CN112662651A - 一种利用富氮生物质产纤维素酶和油脂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于木质纤维类生物质生物炼制技术，利用富氮生物质产纤维素酶和油脂的方法，本发明充分利用反复预处理富氮生物质得到的液相进行生产纤维素酶，纤维素酶部分直接用于预处理后再生生物质的水解，剩余纤维素酶可提纯为商品酶，提高了经济效益；而且富有氮源的液相添加于再生生物质的含糖水解液中，使得碳氮比在一个合适范围内，有利于油脂合成。本发明是一种富氮生物质的综合利用方法，可以共生产微生物油脂和纤维素酶，实现了富氮生物质中碳水化合物彻底、高效地转化为微生物油脂和高含氮组分高效高值化利用制备纤维素酶，具有显著的经济效益。

Description

一种利用富氮生物质产纤维素酶和油脂的方法

技术领域

本发明属于木质纤维类生物质生物炼制技术领域，尤其涉及一种利用富氮生物质产纤维素酶和油脂的方法。

背景技术

自然界中有少量酵母菌和霉菌，在特定条件下可以积累大于或等于自身细胞干重20％w/w(w/w，质量比)的油脂，被称为产油酵母和产油霉菌。部分产油酵母/霉菌底物利用范围很广，抗逆性强，油脂积累能力很强，具有很好的应用前景。此外，它们合成的油脂，其主要成分是三酰甘油，其脂肪酸组成与动植物油脂相似，以C₁₄-C₂₂长链脂肪酸为主，可以作为生物柴油的潜在油源，乃至多不饱和脂肪酸、可可脂替代物等食用油脂，润滑油、表面活性剂等油脂化学品等。利用产油酵母/霉菌生产油脂具有很大优势，如生产周期短、产量高、不需退耕还林、不受季节或者气候的影响、易于规模化等。

木质纤维类生物质是地球上最丰富的可再生资源之一。其主要成分为纤维素、半纤维素和木质素。其中的草本类生物质还富含粗蛋白，有的甚至达到其干重的20％以上。利用生物质制备微生物油脂需要经过几个步骤：预处理、酶水解、油脂发酵和油脂提取。利用廉价的木质纤维类生物质制备微生物油脂，有望大幅度降低原料成本，使商业化成为可能。

由于生物质中的纤维素、半纤维素和木质素紧密缠绕在一起，具有很强的抗降解性。因此，需要先经过物理、化学、物理化学或生物的方法进行预处理破坏木质纤维素材料的顽固性结构，降低木质纤维素的结晶度、增加原料的孔隙率、提高酶的可及度和脱除木质素的保护作用，最终提高纤维素酶的可及性。目前预处理成本较高，且剧烈的预处理过程往往还会产生对后续发酵有负面影响的抑制性因子，这些都阻碍其商业化。草本类生物质相对于农作物秸秆、树木等，其木质素含量较低，结构更松散，无需经过高强度的预处理，有望降低预处理成本，并减少抑制性因子的产生。

诱发产油酵母/霉菌高效积累微生物油脂，往往需要碳源大大过量，而其它营养成分如氮、磷或硫等营养受限。其中氮限制是诱发产油酵母/霉菌高效积累微生物油脂的最常用、最有效的方法之一。然而，草本类生物质中粗蛋白含量较高，生物质经预处理后，大部分的氮源营养存在于液相中，导致水解液中氮源营养较为丰富，C/N摩尔比较低，当产油微生物接入这种富含氮源的培养基中培养，菌株以细胞增殖为主，积累油脂很少。而预处理回收的生物质氮源含量极低，通过酶水解处理得到的水解液中氮源极其匮乏，导致水解液的C/N摩尔比过高，由于微生物油脂为胞内产物，过高的C/N比使得菌株增殖极少，也不利于微生物油脂的大量生产。因此现有利用富氮生物质制备微生物油脂方法存在油脂产量低、油脂得率低的突出问题。

生物质中的碳水化合物聚合物一般需要经酶水解为可发酵性糖后才能被产油微生物所利用。然而，目前纤维素酶成本仍然较高，是制约木质纤维类生物质制备生物燃料和生物化学品的商业化的重要因素之一。自然界中某些丝状真菌能够高效生产纤维素酶，例如木霉属、青霉属、曲霉属等。其中木霉属因其易于培养、酶产量高且稳定性好等优点，已被广泛用于工业化。真菌纤维素酶是诱导酶，当培养基中存在葡萄糖等易利用碳源时，纤维素酶产量少；当培养基中添加纤维素、纤维二糖、槐糖、乳糖等诱导性碳源时，可诱导纤维素酶的大量合成。此外，诱导大量纤维素酶合成时，需要大量氮源营养，其中蛋白质合成的前体各种氨基酸是最佳的氮源之一。然而，若将氨基酸直接添加至培养基中，其成本过高，会显著增加纤维素酶生产的成本。利用高蛋白质的廉价原料并将其水解为氨基酸，作为产酶真菌合成纤维素酶的底物，对降低纤维素酶生产成本、提高酶的合成效率具有很重要的意义。

发明内容

鉴于上述问题，本发明的目的在于提供一种利用富氮生物质产纤维素酶和油脂的方法，旨在解决现有利用富氮生物质生产油脂产量低、油脂得率低、生产成本高的技术问题。

本发明采用如下技术方案：

所述利用富氮生物质产纤维素酶和油脂的方法，包括下述步骤：

步骤S1、将富氮生物质通过稀酸高温预处理，固液分离后得到固相和液相，其中固相加水洗涤并将洗涤水加入至液相中，液相补酸后返回用于富氮生物质预处理，重复操作若干次，得到含高浓度有机氮源的液相和大量结构被破坏的再生生物质；

步骤S2、将产酶真菌孢子悬液接种于种子培养基中培养，制备产酶真菌种子液并接入产酶培养基中进行发酵，发酵过程中周期性补加所述含高浓度有机氮源的液相，发酵结束后固液分离，得到的液相作为纤维素酶粗酶液；

步骤S3、将所述再生生物质加水调整固液比，然后加入一定量步骤S2得到的纤维素酶粗酶液进行酶水解，水解结束后固液分离获得的含糖水解液，含糖水解液中添加适量所述含高浓度有机氮源的液相调整C/N摩尔比，并调整pH值，作为发酵培养基，灭菌待用；

步骤S4、将产油微生物接种于种子培养基中培养，制备产油微生物种子液，将产油微生物种子液接种至步骤S3所述发酵培养基中培养，当发酵培养基中糖浓度低于设定阈值时，结束发酵；

步骤S5、固液分离收集含油菌体，提取胞内油脂。

进一步的，所述方法还包括下述步骤：

步骤S6、将纤维素酶粗酶液经过浓缩、添加保护剂制成溶液酶或者通过沉淀、喷雾干燥制成纤维素酶粉，作为商品酶。

进一步的，步骤S1中，所述富氮生物质成分含有纤维素、半纤维素、木质素和蛋白质。

进一步的，步骤S1中，所述稀酸为稀硫酸、稀盐酸或稀硝酸，稀酸浓度范围为1g/L～10g/L，预处理温度为120℃～190℃，预处理时间为5min～2h，预处理重复操作3-5次。

进一步的，步骤S1中，富氮生物质按照固液比5％～15％w/v与稀酸混合均匀，并在高温下进行预处理，这里w/v为质量体积比。

进一步的，步骤S2中，所述产酶真菌为经过发酵能高产纤维素酶的真菌,产酶真菌种子液按照接种量2％～10％v/v接入产酶培养基中进行发酵，这里v/v为体积比。

进一步的，步骤S3中，再生生物质加水调整固液比至8％～15％w/w，按照5～20FPU/g加入纤维素酶粗酶液进行酶水解，调整的C/N摩尔比至70～400并调节pH值至5～7，这里w/w为质量比。

进一步的，步骤S4中，所述产油微生物经发酵培养后积累油脂含量超过细胞干重20％，产油微生物种子液的接种量为5％～10％v/v，于25℃～35℃通气培养，当发酵培养基中糖浓度低于5g/L时，结束发酵。

本发明的有益效果是：本发明是一种富氮生物质的综合利用方法，可以共生产微生物油脂和纤维素酶，实现了富氮生物质中碳水化合物彻底、高效地转化为微生物油脂和高含氮组分高效高值化利用制备纤维素酶，具有显著的经济效益。其中富氮生物质重复多次预处理，减少了酸催化剂的使用，显著降低了预处理成本，显著减少了废水的排放，且得到的液相中，粗蛋白通过反复酸水解，富集高浓度的以氨基酸为主的速效氮源，可作为纤维素酶合成的优质底物和补料培养基，显著降低了纤维素酶生产成本，提高了酶的合成效率；同时由于预处理后的再生生物质氮源缺乏，通过酶水解得到的含糖水解液中引入有机氮源液相，调节C/N比后，可以作为优良的油脂发酵培养基，水解液中的碳水化合物主要被用于油脂合成，大大提高了油脂产量和得率。

附图说明

图1是本发明实施例提供的利用富氮生物质产纤维素酶和油脂的方法的流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了说明本发明所述的技术方案，下面通过具体实施例来进行说明。

如图1所示，本发明提供的利用富氮生物质产纤维素酶和油脂的方法，包括下述步骤：

步骤S1、将富氮生物质通过稀酸高温预处理，固液分离后得到固相和液相，其中固相加水洗涤并将洗涤水加入至液相中，液相补酸后返回用于富氮生物质预处理，重复操作若干次，得到含高浓度有机氮源的液相和大量结构被破坏的再生生物质。

富氮生物质的主要成分为纤维素、半纤维素、木质素和蛋白质，草本类生物质相对于农作物秸秆、树木等，其木质素含量较低，结构更松散，无需经过高强度的预处理，可以降低预处理成本，并减少抑制性因子的产生，草本类生物质可视为富氮生物质，包括但不限于芦竹、象草、柳枝稷、草芦、浮萍、水葫芦、紫茎泽兰、草坪草等。

将富氮生物质自然干燥、粉碎至粒径小于5mm，添加稀酸水溶液至固液质量比5％～15％w/v，混合均匀并在高温下预处理。本实施例中，稀酸为稀硫酸、稀盐酸或稀硝酸，稀酸浓度范围为1g/L～10g/L，预处理温度为120℃～190℃，预处理时间为5min～2h。

预处理后固液分离，收集液相和固相，固相生物质加适量水洗涤，洗涤水合并至液相，还要根据酸损失补充对应的烯酸催化剂后再次用于富氮生物质预处理，重复上述液相回收预处理操作3-5次，最终得到含高浓度有机氮源的液相和大量结构被破坏的再生生物质。

步骤S2、将产酶真菌孢子悬液接种于种子培养基中培养，制备产酶真菌种子液并接入产酶培养基中进行发酵，发酵过程中周期性补加所述含高浓度有机氮源的液相，发酵结束后固液分离，得到的液相作为纤维素酶粗酶液。

所述产酶真菌为经过发酵能高产纤维素酶的真菌，包括木霉、青霉、曲霉等，如里氏木霉Trichoderma reesei、草酸青霉Penicillium oxalicum、黑曲霉Aspergillusniger。这些菌株可以直接从中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、美国典型培养物保藏中心(ATCC)、美国农业研究菌株保藏中心(NRRL)、或英国国家菌株保藏中心(UKNCC)等菌种保藏机构购买或从自然界中分离，也可以使用与原来菌株性状不同的人工或自然突变菌株。

将产酶真菌接种于PDA固体培养基中培养5～7天，加无菌水洗涤菌苔，无菌纱布过滤，离心，沉淀水洗2次，制备产酶真菌孢子悬液。

将产酶真菌孢子悬液接种于种子培养基中，25℃-35℃培养24～72h，制备产酶真菌种子液。将所述产酶真菌种子液接种至产酶培养基中，接种量为2％～10％v/v，培养温度为25℃～35℃，通气培养，发酵过程中周期性地补加上述含高浓度有机速效氮源的液相，发酵5～7天结束，固液分离，液相作为纤维素酶粗酶液部分用于再生生物质的酶水解。产酶培养基中还可以添加下述步骤S3中再生生物质酶水解的含糖水解液以及添加含高浓度有机氮源的液相分别作为碳源和氮源，另外可以添加少量乳糖、纤维二糖或槐糖作为诱导物。

步骤S3、将所述再生生物质加水调整固液比，然后加入一定量步骤S2得到的纤维素酶粗酶液进行酶水解，水解结束后固液分离获得的含糖水解液，含糖水解液中添加适量所述含高浓度有机氮源的液相调整C/N摩尔比，并调整pH值，作为发酵培养基，灭菌待用。

再生生物质加水调整固液比至8％～15％w/w，调节pH值至4.8左右，再添加前述步骤得到的纤维素酶粗酶液，载酶量为5～20FPU/g，于50℃酶水解48～96h，水解结束后固液分离获得的以葡萄糖和木糖为主的含糖水解液，添加少量所述含高浓度有机氮源的液相，调整C/N摩尔比至70～400并调节pH值至5～7后，作为油脂发酵的发酵培养基，灭菌待用。

步骤S4、将产油微生物接种于种子培养基中培养，制备产油微生物种子液，将产油微生物种子液接种至步骤S3所述发酵培养基中培养，当发酵培养基中糖浓度低于设定阈值时，结束发酵。

产油微生物是指一类能够积累超过自身细胞干重20％油脂的产油酵母或霉菌，包括油脂酵母、红酵母、丝孢酵母、隐球酵母、被孢霉，如斯达氏油脂酵母Lipomycesstarkeyi、毛孢子油脂酵母Cutaneotrichosporon oleaginosum、粘红酵母Rhodotorulaglutinis、圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides、皮状丝孢酵母Trichosporoncutaneum、发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans、白色隐球酵母Cryptococcusalbidus、解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica、深黄被孢霉Mortierella isabellina、高山被孢霉Mortierella alpina等。这些菌株可以直接从中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、美国典型培养物保藏中心(ATCC)、美国农业研究菌株保藏中心(NRRL)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、或英国国家菌株保藏中心(UKNCC)等菌种保藏机构购买或从自然界中分离，也可以使用与原来菌株性状不同的人工或自然突变菌株。

取一环活化的将产油微生物，接种于营养丰富的种子培养基，25℃～35℃培养，制备产油微生物种子液。将产油微生物种子液接种至发酵培养基中，接种量为5％～10％v/v，于25℃～35℃通气培养，当发酵培养基中糖浓度低于5g/L时，结束发酵。

步骤S5、固液分离收集含油菌体，提取胞内油脂。

产油发酵结束后固液分离，收集菌体，使用有机溶剂提取器胞内的微生物油脂，后续用于生产生物柴油或者其他用途。

步骤S6、将纤维素酶粗酶液经过浓缩、添加保护剂制成溶液酶或者通过沉淀、喷雾干燥制成纤维素酶粉，作为商品酶。

上述步骤S2得到的纤维素酶粗酶液，部分用于再生生物质的酶水解，的剩余粗酶液经过简单浓缩、添加保护剂制成溶液酶或者通过硫酸铵沉淀、喷雾干燥制成纤维素酶粉，作为商品酶。

本发明将生物质经稀酸预处理所得的液相，合并固相的洗涤水，并根据酸损失补充对应的酸催化剂后反复用于生物质预处理3～5次，最终得到含高浓度有机速效氮源的液相和大量结构被破坏的再生生物质，所得含高浓度有机速效氮源的液相作为产酶真菌的生产纤维素酶的补料培养基，用于生产纤维素酶；生产的纤维素酶粗酶液直接用于再生生物质的酶水解获得水解液；预处理后的再生生物质酶水解后，添加少量含高浓度有机氮源的液相将C/N摩尔比调整至70～400之间，作为发酵培养基培养产油微生物，收获含油菌体，利用有机溶剂提取胞内油脂。剩余的纤维素酶粗酶液经过简单浓缩、添加保护剂制成溶液酶或者通过沉淀、喷雾干燥制成纤维素酶粉，作为商品酶。

本发明预处理液中有机氮源的含量会不断富集和浓缩，蛋白质水解程度不断提高，最终得到一种含有高浓度有机速效氮源的液相，作为真菌合成纤维素酶的优质前体，大大降低了成本。菌株所产的纤维素酶可直接用于再生生物质的酶水解，与少量含高浓度有机氮源的液相理性调配后制备培养基，非常适合产油微生物高产油脂，提高油脂产量和得率，解决了富氮生物质低产油脂的问题，具有很强的综合技术优势和经济性。

下面通过具体实施例和对比例来对本发明进行说明。以下实施例选取了典型的利用富氮生物质原料生产微生物油脂以及纤维素酶的工艺例子，有助于了解本发明，但不以任何形式限制将本发明应用于其他材料或产油菌株以及产纤维素酶的菌株。

实施例1

1)水葫芦预处理：将水葫芦自然干燥，机械粉碎过2mm筛，称取100g，添加10g/L的稀硫酸溶液至固液比为10％(w/v)，充分搅拌均匀，在120℃预处理1h，预处理结束后真空抽滤得液相0.5L，用0.5L去离子水分2次洗涤固相，并将预处理液与洗涤液合并，定容至1L，补加少量硫酸使含量与预处理前相同；用所得液相再次预处理100g水葫芦，重复上述步骤5次，最终得到1L液体和292g再生生物质。

2)纤维素酶粗酶液的制备：将里氏木霉Trichoderma reesei Rut-C30接于PDA固体平板，28℃培养7天，无菌水洗涤纱布过滤，沉淀水洗2遍后作为孢子悬液，接入种子培养基(15g/L葡萄糖、20g/L酵母提取物、2.5g/L硫酸铵、6g/L磷酸氢二钾、0.8g/L硫酸镁、1g/L氯化钙、0.005g/L七水硫酸亚铁、0.0016g/L一水硫酸锰、0.0014g/L七水硫酸锌、0.0037g/L六水氯化钴)，28℃培养48h。将种子液接入产酶培养基(50g/L微晶纤维素、20g/L麦麸、10g/L乳糖、2g/L硫酸铵、2g/L吐温80、10mL/L步骤1)的液相)中，接种量10％(v/v)，在30℃下通气振荡培养，周期性地补加步骤1)中所述液相，发酵7天结束，固液分离，上清液即为粗酶液，其滤纸酶活力为41.5FPU/mL。

3)发酵培养基的制备：将步骤1)所得再生生物质进行酶水解，固液比为8％(w/v)，添加步骤2)的粗酶液，添加量为10FPU/g，pH 4.8、50℃水解72h。水解结束后，离心得水解清液，其中还原糖浓度为48.6g/L。将适量步骤1)的液相加入该水解液中，调整C/N摩尔比300，作为产油微生物发酵培养基，于121℃下灭菌20min，备用。

4)微生物油脂的生产：挑取一环毛孢子油脂酵母C.oleaginosum ATCC20509接种于种子培养基(20g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、5g/L蛋白胨)中，在30℃下振荡培养24h，获得种子液。将种子液接种于步骤3)中的发酵培养基中，接种量10％(v/v)，在30℃下通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于5g/L时结束发酵，固液分离，收集菌体，使用有机溶剂提取其胞内油脂，最终得到生物量15.2g/L，油脂量9.9g/L，油脂含量65.1％(w/w)，油脂得率为0.22g/g。

对比例1

1)水葫芦预处理和酶水解：将水葫芦自然干燥，机械粉碎过2mm筛，称取100g，加入10g/L的稀硫酸溶液调整固液比至10％(w/v)，混合均匀，在120℃预处理1h；预处理结束后，加入固体氢氧化钠调节pH至4.8，加水调整固液比至8％(w/v)，按照10FPU/g添加商品纤维素酶，50℃酶水解72h，水解结束后固液分离，得到水解液上清1.1L，其中还原糖浓度为35.4g/L，C/N摩尔比4.1。水解液121℃下灭菌20min，作为产油微生物发酵培养基。

2)产油微生物发酵获取微生物油脂：接一环毛孢子油脂酵母Cutaneotrichosporon oleaginosum ATCC 20509于种子培养基(20g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、5g/L蛋白胨)中，30℃振荡培养24h，获得种子液。将种子液接种于步骤1)制备的发酵培养基中，接种量10％(v/v)，在30℃下通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于5g/L时结束发酵，固液分离，收集菌体，使用氯仿/甲醇法提取胞内微生物油脂，最终得到生物量12.8g/L，油脂量1.4g/L，油脂含量10.9％(w/w)，油脂得率为0.04g/g。

实施例2

1)象草预处理：将象草自然干燥，机械粉碎过2mm筛，称取120g，加入10g/L的稀硫酸溶液，使其固液比为12％(w/v)，搅拌均匀，在180℃预处理15min；结束后真空抽滤得预处理液0.45L，用0.5L去离子水分2次洗涤固相，并将预处理液与洗涤液合并，定容至1L，将硫酸含量调节至与预处理前相同；用所得液相再次预处理120g象草，重复上述步骤4次，最终得到1L液体以及324g固体。

2)纤维素酶粗酶液的制备：根据实施例1所述方法制备里氏木霉Trichodermareesei Rut-C30种子液。将种子液接入产酶培养基(50g/L预处理象草、10g/L麦麸、2g/L硫酸铵、2g/L纤维二糖、2g/L吐温80、15mL/L步骤1)的液相)中，接种量10％(v/v)，在30℃下通气振荡培养，按5mL/L周期性补加步骤1)的液相，发酵7天结束，固液分离，上清液即为粗酶液，其滤纸酶活力为44.7FPU/mL。

3)发酵培养基的制备：利用步骤2)所得粗酶液对步骤1)所得的再生生物质进行酶水解，固液比为8％(w/v)，载酶量为15FPU/g，pH调至4.8，50℃水解72h。水解结束后，离心得到水解清液，其中还原糖浓度为49.3g/L。将适量步骤1)中的液相加入到该水解液中，调整C/N摩尔比为400，于121℃下灭菌20min，备用。

4)微生物油脂的生产：挑取一环发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans CICC1368接种于培养基(20g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、5g/L蛋白胨)中，30℃振荡培养24h，获得种子液。将种子液接种至步骤3)中所述发酵培养基中，接种量10％(v/v)，30℃通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于5g/L时结束发酵，固液分离，收集菌体，使用氯仿/甲醇提取其胞内油脂。最终得到生物量13.9g/L，油脂量9.7g/L，油脂含量69.6％(w/w)，油脂得率为0.24g/g。

对比例2

1)象草预处理：将象草自然干燥，机械粉碎过2mm筛，称取120g，加入10g/L的稀硫酸溶液，使其固液比为12％(w/v)，搅拌均匀，在180℃预处理15min；预处理结束后，离心，沉淀水洗2遍，液相合并作为预处理液。沉淀加水调整固液比至8％(w/v)，按照15FPU/g添加商品里氏木霉，50℃酶水解72h，水解结束后固液分离，得到水解清液，其中还原糖浓度为45.4g/L，C/N摩尔比850。酶水解清液121℃下灭菌20min，作为油脂发酵培养基。

2)纤维素酶粗酶液的制备：根据实施例1所述方法制备里氏木霉Trichodermareesei Rut-C30种子液。将种子液接入产酶培养基(50g/L预处理象草、10g/L麦麸、2g/L硫酸铵、2g/L纤维二糖、2g/L吐温80、15mL/L步骤1)的液相)中，接种量10％(v/v)，在30℃下通气振荡培养，按5mL/L周期性补加步骤1)的预处理液，发酵7天结束，固液分离，上清液即为粗酶液，其滤纸酶活力为3.5FPU/mL。

3)微生物油脂的生产：接一环发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans CICC1368于种子培养基(20g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、5g/L蛋白胨)，30℃振荡培养24h，获得种子液。将种子液接入步骤1)的2种发酵培养基中，接种量10％(v/v)，在30℃下通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于5g/L时即可结束发酵，固液分离，收集菌体，使用酸热法提取其胞内油脂，当预处理液作为培养基时，生物量5.1g/L，油脂量0.9g/L，油脂含量17.6％(w/w)，油脂得率为0.05g/g。当酶水解清液作为培养基时，生物量7.1g/L，油脂量4.0g/L，油脂含量56.3％(w/w)，油脂得率为0.12g/g。

实施例3

1)柳枝稷预处理：将柳枝稷自然干燥，粉碎过5mm筛，称取100g，加入10g/L的稀盐酸溶液，使其固液比为10％(w/v)，搅拌均匀，于190℃预处理5min；预处理结束后真空抽滤得预处理液0.55L，用0.4L去离子水分2次洗涤固相，并将预处理液与洗涤液合并，定容至1L，将硫酸含量调节至与预处理前相同；用所得液相再次预处理100g柳枝稷，重复上述步骤4次，最终得到1L液体以及254g固体。

2)纤维素酶粗酶液的制备：将绿色木霉Trichoderma viride QM9414在PDA固体培养基中培养7天，加无菌水洗涤纱布过滤，制备孢子悬液，接入种子培养基(2％乳糖、1.2％玉米浸出液、0.2％麦麸、0.02％吐温80、10mL/L痕量元素母液)，30℃振荡培养72h，获得种子液。将种子液接入产酶培养基(50g/L微晶纤维素、10g/L麦麸、15g/L乳糖、2g/L吐温80、10mL/L步骤1)的液相)中，接种量10％(v/v)，在26℃下通气振荡培养，每隔24h补加10mL/L步骤1)的液相，发酵8天结束，固液分离，上清液即为粗酶液，其滤纸酶活力为42.3FPU/mL。

3)发酵培养基的制备：加水将步骤1)所得预处理再生生物质的固液比调至15％(w/v)，加入步骤2)制备粗酶液，载酶量为20FPU/g，pH调至4.8，在50℃水解72h，水解结束后离心，得到水解清液，其中还原糖浓度为88.2g/L。将适量步骤1)的液相加入该水解液中，调整C/N摩尔比为350，于121℃下灭菌20min，备用。

4)微生物油脂的生产：挑取一环圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS2.1389接种于种子培养基(20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、10g/L蛋白胨)中，30℃振荡培养20h，获得种子液。将种子液接种至步骤3)的发酵培养基中，接种量5％(v/v)，28℃通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于5g/L时即可结束发酵，离心收集菌体，使用酸热法提取其胞内油脂，最终得到生物量27.2g/L，油脂量16.5g/L，油脂含量60.7％(w/w)，油脂得率为0.22g/g。

实施例4

1)浮萍预处理：将浮萍晒干，机械粉碎过1mm筛，称取50g，添加1g/L的稀盐酸溶液将固液比调整为5％(w/v)，搅拌均匀，于180℃预处理15min。预处理结束后真空抽滤得预处理液0.7L，用0.3L去离子水分2次洗涤固相，并将预处理液与洗涤液合并，定容至1L，将硫酸含量调节至与预处理前相同；用所得液相再次预处理50g浮萍，重复上述步骤5次，最终得到1L液体以及165g固体。

2)纤维素酶粗酶液的制备：将里氏木霉T.reesei CGMCC 3.5218在PDA固体培养基中培养7天，加无菌水洗涤纱布过滤，制备孢子悬液，接入PDA液体种子培养基中，25℃振荡培养48h，获得种子液。将种子液接入产酶培养基(50g/L微晶纤维素、10g/L麦麸、10g/L龙胆二糖、2g/L硫酸铵、2g/L吐温80、10mL/L步骤1)的液相)中，接种量5％(v/v)，在25℃下通气振荡培养，每隔12h补加5mL/L步骤1)的液相，发酵7天结束，固液分离，上清液即为粗酶液，其滤纸酶活力为33.3FPU/mL。

3)发酵培养基的制备：加水将步骤1)所得再生生物质的固液比调整为10％(w/v)，添加步骤2)所得粗酶液，载酶量为7.5FPU/g，pH调至4.8，50℃水解48h。酶水解结束后离心，得到水解清液，其中还原糖浓度为56.3g/L。将适量步骤1)的液相加入该水解液中，调整C/N摩尔比为200，于121℃下灭菌20min，备用。

4)微生物油脂的生产：挑取一环粘红酵母Rhodotorula glutinis AS 2.703接种于种子培养基(20g/L葡萄糖、10g/L玉米浆)中，30℃振荡培养24h，获得种子液。将种子液接种至步骤3)中所述发酵培养基中，接种量8％(v/v)，28℃通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于5g/L时即可结束发酵，固液分离，收集菌体，使用有机溶剂提取其胞内油脂，最终得到生物量15.3g/L，油脂量10.1g/L，油脂含量66.0％(w/w)，油脂得率为0.20g/g。

实施例5

1)芦竹预处理：将芦竹自然干燥，机磨碎后过5mm筛，称取150g，加入10g/L的稀硫酸溶液混合均匀，使固液比为15％(w/v)，在130℃预处理1h。预处理结束后真空抽滤得预处理液0.4L，用0.6L去离子水分2次洗涤固相，并将预处理液与洗涤液合并，定容至1L，将硫酸含量调节至与预处理前相同；用所得液相再次预处理150g芦竹，重复上述步骤3次，最终得到1L液体以及382g固体。

2)纤维素酶粗酶液的制备：将草酸青霉Penicillium oxalicum CGMCC3.15651在PDA固体培养基中培养7天，加无菌水洗涤纱布过滤，制备孢子悬液，接入种子培养基(10g/L乳糖、5g/L酵母浸出物、5g/L麦麸、2g/L吐温80、10mL/L痕量元素母液)，25℃振荡培养48h，获得种子液。将种子液接入产酶培养基(20g/L羧甲基纤维素、5g/L硫酸铵、5g/L纤维二糖、2g/L吐温80、痕量元素母液10mL/L、10mL/L步骤1)的液相)中，接种量5％(v/v)，在26℃下通气振荡培养，每隔12h补加5mL/L步骤1)的液相，发酵8天结束，固液分离，上清液即为粗酶液，其滤纸酶活力为39.5FPU/mL。

3)发酵培养基配制：加水将步骤1)所得再生生物质的固液比调整为15％(w/v)，加入步骤2)制备的粗酶液，载酶量为20FPU/g，pH 4.8、50℃酶水解96h。水解结束后抽滤，得到水解清液，其中还原糖浓度为95.4g/L。将适量步骤1)中的液相加入该水解液中，调整C/N摩尔比为180，于121℃下灭菌15min，备用。

4)微生物油脂的生产：挑取一环白色隐球酵母Cryptococcus albidus ATCC34140接种于液体培养基(20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、10g/L蛋白胨)中，30℃振荡培养24h，获得种子液。将种子液接种于步骤3)的发酵培养基中，接种量10％(v/v)，30℃通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于5g/L时即可结束发酵，固液分离，收集菌体，使用有机溶剂提取其胞内油脂，最终得到生物量22.9g/L，油脂量13.5g/L，油脂含量59.0％(w/w)，油脂得率为0.21g/g。

实施例6

1)草芦预处理：将草芦晒干，机磨碎后过1mm筛，称取80g，加入5g/L的稀硝酸溶液混合均匀，使固液比为8％(w/v)，在120℃预处理2h。预处理结束后真空抽滤得预处理液0.7L，用0.25L去离子水分2次洗涤固相，并将预处理液与洗涤液合并，定容至1L，将硫酸含量调节至与预处理前相同；用所得液相再次预处理80g草芦，重复上述步骤5次，最终得到1L液体以及281g固体。

2)纤维素酶粗酶液的制备：将里氏木霉T.reesei CGMCC 3.5218在PDA固体培养基中培养7天，加无菌水洗涤纱布过滤，制备孢子悬液，接入种子培养基(10g/L纤维素、10g/L酵母粉、10g/L葡萄糖、1.4g/L硫酸铵、2g/L磷酸二氢钾、0.4g/L二水氯化钙、0.3g/L 7水硫酸镁、10mL/L痕量元素母液)，30℃振荡培养48h，获得种子液。将种子液接入产酶培养基(50g/L再生草芦生物质、5g/L硫酸铵、5g/L槐糖、1g/L吐温80、15mL/L步骤1)的液相)中，接种量2％(v/v)，在25℃下通气振荡培养，每隔12h补加10mL/L步骤1)的液相，发酵7天结束，固液分离，上清液即为粗酶液，其滤纸酶活力为31.9FPU/mL。

3)发酵培养基的制备：加水将步骤1)所得再生生物质的固液比调整为10％(w/v)，加入步骤2)的粗酶液，载酶量为5FPU/g，pH 4.8、50℃水解48h，结束后离心，得到水解清液，其中还原糖浓度为57.5g/L。将适量步骤1)的液相加入该含水解液中，将C/N摩尔比调整为250，于121℃下灭菌20min，备用。

4)微生物油脂的生产：挑取一环皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum GIM2.68接种于培养基(20g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、5g/L玉米浆)中，30℃振荡培养24h，获得种子液。将种子液接种至步骤3)中所述发酵培养基中，接种量5％(v/v)，28℃通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于5g/L时即可结束发酵，固液分离，收集菌体，使用有机溶剂提取其胞内油脂，最终得到生物量16.0g/L，油脂量9.9g/L，油脂含量61.9％(w/w)，油脂得率为0.21g/g。

实施例7

1)紫茎泽兰预处理：将紫茎泽兰自然干燥，机械粉碎过2mm筛，称取100g，加入2.5g/L的稀硝酸溶液使其固液比为10％(w/v)，搅拌均匀，在160℃预处理30min；结束后真空抽滤得预处理液0.6L，用0.4L去离子水分2次洗涤固相，并将预处理液与洗涤液合并，定容至1L，将硫酸含量调节至与预处理前相同；用所得液相再次预处理100g紫茎泽兰，重复上述步骤4次，最终得到1L液体以及285g固体。

2)纤维素酶粗酶液的制备：将绿色木霉T.viride CCTCC AF 93252在PDA固体培养基中培养7天，加无菌水洗涤纱布过滤，制备孢子悬液，接入种子培养基(15g/L葡萄糖、20g/L酵母浸膏)，30℃振荡培养48h，获得种子液。将种子液接入产酶培养基(30g/L无定形纤维素、5g/L硫酸铵、5g/L纤维二糖、1g/L吐温80、10mL/L步骤1)的液相)中，接种量5％(v/v)，在35℃下通气振荡培养，每隔12h补加10mL/L步骤1)的液相，发酵5天结束，固液分离，上清液即为粗酶液，其滤纸酶活力为30.1FPU/mL。

3)发酵培养基的制备：加水将步骤1)所得再生生物质的固液比调整为10％(w/v)，添加步骤2)的粗酶液，载酶量为10FPU/g，pH 4.8、50℃水解48h，结束后离心，得到水解清液，其中还原糖浓度为59.2g/L。将步骤1)的液相加入到该水解液中，调整C/N摩尔比100，于121℃下灭菌20min，备用。

4)微生物油脂的生产：挑取一环斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560接种于种子培养基(20g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、5g/L蛋白胨)中，28℃振荡培养40h，获得种子液。将种子液接种至步骤3)中所述发酵培养基中，接种量10％(v/v)，28℃通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于5g/L时即可结束发酵，固液分离，收集菌体，使用有机溶剂提取其胞内油脂，最终得到生物量18.1g/L，油脂量8.9g/L，油脂含量49.2％(w/w)，油脂得率为0.18g/g。

实施例8

1)草坪草预处理：将修剪草坪草晒干，粉碎过1mm筛，称取150g，与1L、加入5g/L的稀硝酸溶液混合均匀，调整固液质量比为15％(w/w)，在160℃预处理15min；预处理结束后真空抽滤得预处理液0.4L，用0.6L去离子水分2次洗涤固相，并将预处理液与洗涤液合并，定容至1L，将硫酸含量调节至与预处理前相同；用所得液相再次预处理150g草坪草，重复上述步骤3次，最终得到1L液体以及332g固体。

2)纤维素酶粗酶液的制备：将黑曲霉Aspergillus niger ATCC 16888在PDA固体培养基中培养6天，加无菌水洗涤纱布过滤，制备孢子悬液，接入种子培养基(10g/L纤维素、10g/L酵母提取物、10g/L葡萄糖、1.4g/L硫酸铵、2g/L磷酸二氢钾、0.4g/L氯化钙、0.3g/L七水硫酸镁)，30℃振荡培养24h，获得种子液。将种子液接入产酶培养基(30g/L无定形纤维素、5g/L硫酸铵、5g/L乳糖、2g/L吐温80、10mL/L步骤1)的液相)中，接种量2％(v/v)，在35℃下通气振荡培养，每隔12h补加10mL/L步骤1)的液相，发酵7天结束，固液分离，上清液即为粗酶液，其滤纸酶活力为49.4FPU/mL。

3)发酵培养基的制备：加水将步骤1)所得再生生物质的固液比调整为12％(w/v)，添加步骤2)的粗酶液，载酶量为5FPU/g，pH 4.8、50℃水解72h，水解结束后离心，得到水解清液，其中还原糖浓度为67.6g/L。将适量步骤1)的液相加入该水解液中，调整C/N摩尔比为140，于121℃下灭菌20min，备用。

4)微生物油脂的生产：挑取一环解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica Po1g接种于培养基(20g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、5g/L蛋白胨)中，30℃振荡培养24h，获得种子液。将种子液接种至步骤3)中所述发酵培养基中，接种量10％(v/v)，30℃通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于5g/L时即可结束发酵，固液分离，收集菌体，使用氯仿/甲醇有机溶剂抽提法提取其胞内油脂，最终得到生物量20.2g/L，油脂量11.4g/L，油脂含量56.4％(w/w)，油脂得率为0.20g/g。

实施例9

1)水葫芦预处理：将水葫芦自然干燥，分水过1mm筛，称取120g，加入8g/L的稀硫酸溶液混合均匀，调整固液比为12％(w/v)，在190℃预处理5min；结束后真空抽滤得预处理液0.45L，用0.5L去离子水分2次洗涤固相，并将预处理液与洗涤液合并，定容至1L，将硫酸含量调节至与预处理前相同；用所得液相再次预处理120g水葫芦，重复上述步骤3次，最终得到1L液体以及236g固体。

2)纤维素酶粗酶液的制备：将黑曲霉A.niger CCTCC AF 91005在PDA固体培养基中培养6天，加无菌水洗涤纱布过滤，制备孢子悬液，接入种子培养基(20g/L葡萄糖、10g/L酵母浸出物、5g/L硫酸铵)，25℃振荡培养72h，获得种子液。将种子液接入产酶培养基(30g/L预处理水葫芦、5g/L硫酸铵、5g/L槐糖、2g/L吐温80、10mL/L步骤1)的液相)中，接种量5％(v/v)，在25℃下通气振荡培养，每隔12h补加10mL/L步骤1)的液相，发酵7天结束，固液分离，上清液即为粗酶液，其滤纸酶活力为78.4FPU/mL。将粗酶液经过硫酸铵沉淀、喷雾干燥制成纤维素酶粉，作为商品酶。

3)发酵培养基的制备：加水将步骤1)所得再生生物质的固液比调整为12％(w/v)，添加步骤2)的纤维素酶，载酶量为20FPU/g，pH 4.8、50℃水解48h，结束后固液离心，得到水解清液，其中还原糖浓度为58.5g/L。将适量步骤1)的液相加入该水解液中，调整C/N摩尔比为70，于121℃下灭菌20min，备用。

4)微生物油脂的生产：将高山被孢霉Mortierella alpine ATCC 32222在PDA固体培养基中培养5天，加无菌水洗涤纱布过滤，制备孢子悬液，接入培养基(20g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、1g/L磷酸二氢钾、0.25g/L七水硫酸镁、10g/L硝酸钾)中，28℃振荡培养72h，获得种子液。将种子液接种至步骤3)中所述发酵培养基中，接种量10％(v/v)，25℃通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于5g/L时即可结束发酵，固液分离，收集菌体，使用有机溶剂提取其胞内油脂，最终得到生物量20.5g/L，油脂量10.8g/L，油脂含量52.7％(w/w)，油脂得率为0.21g/g。

实施例10

1)芦竹预处理：将芦竹晒干，机械粉碎过1mm筛，称取120g，添加10g/L的稀硝酸溶液混合均匀，调整固液比为12％(w/v)，在120℃预处理2h；结束后真空抽滤得预处理液0.5L，用0.5L去离子水分2次洗涤固相，并将预处理液与洗涤液合并，定容至1L，将硫酸含量调节至与预处理前相同；用所得液相再次预处理120g芦竹，重复上述步骤4次，最终得到1L液体以及315g固体。

2)纤维素酶粗酶液的制备：根据实施例1所述方法制备氏木霉Trichodermareesei Rut-C30种子液。将种子液接入产酶培养基(50g/L羧甲基纤维素、5g/L槐糖、2g/L吐温80、10mL/L痕量元素母液、10mL/L步骤1)的液相)中，接种量5％(v/v)，在28℃下通气振荡培养，每隔12h补加10mL/L步骤1)的液相，发酵7天结束，固液分离，上清液即为粗酶液，其滤纸酶活力为88.4FPU/mL。将粗酶液经超滤浓缩、添加100g/L的葡萄糖作为保护剂，制成溶液酶。

3)发酵培养基的制备：加水将步骤1)所得再生生物质的固液比调整为15％(w/v)，添加步骤2)的酶液，载酶量为5FPU/g，pH 4.8、50℃水解72h，酶水解结束后离心，得到水解清液，其中还原糖浓度为83.6g/L。将适量步骤1)的液相加入该水解液中，调整C/N摩尔比为350，于121℃下灭菌20min，备用。

4)微生物油脂的生产：将深黄被孢霉Mortierella isabellina NRRL 1757在PDA固体培养基中培养5天，加无菌水洗涤纱布过滤，制备孢子悬液，将孢子悬液接种于种子培养基(10g/L葡萄糖、1g/L硫酸铵、1.75g/L磷酸二氢钾、0.5g/L磷酸氢二钠、1.5g/L七水硫酸镁、10mL/L痕量元素母液)，28℃振荡培养48h，获得种子液。将种子液接种至步骤3)中所述发酵培养基中，接种量10％(v/v)，35℃通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于5g/L时即可结束发酵，固液分离，收集菌体，使用有机溶剂提取其胞内油脂，最终得到生物量24.3g/L，油脂量16.7g/L，油脂含量68.7％(w/w)，油脂得率为0.23g/g。

上述实施例和对比例结果如下表所示：

对比例1和对比例2是常规的生物质处理和油脂发酵的方案，主要过程是酸预处理生物质，然后通过添加纤维素酶进行水解，最后用产油微生物发酵获取微生物油脂。而实施例1-10采用的是本发明富氮生物质的综合利用方法，通过液相反复预处理，能够得到含高浓度有机氮源的液相和大量结构被破坏的再生生物质，液相作为纤维素酶合成的优质底物和补料培养基，能够发酵得到大量纤维素酶，且纤维素酶可用于再生生物质的酶水解液中，本发明实现了C/N比的调节，水解液中的碳水化合物主要被用于油脂合成，提高了油脂产量和得率。

通过比较对比例1、2和实施例1～10的实验结果发现，对比例1由于没有合理利用富氮生物质中的氮源，直接预处理后的生物质添加纤维素酶进行水解，因此需要另购纤维素酶，生产成本较高，而且水解液中的碳氮比不合适，使得油脂的产量和得率都较低。而对比例2中，预处理液相中氮源没有经过反复的酸处理，有机氮源浓度较低，且蛋白质没有充分水解为速效氮源氨基酸，在纤维素酶生产的补料培养基，效果较差。而实施例1-10，充分利用反复预处理富氮生物质得到的液相进行生产纤维素酶，纤维素酶部分直接用于预处理后再生生物质的水解，剩余纤维素酶可提纯为商品酶，提高了经济效益；而且富有氮源的液相添加于再生生物质的含糖水解液中，使得碳氮比在一个合适范围内，有利于油脂合成，通过结果也看出，实施例1-10的油脂量和油脂得率均有明显提高。本发明不仅大大降低了成本，同时显著提高了微生物油脂的产量和得率，以及纤维素酶的产量，具有显著的经济效益。

综上，本发明实现了富氮生物质中中碳水化合物彻底、高效地转化为微生物油脂和高含氮组分定向、高效利用制备纤维素酶，实现了富氮生物质中碳源和氮源营养的高效高值化利用，显著提高了生物质制油脂的技术经济性，具有显著的经济效益。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种利用富氮生物质产纤维素酶和油脂的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

步骤S1、将富氮生物质通过稀酸高温预处理，固液分离后得到固相和液相，其中固相加水洗涤并将洗涤水加入至液相中，液相补酸后返回用于富氮生物质预处理，重复操作若干次，得到含高浓度有机氮源的液相和大量结构被破坏的再生生物质；

步骤S2、将产酶真菌孢子悬液接种于种子培养基中培养，制备产酶真菌种子液并接入产酶培养基中进行发酵，发酵过程中周期性补加所述含高浓度有机氮源的液相，发酵结束后固液分离，得到的液相作为纤维素酶粗酶液；

步骤S3、将所述再生生物质加水调整固液比，然后加入一定量步骤S2得到的纤维素酶粗酶液进行酶水解，水解结束后固液分离获得的含糖水解液，含糖水解液中添加适量所述含高浓度有机氮源的液相调整C/N摩尔比，并调整pH值，作为发酵培养基，灭菌待用；

步骤S4、将产油微生物接种于种子培养基中培养，制备产油微生物种子液，将产油微生物种子液接种至步骤S3所述发酵培养基中培养，当发酵培养基中糖浓度低于设定阈值时，结束发酵；

步骤S5、固液分离收集含油菌体，提取胞内油脂。

2.如权利要求1所述利用富氮生物质产纤维素酶和油脂的方法，其特征在于，所述方法还包括下述步骤：

步骤S6、将纤维素酶粗酶液经过浓缩、添加保护剂制成溶液酶或者通过沉淀、喷雾干燥制成纤维素酶粉，作为商品酶。

3.如权利要求1所述利用富氮生物质产纤维素酶和油脂的方法，其特征在于，步骤S1中，所述富氮生物质成分含有纤维素、半纤维素、木质素和蛋白质。

4.如权利要求1所述利用富氮生物质产纤维素酶和油脂的方法，其特征在于，步骤S1中，所述稀酸为稀硫酸、稀盐酸或稀硝酸，稀酸浓度范围为1g/L～10g/L，预处理温度为120℃～190℃，预处理时间为5min～2h，预处理重复操作3-5次。

5.如权利要求1所述利用富氮生物质产纤维素酶和油脂的方法，其特征在于，步骤S1中，富氮生物质按照固液比5％～15％w/v与稀酸混合均匀，并在高温下进行预处理，这里w/v为质量体积比。

6.如权利要求1所述利用富氮生物质产纤维素酶和油脂的方法，其特征在于，步骤S2中，所述产酶真菌为经过发酵能高产纤维素酶的真菌，产酶真菌种子液按照接种量2％～10％v/v接入产酶培养基中进行发酵，这里v/v为体积比。

7.如权利要求1所述利用富氮生物质产纤维素酶和油脂的方法，其特征在于，步骤S3中，再生生物质加水调整固液比至8％～15％w/w，按照5～20FPU/g加入纤维素酶粗酶液进行酶水解，调整的C/N摩尔比至70～400并调节pH值至5～7，这里w/w为质量比。

8.如权利要求1所述利用富氮生物质产纤维素酶和油脂的方法，其特征在于，步骤S4中，所述产油微生物为经发酵培养后积累油脂含量超过细胞干重20％的产油酵母或霉菌，产油微生物种子液的接种量为5％～10％v/v，于25℃～35℃通气培养，当发酵培养基中糖浓度低于5g/L时，结束发酵。

Images