CN112662649A

CN112662649A - 小核菌胶水解酶突变体的制备及应用

Info

Publication number: CN112662649A
Application number: CN202110124102.4A
Authority: CN
Inventors: 曾伟主; 周景文; 单小玉; 陈坚; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2041-01-29
Also published as: CN112662649B

Abstract

本发明公开了小核菌胶水解酶突变体的制备及应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明提供了一系列小核菌胶水解酶突变体。突变体D36E、A76V、D144E、T161Y、S180D、D36E/D144E、D36E/S180D、D144E/S180D、D36E/D144E/S180D的小核菌胶水解酶活性比野生型分别提高了20.1％、14.2％、22.2％、15.6％、18.3％、51.4％、63.0％、48.6％、92.9％，对应的小核菌胶分子量比野生型分别降低了42.7％、30.7％、47.2％、32.9％、48.2％、55.2％、59.4％、57.4％、72.9％。小核菌胶的分子量的降低更有利于扩大其工业化应用范围。

Description

小核菌胶水解酶突变体的制备及应用

技术领域

本发明涉及小核菌胶水解酶突变体的制备及应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

小核菌胶(又称硬葡聚糖，scleroglucan)是一种非离子型的水溶性微生物胞外多糖，由β-1,3-吡喃葡萄糖和β-1,6-吡喃葡萄糖残基连接而成，平均每3个β-1,3糖苷键连接的主链单元连接1个β-1,6糖苷键的侧链。这种重复单元结构使小核菌胶分支度达0.33左右。小核菌胶除了具有大多数β-1,3葡聚糖共有的生物活性特征外，高分支化频率使其具有高水溶性特点。由于独特的化学结构和高分子量特性，小核菌胶具有良好的水溶性、假塑性、保湿性、耐盐性和粘度稳定性，广泛应用于食品、生物医药、石油化工和化妆品等行业。

目前，小核菌胶主要以微生物发酵的方式生产。齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)是最主要的生产菌株，其可以利用葡萄糖、蔗糖和糖蜜等进行发酵生产。针对齐整小核菌生产小核菌胶的研究主要集中在提高小核菌胶产量和产率等方面。小菌核属真菌发酵法生产的小核菌胶分子量较高，从而导致其溶解性、流动性、分散性较差，为其工业应用带来困难。选择合适的降解方法对小核菌胶进行改性，获得理想的分子量，在保持活性的基础上提高其水溶性，从而扩大其工业应用是目前亟待解决的问题。因此，获得一种水解活力提高且其它酶学性质不发生显著改变的小核菌胶水解酶，对于降低小核菌胶的分子量从而扩大小核菌胶的工业化应用范围具有重要意义。发明人所在团队在前期的研究工作中从Sclerotium rolfsii中筛选到一种内源的小核菌胶水解酶(记载于申请号为202011172161.0的专利申请文件中)，该酶具有能水解小核菌胶的能力，但酶活不能满足工业化的应用需求，对小核菌胶的水解作用有限，因此，需要进一步强化水解酶的活性，降低小核菌胶的分子量，从而扩大其工业化应用范围。

发明内容

基于上述现状，本发明利用基因工程和酶工程的手段，提高小核菌胶内源水解酶的活性，降低小核菌胶的分子量，为扩大其工业化应用创造条件。

本发明的第一个目的是提供酶活提高的小核菌胶水解酶突变体，是将Sclerotiumrolfsii来源的小核菌胶水解酶的第36位、76位、144位、161位或180位的一个或多个氨基酸进行突变后获得的突变体，这些突变体与其亲代的小核菌胶水解酶相比，酶活提高。

在一种实施方式中，所述Sclerotium rolfsii来源的小核菌胶水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述突变体是将第36位天冬氨酸(Asp)突变为谷氨酸(Glu)，突变体命名为D36E。

在一种实施方式中，所述突变体是将第76位丙氨酸(Ala)突变为缬氨酸(Val)，突变体命名为A76V。

在一种实施方式中，所述突变体是将第144位天冬酰胺(Asp)突变为谷氨酸(Glu)，突变体命名为D144E。

在一种实施方式中，所述突变体是将第161位苏氨酸(Thr)突变为酪氨酸(Tyr)，突变体命名为T161Y。

在一种实施方式中，所述突变体是将第180位丝氨酸(Ser)突变为天冬氨酸(Asp)，突变体命名为S180D。

在一种实施方式中，所述突变体是将第36位天冬氨酸(Asp)突变为谷氨酸(Glu)，并将第144位天冬酰胺(Asp)突变为谷氨酸(Glu)，突变体命名为D36E/D144E。

在一种实施方式中，所述突变体是将第144位天冬氨酸(Asp)突变为谷氨酸(Glu)，并将第180位丝氨酸(Ser)突变为天冬氨酸(Asp)，突变体命名为D36E/S180D。

在一种实施方式中，所述突变体是将第144位天冬酰胺(Asp)突变为谷氨酸(Glu)，并将第180位丝氨酸(Ser)突变为天冬氨酸(Asp)突变体命名为D36E/D144E。

在一种实施方式中，所述突变体是将第36位天冬氨酸(Asp)突变为谷氨酸(Glu)，并将第144位天冬酰胺(Asp)突变为谷氨酸(Glu)、将第180位丝氨酸(Ser)突变为天冬氨酸(Asp)，突变体命名为D36E/D144E/S180D。

在一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的质粒。

在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于pPIC9、pPIC9K、pHILD2、pPICZαA或pYAM75P。

本发明的第四个目的是提供表达所述小核菌胶水解酶的重组微生物细胞。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞为毕赤酵母。

在一种实施方式中，所述毕赤酵母包括但不限于P.pastoris Y11430、P.pastorisMG1003、P.pastoris GS115、P.pastoris KM71、P.pastoris SMD1168、P.pastoris JC系列。

在一种实施方式中，所述重组毕赤酵母利用pPIC9、pPIC9K、pHILD2、pPICZαA或pYAM75P表达所述小核菌胶水解酶突变体。

本发明还提供了一种产小核菌胶水解酶的方法，是将所述重组毕赤酵母在BMGY培养基中培养至OD₆₀₀＝2-6，每20～24h加入终浓度为0.2～0.6％的甲醇诱导。

在一种实施方式中，所述方法是将重组毕赤酵母接种至YPD培养基中，于20～30℃培养获得种子液，再将种子液接种至BMGY培养基中培养。

在一种实施方式中，所述种子液以1～5％的接种量转接。

本发明还提供了所述小核菌胶水解酶突变体在水解小核菌胶方面的应用。

在一种实施方式中，所述应用是将所述小核菌胶水解酶突变体加入至含小核菌胶的溶液环境中，于28～32℃反应至少6h。

本发明还要求保护所述小核菌胶水解酶突变体在食品、生物医药、石油化工、化妆品等行业中的应用。

有益效果：本发明提供了一系列小核菌胶水解酶酶活提高的突变体，在适当的培养条件下，突变体D36E、A76V、D144E、T161Y、S180D、D36E/D144E、D36E/S180D、D144E/S180D、D36E/D144E/S180D的小核菌胶水解酶活性比野生型分别提高了20.1％、14.2％、22.2％、15.6％、18.3％、51.4％、63.0％、48.6％、92.9％；小核菌胶分子量比野生型分别降低了42.7％、30.7％、47.2％、32.9％、48.2％、55.2％、65.6％、57.4％、72.9％。

具体实施方式

YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L。

BMGY培养基(1L)：酵母提取物10g，蛋白胨20g，K₂HPO₄ 3g，KH2PO4 11.8g，10×YNB溶液100mL(13.4g/L)，500×生物素1mL，甘油10mL；其中，500×生物素是生物素浓度为4×10^-4g/L的溶液。

BMMY培养基(1L)：酵母提取物10g，蛋白胨20g，K₂HPO₄ 3g，KH2PO4 11.8g，100×YNB溶液100mL(13.4g/L)，500×生物素1mL，甲醇5mL；其中，500×生物素是生物素浓度为4×10^-4g/L的溶液。

小核菌胶水解酶的酶活测定方法：每1mL反应液含粗酶液500μL、0.5％昆布多糖500μL和20mmol HAc-NaAc缓冲液(pH 6.0)，30℃水浴30min，加入1mL DNS溶液终止反应，100℃加热5min，冷却至室温，取上清测定OD₅₄₀，以灭活的酶作为对照计算酶活力。

1个酶活力单位定义为在反应条件下每分钟释放1.0μmol还原糖(以葡萄糖为标准)所需要的酶量。

实施例1：野生型小核菌胶水解酶的表达

将实验室前期构建保存的表达小核菌胶水解酶(GME9860)基因的毕赤酵母(公开号为CN112266907A的专利申请文件)在YPD平板活化后，挑取单菌落接种于装有2mL YPD培养基的试管中，30℃、220r/min培养24h，以2％接种量转接至含50mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，30℃、220r/min培养至OD₆₀₀＝2-6，离心收集菌体，生理盐水洗涤两次后，全部接入至含50mL BMMY培养基的250mL摇瓶中，30℃、220r/min培养，每24h向培养基中添加甲醇至终浓度为0.5％，培养120h后离心去菌体，上清即为粗酶液。经检测，粗酶液的酶活为8.64U/mL。

实施例2：小核菌胶水解酶单突变体的制备及表达

(1)小核菌胶水解酶突变体的构建

利用快速PCR技术，根据Sclerotium rolfsii的小核菌胶水解酶的基因序列(SEQID NO.1)，分别设计并合成引入D36E、A76V、D144E、T161Y、S180D的突变的引物对小核菌胶水解酶基因进行定点突变(下划线为突变碱基)。

引入序列D36E突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CGACTACGTGGGAGTGCTGCGAACCT-3’

反向引物：5’-AGGTTCGCAGCACTCCCACGAGTCG-3’

引入序列如A76V突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CAAAATGCCTGCTTTGTTAGCGGCGGAAAT-3’

反向引物：5’-ATTTCCGCCGCTAACAAAGCAGGCATTT-3’

引入序列如D144E突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-TTACCGCTACCGAATTCGATATTTACAC-3’

反向引物：5’-GTGTAAATATCGAATTCGGTAGCGGTAAT-3’

引入序列如T161Y突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CAACGCCTGCTACGCGCAGTACGGTG-3’

反向引物：5’-CACCGTACTGCGCGTAGCAGGCGTTG-3’

引入序列如S180D突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CGGAGGTGTCTCTGACGACTCTCAATGCG-3’

反向引物：5’-CGCATTGAGAGTCGTCAGAGACACCTCCGT-3’

PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimerStar HS(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。

PCR扩增条件为：94℃预变性5min；随后30个循环(98℃10s，55℃5s，72℃7min30s)；72℃继续延伸10min。

PCR产物经经验证正确后，用DpnⅠ消化后转化至大肠杆菌JM109感受态，将感受态细胞在LB固体培养基(含100mg/L氨苄青霉素)培养过夜后，挑克隆于含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基培养后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，所有突变质粒均测序正确。将10μg上述携带突变基因的质粒，分别通过电转化(转化电压：2000V；电容25μF；停留时间；5μs)至感受态毕赤酵母细胞中，筛选阳性克隆，获得重组菌株，分别命名为D36E、A76V、D144E、T161Y、S180D。

(2)突变体酶的表达

将步骤(1)筛选获得的阳性克隆挑取单菌落接种于装有2mL YPD培养基的试管中，30℃、220r/min培养24h，获得种子液；以2％接种量将种子液转接至含含50mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，30℃、220r/min培养至OD₆₀₀＝2-6，离心收集菌体，生理盐水洗涤两次后，全部接入至含50mL BMMY培养基的250mL摇瓶中，30℃、220r/min培养，每24h向培养基中添加甲醇至终浓度为0.5％，培养120h后离心去菌体，上清即为粗酶液。表达D36E、A76V、D144E、T161Y、S180D的重组毕赤酵母的粗酶液中酶活分别为10.38U/mL、9.87U/mL、10.56U/mL、9.99U/mL和10.22U/mL。

实施例3：小核菌胶水解酶的性能分析

小核菌胶水解能力的检测：1mL反应液含粗酶液500μL和500μL小核菌胶，30℃水浴6h，100℃沸水浴5min灭活，以灭活酶作对照，用高效液相色谱(HPGPC)测定多糖分子量。利用Shodex SB-806M HQ凝胶色谱柱检测，检测条件为：示差检测器，流动相0.1mol/L NaNO₃溶液，流速0.6mL/min，柱温40℃，进样量50μL。

野生型小核菌胶水解酶(WT)和突变体摇瓶培养120h粗酶液酶活及对小核菌胶水解能力列于表1，结果表明，各个突变体的酶活均高于野生型，对小核菌胶的水解能力增加，小核菌胶分子量得到有效降低。

表1野生型小核菌胶水解酶和单突变体酶的粗液酶酶活及对小核菌胶水解能力

实施例4：多突变体的制备和表达及酶的性能分析

分别以实施例2构建的突变体D36E、D144E、S180D的质粒作为双突变的模板，并根据实施例2设计的定点突变的引物，使用快速PCR技术，对携带编码突变体D36E、D144E、S180D的基因的质粒进行定点突变，构建多突变体D36E/D144E、D36E/S180D、D144E/S180D、D36E/D144E/S180D。分别测序确认小核菌胶水解酶多突变体的编码基因是否正确，并将测序结果正确的质粒导入毕赤酵母中进行表达，得到多突变小核菌胶水解酶。野生型小核菌胶水解酶(WT)和多突变体的按照实施例2的方法摇瓶培养120h，测定粗酶液酶活及对小核菌胶水解能力列于表2，结果表明，各个突变体的酶活均高于野生型，对小核菌胶的水解能力增加，小核菌胶分子量得到有效降低，水解后的小核菌胶分子量处于5×10⁶～1×10⁷Da之间，满足低分子量小核菌胶的生物、医药或化妆品中的应用需求。

表2野生型小核菌胶水解酶和多突变体酶的粗液酶酶活及对小核菌胶水解能力

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 小核菌胶水解酶突变体的制备及应用

<130> BAA201556A

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtatttct tctctctgaa aaccgctgtt cccactttgg ttgccattca gggcctcatt 60

accgctagtt tggcacaaac ttcgggtaca accacgacta cgtgggactg ctgcgaacct 120

gcctgcggat acacttccaa tctgtccccc ggtgccagtg gtcccgtcag atcatgcaac 180

gcaaataatg gtcctgctgc ctcaggcgcc caaaatgcct gctttgccag cggcggaaat 240

ctagcgttct cgtgctcgga ctaccagcct atcatcatca gcaatacgct cagctatgga 300

tttgctggtc acggagacac tgccacggat agctgctgca agtgttatca attcacctgg 360

acctcgggcg caggcgcagg aaagagtatg attgtccagg ccatcaacgc tggaggtatt 420

accgctaccg atttcgatat ttacacacct ggtggcggag ttggagacta caacgcctgc 480

acggcgcagt acggtgctcc gagccaaggc tggggtgccc agtacggagg tgtctcttcg 540

gactctcaat gcgacgagct cccctcggtt cttcaggctg gttgccactg gagatgggaa 600

tgggctggcg gaggaatcaa cgagtggacc atcgaatacg agcaagtcaa ttgcccatcc 660

gagctgacga gcatctcggg ctgctaccct gccagtatct aa 702

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgactacgtg ggagtgctgc gaacct 26

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aggttcgcag cactcccacg agtcg 25

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caaaatgcct gctttgttag cggcggaaat 30

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atttccgccg ctaacaaagc aggcattt 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttaccgctac cgaattcgat atttacac 28

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtgtaaatat cgaattcggt agcggtaat 29

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caacgcctgc tacgcgcagt acggtg 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caccgtactg cgcgtagcag gcgttg 26

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cggaggtgtc tctgacgact ctcaatgcg 29

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgcattgaga gtcgtcagag acacctccgt 30

Claims

1.小核菌胶水解酶突变体，其特征在于，是将Sclerotium rolfsii来源的小核菌胶水解酶的第36位、76位、144位、161位或180位的一个或多个氨基酸突变后获得的突变体。

2.根据权利要求1所述的小核菌胶水解酶突变体，其特征在于，所述Sclerotiumrolfsii来源的小核菌胶水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的小核菌胶水解酶突变体，其特征在于，在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，进行如下突变：

将第36位天冬氨酸突变为谷氨酸；或

将第76位丙氨酸突变为缬氨酸；或

将第144位天冬酰胺突变为谷氨酸；或

将第161位苏氨酸突变为酪氨酸；或

将第180位丝氨酸突变为天冬氨酸；或

将第36位天冬氨酸突变为谷氨酸，并将第144位天冬酰胺突变为谷氨酸；或

将第144位天冬氨酸突变为谷氨酸，并将第180位丝氨酸突变为天冬氨酸；或

将第144位天冬酰胺突变为谷氨酸，并将第180位丝氨酸突变为天冬氨酸；或

将第36位天冬氨酸突变为谷氨酸，并将第144位天冬酰胺突变为谷氨酸、将第180位丝氨酸突变为天冬氨酸。

4.编码权利要求1～3任一所述小核菌胶水解酶突变体的基因。

5.携带权利要求4所述基因的质粒。

6.表达权利要求1～3任一所述小核菌胶水解酶的重组微生物细胞。

7.一种重组毕赤酵母，其特征在于，以P.pastoris Y11430、P.pastoris MG1003、P.pastoris GS115、P.pastoris KM71、P.pastoris SMD1168或P.pastoris JC系列细胞为宿主，表达权利要求1～3任一所述的小核菌胶水解酶突变体。

8.一种产小核菌胶水解酶的方法，其特征在于，将权利要求7所述的重组毕赤酵母在BMGY培养基中培养至OD₆₀₀＝2-6，每20～24h加入终浓度为0.2～0.6％的甲醇诱导。

9.权利要求1～3任一所述的小核菌胶水解酶突变体在水解小核菌胶方面的应用。

10.权利要求1～3任一所述的小核菌胶水解酶突变体在食品、生物医药、石油化工或化妆品行业中的应用。