CN112656542A - 一种特定位点辅助囊胚孵化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特定位点辅助囊胚孵化的方法，通过显微操作使囊胚透明带融通形成通孔，使胚胎细胞从通孔出来完成胚胎孵化，孵化胚胎经胚胎移植后，得到出生个体。采用本方法得到的孵化胚胎经胚胎移植后，其胚胎发育到期的出生率比未做处理的正常胚胎显著提高，出生率高达77％。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术，特别涉及一种特定位点辅助囊胚孵化的方法。
背景技术
胚胎着床是指囊胚与处于接受态的子宫建立密切联系的复杂过程，主要包括游离囊胚的定位、黏附和侵入及胎盘形成，是一个连续不断的动态发育过程。而囊胚孵化是母-胎建立联系的先决条件，囊胚必须从透明带中孵出，才能着床，进而正常发育到出生。即使是具有良好发育潜能的胚胎，由于囊胚期孵化障碍也会导致妊娠失败。目前辅助孵化技术(assisted hatching)已被应用于人类临床，但其效果尚存争议。
辅助孵化技术(assisted hatching)是动物与人类繁殖技术中的一种辅助生殖技术，通过人工手段使胚胎细胞能从透明带中孵出，以提高动物胚胎着床及出生率的技术。以往主要采用激光或压电穿孔仪进行囊胚的辅助孵化，已在人类、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、猪和牛辅助生殖中应用，但也没有明确的技术有效性定论。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供可提高出生率的特定位点辅助囊胚孵化的方法。
技术方案：本发明提供一种特定位点辅助囊胚孵化的方法，通过显微操作使囊胚透明带融通形成通孔，使胚胎细胞从通孔出来完成胚胎孵化，孵化胚胎经胚胎移植后，得到出生个体。
进一步地，所述通孔的位置：将囊胚的内细胞团(ICM)定义为时钟12点位置，通孔位置为2至4点间位置或4至8点间位置或8至10点间位置。
进一步地，所述通孔的位置：3点位置或6点位置。
进一步地，所述显微操作包括改良酸性操作液、蛋白酶、压电穿孔仪或激光仪。
进一步地，所述改良酸性操作液以标准酸性台氏液为基础改良而成，即用1至4摩尔(M)盐酸(HCl)调制标准酸性台氏液PH至1至2范围而成。
进一步地，所述通孔直径为20-50μm。
有益效果：本发明通过显微操作方法在囊胚透明带特定位点使透明带融化、变薄乃至融通形成小孔，胚胎细胞可从透明带融通孔出来完成胚胎孵化，采用本方法得到的孵化胚胎经胚胎移植后，其胚胎发育到期的出生率比未做处理的正常胚胎显著提高，出生率高达77％。
附图说明
图1是酸性操作液在2至4点间位置辅助囊胚孵化过程；
图2酸性操作液辅助孵化囊胚与未经辅助孵化处理的胚胎出生率比较；
图3是采用压电穿孔仪在2至4点间位置辅助小鼠囊胚孵化；
图4是采用压电穿孔仪辅助孵化囊胚与未经辅助孵化处理的胚胎出生率比较。
具体实施方式
胚胎经体内或体外发育到囊胚，将囊转移到显微操作液滴中，用持卵针固定囊胚，采用显微操作完成特定位点的辅助孵化。显微操作包括采用改良酸性操作液(ModifiedAcidic Tyrode′s solution)见实施例1，采用压电穿孔仪(Piezo)见实施例2。完成辅助孵化操作的囊胚用培养液清洗后，转入培养液中培养，短暂培养后胚胎移植到同期发情的受体。
实施例1
(1)改良酸性操作液配制
改良酸性操作液以标准酸性台氏液为基础改良而成，即用1至4摩尔(M)盐酸(HCl)调制标准酸性台氏液PH至1至2范围而成。
(2)酸性操作液辅助小鼠囊胚孵化
小鼠胚胎经体内或体外发育到扩张囊胚，将囊胚转移到M2显微操作液滴中，用持卵针固定囊胚(图1A)，操作针在单独准备的液滴中吸取酸性操作液，然后将操作针开口对准目标孵化位置透明带，如将ICM位置定义为时钟12点位置，目标孵化位置可以是2-4(或对侧8-10)、4-8点位置；施加压力将酸性操作液从操作针开口缓慢排出，形成酸性操作液流，酸性操作液溶解目标区域透明带，目标区域透明带逐渐变薄，融通形成开孔(图1B，箭头之间位置)，完成辅助孵化操作的囊胚用KSOM培养液清洗后，转入KSOM培养液中培养30分钟，可见胚胎细胞已开始从辅助孵化位置孵出(图1C)。
(3)酸性操作液辅助孵化囊胚与未经辅助孵化处理囊胚的小鼠出生率比较
完成辅助孵化操作的囊胚用KSOM培养液清洗后，转入KSOM培养液中培养30分钟，然后进行胚胎移植。经显微外科术将辅助孵化孵化的囊胚移植到同期发情的受体鼠子宫中。未经辅助孵化处理的同时期囊胚作为移植对照，移植到同期发情的受体鼠子宫中。受体妊娠到19天时，行剖腹产术取出小鼠幼崽，记录小鼠出生率。经统计未经处理的囊胚(4.0dpc Blastocyst)出生率为36％，随机位点(AH random)辅助孵化囊胚出生率为59％，3点位置(3-site)辅助孵化囊胚出生率为77％，6点位置(6-site)辅助孵化囊胚出生率为55％，随机位点、3点和6点位置辅助孵化囊胚出生率显著(P＜0.05)高于未经处理的囊胚，3点位置辅助孵化囊胚出生率最高(P＜0.05)，如图2所示。
实施例2
(1)采用压电穿孔仪辅助小鼠囊胚孵化
小鼠胚胎经体内或体外发育到扩张囊胚，将囊胚转移到M2显微操作液滴中，用持卵针固定囊胚(图3A)，然后将操作针开口对准目标孵化位置透明带，如将ICM位置定义为时钟12点位置，目标孵化位置可以是2-4(或对侧8-10)、4-8点位置；触发压电穿孔仪(Peizo)动作在目标区域透明带形成小孔(图3B，箭头之间位置)，完成辅助孵化操作的囊胚用KSOM培养液清洗后，转入KSOM培养液中培养30分钟。
(2)采用压电穿孔仪孵化囊胚与未经辅助孵化处理囊胚的小鼠出生率比较
经显微外科术将辅助孵化孵化的囊胚移植到同期发情的受体鼠子宫中。未经辅助孵化处理的同时期囊胚作为移植对照，移植到同期发情的受体鼠子宫中。受体妊娠到19天时，行剖腹产术取出小鼠幼崽，记录小鼠出生率。经统计未经处理的囊胚(4.0dpcBlastocyst)出生率为32％，随机位点(AH random)辅助孵化囊胚出生率为43％，3点位置(3-site)辅助孵化囊胚出生率为49％，6点位置(6-site)辅助孵化囊胚出生率为42％(图4)。
Claims (6)
1.一种特定位点辅助囊胚孵化的方法，其特征在于：通过显微操作使囊胚透明带融通形成通孔，使胚胎细胞从通孔出来完成胚胎孵化，孵化胚胎经胚胎移植后，得到出生个体。
2.根据权利要求1所述的特定位点辅助囊胚孵化的方法，其特征在于：所述通孔的位置：将囊胚的内细胞团(ICM)定义为时钟12点位置，通孔位置为2至4点间位置或4至8点间位置或8至10点间位置。
3.根据权利要求2所述的特定位点辅助囊胚孵化的方法，其特征在于：所述通孔的位置：3点位置或6点位置。
4.根据权利要求1所述的特定位点辅助囊胚孵化的方法，其特征在于：所述显微操作包括改良酸性操作液、蛋白酶、压电穿孔仪或激光仪。
5.根据权利要求4所述的特定位点辅助囊胚孵化的方法，其特征在于：所述改良酸性操作液以标准酸性台氏液为基础改良而成，即用1至4摩尔(M)盐酸(HCl)调制标准酸性台氏液PH至1至2范围而成。
6.根据权利要求1所述的特定位点辅助囊胚孵化的方法，其特征在于：所述通孔直径为20-50μm。
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