胞与组织工程领域的相关研究飞速发展，已有人研究出诱导多能干细胞定向分化为胰岛细胞的方法，CN104726395B利用胚胎干细胞和异体诱导性多能干细胞定向分化为胰岛细胞。在现有技术中，还有其他来源获得胰岛细胞，比如CN201811023578.3中利用表皮干细胞诱导分化为胰岛细胞，但诱导后的胰岛细胞分泌的胰岛素量少，达不到成年人胰岛细胞的分泌水平，达不到临床应用的目的。

目前没有有效的技术能够提高胰岛细胞分泌胰岛素。

发明内容

针对现有技术存在的不足,本发明提供一种经基因修饰提高胰岛细胞分泌胰岛素的方法，解决诱导的胰岛细胞分泌胰岛素量过低的问题。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种经基因修饰提高胰岛细胞分泌胰岛素的方法，采用ERRγ基因修饰胰腺相关细胞。

以下是对上述技术方案的进一步改进：

所述ERRγ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述胰腺相关细胞由幼稚期的干细胞诱导得到。

所述幼稚期的干细胞为胚胎干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或羊膜间充质干细胞。

所述幼稚期的干细胞为H9系胚胎干细胞。

所述胰腺相关细胞为胰腺内皮层细胞、胰岛细胞或者两者的组合。

所述胰腺相关细胞的纯度在60%以上。

含有ERRγ基因的病毒以MOI=95-105加入到胰腺相关细胞中进行培养。

所述培养条件为：先培养40-56h后，然后更换新鲜的培养基，继续培养5-7天。

使用的培养基为包含9.5-10.5uM 的SB431542和0.9-1.1uM 的T3的CMRL1066培养基。

与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

本发明将特定的ERRγ蛋白带入胰岛细胞内，激活糖代谢相关通路，提高胰岛细胞分泌ERRγ蛋白含量以及胰岛素的量。

本发明含有ERRγ基因的病毒感染胰腺相关细胞培养7-9后得到的胰岛细胞，分泌的ERRγ蛋白含量为3.2-3.5 ng/ml； 22mmol葡萄糖刺激下分泌的胰岛素含量为71.2-75ng/ml，2mmol葡萄糖刺激下分泌的胰岛素含量为11.6-12 ng/ml，和基因库XM_021197757.2号ERRγ基因在相同条件下感染胰腺相关细胞培养7-9后得到的胰岛细胞（对照）相比，本发明组分泌的ERRγ蛋白含量相较于对照组，提高23-25%；胰岛素的分泌量提高14-16%（22mmol葡萄糖）、20.8-24%（2mmol葡萄糖）。

附图说明

图1 PCR跑胶验证ERRγ基因序列长度图；

图2 免疫荧光显微镜观察重组pAAV-ERRγ转染293T细胞的荧光图；

图3 ELISA检测感染后的胰岛细胞中ERRγ蛋白含量的柱状图；

图4免疫荧光显微镜观察重组ERRγ腺相关病毒感染胰岛细胞荧光图；

图5流式细胞仪测定重组ERRγ腺相关病毒感染胰岛细胞的感染率；

图6 ELISA胰岛素检测试剂盒检测各组胰岛细胞的胰岛素分泌量的柱状图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

实施例1 优化ERRγ基因的密码子

以基因库XM_021197757.2号ERRγ基因序列为基础序列，进行密码子优化，使得基因表达量提高，生成的蛋白更多。其优化后的ERRγ的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.1。同时以XM021197757.2的ERRγ基因序列进行了对比实验。

实施例2 构建ERRγ基因的重组腺相关病毒载体

委托北京博迈德基因技术有限公司合成密码子优化后ERRγ基因全长序列，并将其连接到腺相关病毒（pAAV-IRES-hrGFP）载体上，PCR验证后进行测序（如图1）。序列正确后建立菌种库，使用OMEGA公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组腺相关病毒表达载体pAAV-ERRγ，其质粒浓度为356ng/µl。同时以XM021197757.2的ERRγ基因序列构建重组腺相关病毒表达载体pAAV-ERRγ-XM，其质粒浓度为312ng/ul。

实施例3 腺相关病毒的包装与滴度测定

①293T细胞的复苏与传代

从液氮罐中取出冻存的293T细胞，迅速丢入37℃水浴锅中并快速晃动，尽量在1~2min内使细胞溶液完全溶解。将细胞溶液转移到50ml离心管中，加入生理盐水清洗DMSO，混匀后离心，1500 rpm 5 min。去掉上清，加入5 ml新鲜的完全培养基重悬细胞，转入T75瓶中，每个瓶中补足到10ml完全培养基。将培养瓶平稳放入37℃、5 %CO₂ 的培养箱中培养。第二天观察细胞存活率，并更换培养基。以后每天观察细胞生长情况，在细胞铺满瓶底的80%-90%时传代，传代后细胞用于转染。

②腺相关病毒的包装与滴度测定

当培养瓶中传代后细胞铺板达到80%-90%时，用于转染；

转染试剂的准备：在5ml离心管中，分别配制A管与B管试剂（Tube A and Tube B）

配好后，放置5min，然后将A管缓慢加入B管，混合均匀。室温放置20min，形成脂质体-DNA混合物。将混合物加入上述培养瓶中，轻微混匀。置于37℃，5%CO₂培养箱中培养4-6h。

更换新鲜的完全培养基，继续培养24-48h，用免疫荧光显微镜观察转染情况（如图2），收取全部上清和细胞，转移至50ml离心管，4000g离心30min，去除上清。加入2mL PBS混匀，放在-80℃反复冻融5次，使细胞充分裂解。4000g离心30min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中，得到pAAV-ERRγ病毒、pAAV-ERRγ-XM病毒。利用倍比稀释技术法测定病毒滴度，本发明中pAAV-ERRγ的病毒滴度为1.52×10⁹TU/ml，pAAV-ERRγ-XM的病毒滴度为1.45×10⁹TU/ml。

上述完全培养基是指含10%FBS的DMEM培养基。

实施例4 pAAV-ERRγ病毒、pAAV-ERRγ-XM病毒感染诱导胰腺相关细胞

以胚胎干细胞（H9系）为初始细胞诱导为胰腺相关细胞，将pAAV-ERRγ病毒或pAAV-ERRγ-XM病毒感染胰腺相关细胞，使其表达ERRγ，激活糖代谢相关信号通路，促进胰岛细胞分泌胰岛素。

所述胰腺相关细胞，为胰腺内皮层细胞、胰岛细胞或者两者的组合；所述胰腺相关细胞的纯度在60%以上。

所述初始细胞，除了胚胎干细胞，还可以是其他幼稚期的干细胞，比如脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或者羊膜间充质干细胞，均能实现本发明的发明目的。

此阶段使用的培养基为包含SB431542（10uM）和T3（1uM）的CMRL1066培养基，

对诱导后的胰腺相关细胞进行计数，分别将制备好的pAAV-ERRγ病毒或pAAV-ERRγ-XM病毒以MOI=100加入其中，放在37℃，5%的CO₂培养箱中培养48小时后，400g离心5min，去除上清，加入新鲜的含SB431542（10uM）和T3（1uM）的CMRL1066培养基进行培养，使其持续分泌胰岛素，继续培养5天左右，得到胰岛细胞，检测胰岛素的分泌。分别收集3ml的pAAV-ERRγ病毒和pAAV-ERRγ-XM病毒感染后得到的胰岛细胞，对细胞进行充分裂解，利用ERRγELISA检测试剂盒检测ERRγ蛋白的含量。如图3所示，密码子优化的ERRγ蛋白含量要高于未优化的ERRγ蛋白含量。pAAV-ERRγ病毒感染后的胰岛细胞分泌的ERRγ蛋白含量为3.2ng/ml，pAAV-ERRγ-XM病毒感染后的胰岛细胞分泌的ERRγ蛋白为2.6 ng/ml。

通过荧光显微镜观察pAAV-ERRγ病毒感染后的胰岛细胞（如图4），并用流式细胞仪测定其感染效率，本发明中胰岛细胞的感染率为76.7%（如图5）。

实施例5 胰岛细胞的糖刺激实验

（1）实验分组：以胚胎干细胞（H9系）为初始细胞诱导的胰岛细胞作为未经病毒感染的胰岛细胞组；以实施例4中pAAV-ERRγ病毒感染胰腺相关细胞后得到的胰岛细胞为经pAAV-ERRγ病毒感染的胰岛细胞组，pAAV-ERRγ-XM病毒感染胰腺相关细胞后得到的胰岛细胞为经pAAV-ERRγ-XM病毒感染的胰岛细胞组。

（2）细胞准备：分别将未经病毒感染的胰岛细胞、pAAV-ERRγ-XM病毒感染后的胰岛细胞和pAAV-ERRγ病毒感染后的胰岛细胞500g离心5min，去除培养上清，用2ml无糖的KRB buffer混匀，加入六孔板中，放在37℃、5%CO₂培养箱中培养1h。

（3）离心去掉上清，加2mL含2mmol/L（低糖）或者22mmol/L（高糖）葡萄糖的KRBbuffer，继续孵育1h之后，收集上清至EP管中。

（4）1×PBS清洗细胞3次，加入50ul/孔（24孔板）RIPA裂解液充分裂解细胞，收集裂解液于低温离心机4℃离心，12000rpm，20min，收集上清至EP管中。

实施例6 ELISA试剂盒检测胰岛素的分泌量

（1）将收集到的未经病毒感染的胰岛细胞上清、pAAV-ERRγ病毒感染胰岛细胞的上清和pAAV-ERRγ-XM病毒感染胰岛细胞的上清进行1000g离心10min，并分别对样本进行稀释5倍、10倍、15倍、20倍，进行ELISA检测。

（2）实验前30min，拿出试剂盒，恢复至室温，加入样本前，进行洗板3次并甩干。

（3）加入100ul标准品及检测样本至反应孔中，封板后于37℃温箱孵育90min，然后用洗涤液清洗4次并甩干。

（4）加入100ul生物素化抗体工作液至反应孔中，封板后于37℃温箱孵育60min，然后用洗涤液清洗4次并甩干。

（5）加入100ul酶结合物工作液至反应孔中，封板后于37℃温箱孵育30min，然后用洗涤液清洗5次并甩干。

（6）加入100ul显色底物至反应孔中，封板后于37℃温箱避光显色15min。

（7）加入50ul终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值，绘制胰岛素标准品曲线，计算本发明中各个组的胰岛素含量。

结果如图6所示，低糖和高糖刺激下，pAAV-ERRγ病毒感染胰岛细胞分泌的胰岛素量、pAAV-ERRγ-XM病毒感染胰岛细胞分泌的胰岛素量、以胚胎干细胞（H9系）为初始细胞诱导的胰岛细胞（未经病毒感染的胰岛细胞）分泌的胰岛素量如下表：

可见，本发明pAAV-ERRγ病毒感染胰岛细胞，胰岛素的分泌量明显高于pAAV-ERRγ-XM病毒感染胰岛细胞以及未经病毒感染的胰岛细胞。

序列表

<110> 山东省成体细胞产业技术研究院有限公司

<120> 一种经基因修饰提高胰岛细胞分泌胰岛素的方法

<130> 2020

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1374

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atggacagcg ttgaactgtg cctccctgaa tcctttagct tgcactacga agaggagctt 60

ctttgtcgca tgagtaacaa ggatagacac attgacagta gctgtagctc ctttataaag 120

acagaacctt ctagccccgc atcactgact gatagcgtga atcaccattc cccaggcggg 180

tcctcagacg catctggatc ttatagctct acaatgaacg gacaccaaaa tggtcttgac 240

agccctcctc tgtatcctag tgcacctatc ctgggaggat ccgggccagt gagaaaactg 300

tacgacgact gctctagcac catcgtggag gatcctcaga ccaagtgtga gtacatgttg 360

aatagcatgc ctaagcgcct gtgtctggtg tgtggagaca ttgcctcagg ctatcactac 420

ggcgtggctt cctgtgaggc ctgtaaagcc tttttcaagc ggactataca gggtaacata 480

gagtattcat gccctgcgac taacgaatgc gaaattacca agcgaaggag aaagtcctgt 540

caggcatgcc ggttcatgaa gtgcttgaag gtgggtatgc ttaaagaagg agttaggttg 600

gatcgagtac gcggcgggag acagaagtac aagcgcagga ttgacgccga gaacagcccg 660

tacttgaatc cccagctcgt gcagccggca aaaaagccat ataacaaaat tgtgtctcac 720

ttgctcgtcg cggagccaga gaaaatatac gccatgccgg acccaactgt tccagattct 780

gacatcaaag ctcttactac actgtgtgat ctggcagata gagagcttgt agtgattata 840

ggatgggcaa agcacattcc aggctttagt accctgtccc ttgcggacca gatgtctctg 900

ctgcagtccg cctggatgga aatactgatc ctcggggtgg tttaccggtc actgtccttt 960

gaggatgagc tggtctacgc cgatgattat atcatggacg aagatcagag taagctcgcc 1020

ggtctgctgg atctcaataa tgccatcctg caacttgtga agaagtacaa atccatgaag 1080

ctggagaagg aggaattcgt gacgctgaaa gccatcgctt tggccaactc cgattccatg 1140

cacatcgagg acgttgaggc cgttcagaag ctgcaggatg tgcttcatga agccctgcag 1200

gactatgaag ctggtcagca catggaggac cctcgaagag ccggaaagat gctgatgacc 1260

ctgcctcttc tccgccagac ctccacaaag gctgtccaac acttttataa catcaagttg 1320

gaaggtaagg taccaatgca caagctcttt ctggagatgc tggaagctaa agtt 1374

Claims (3)

1.一种经基因修饰提高胰岛细胞分泌胰岛素的方法，其特征在于：采用ERRγ基因修饰胰腺相关细胞；所述ERRγ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述胰腺相关细胞为胰岛细胞；

所述ERRγ基因修饰胰腺相关细胞的培养条件为：

含有ERRγ基因的病毒感染胰腺相关细胞40-56h后，然后更换新鲜的培养基，继续培养5-7天；

所述培养基为包含9.5-10.5μM 的SB431542和0.9-1.1μM的T3的CMRL1066培养基。

2.根据权利要求1所述的一种经基因修饰提高胰岛细胞分泌胰岛素的方法，其特征在于：所述胰腺相关细胞的纯度在60%以上。

3.根据权利要求1所述的一种经基因修饰提高胰岛细胞分泌胰岛素的方法，其特征在于：含有ERRγ基因的病毒以MOI=95-105加入到胰腺相关细胞中进行感染。

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