CN112646875A - 用于重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤诊断的生物标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物标志物技术领域,涉及生物标志物在制备用于重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤诊断的试剂/试剂组中的用途。所述的生物标志物选自如下基因中的一种、多种或全部:Casp3;Fos;Tgfb2;Fgf17;Faslg;Dusp2;Fgf9;Cacng5;Relb;Gadd45b;Hspa1a;Fgf7;Rap1a;Pla2g4c;Cacna1i;Cacna1b;Myc;Pla2g4f;Hspb1;Jun;Cacna1c;Ddit3;Dusp8;Cacnb4;Cacna1f;Rasgrp2;Map4k2;Nr4a1;Rac3;Fgfr4;Map4k1;Cacna1d;Fgf8;Mapk11;Cd14。利用本发明的生物标志物在制备用于重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤诊断的试剂/试剂组中的用途,能够筛选出用于重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤诊断的生物标志物,并进行这些生物标志物影响的生物学功能与通路的分析。
Description
技术领域
本发明属于生物标志物技术领域,涉及生物标志物在制备用于重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤诊断的试剂/试剂组中的用途。
背景技术
金属铀具有独特的特性,包括高密度、高强度、硬度大、韧性好、易自燃、易提取、价格低廉。金属铀广泛用于快增殖堆的外包壳材料;飞机和叉车的平衡配重的材料;制作游艇的龙骨;丙烯和氨合成丙烯腈用的催化剂;高性能螺旋转子、惯性飞轮;钢铁冶炼及陶瓷工业的釉彩添加剂等。
但广泛应用的同时,金属铀的高毒性由于其未知的病原学因素导致恶性疾病和大量的不适症状。化学毒性是金属铀的主要危害,金属铀的化学毒性和放射毒性在机体受损伤的过程中可能发挥相互促进的作用,尤其是在肿瘤的发生和发展过程中。金属铀可能会影响关于生物体的解毒作用、氧化应激、DNA损伤、修复,影响胆碱能系统和谷氨酸能的基因表达。金属铀的细胞毒性依赖于以下几点:细胞类型、种属以及金属铀溶解度。
研究表明,无论是从人类流行病学调查的成果,还是动物体内试验分析的数据,两者的结果都从多个方面证实金属铀可以影响并降低生物体的生殖和遗传功能,暴露于金属铀对生物体具有显著的生殖和遗传毒性。
发明内容
本发明的目的是提供生物标志物在制备用于重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤诊断的试剂/试剂组中的用途,以能够筛选出用于重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤诊断的生物标志物,并进行这些生物标志物影响的生物学功能与通路的分析。
为实现此目的,在基础的实施方案中,本发明提供生物标志物在制备用于重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤诊断的试剂/试剂组中的用途,所述的生物标志物选自如下基因中的一种、多种或全部:
Casp3;Fos;Tgfb2;Fgf17;Faslg;Dusp2;Fgf9;Cacng5;Relb;Gadd45b;Hspa1a;Fgf7;Rap1a;Pla2g4c;Cacna1i;Cacna1b;Myc;Pla2g4f;Hspb1;Jun;Cacna1c;Ddit3;Dusp8;Cacnb4;Cacna1f;Rasgrp2;Map4k2;Nr4a1;Rac3;Fgfr4;Map4k1;Cacna1d;Fgf8;Mapk11;Cd14。
在一种优选的实施方案中,本发明提供生物标志物在制备用于重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤诊断的试剂/试剂组中的用途,其中所述的重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤为硝酸铀酰致卵巢细胞凋亡损伤。
在一种优选的实施方案中,本发明提供生物标志物在制备用于重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤诊断的试剂/试剂组中的用途,其中所述的重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤为硝酸铀酰单次体外染毒致卵巢细胞凋亡损伤。
在一种更加优选的实施方案中,本发明提供生物标志物在制备用于重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤诊断的试剂/试剂组中的用途,其中所述的硝酸铀酰的浓度为50-500μM。
在一种更加优选的实施方案中,本发明提供生物标志物在制备用于重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤诊断的试剂/试剂组中的用途,其中所述的硝酸铀酰的浓度为500μM。
本发明的有益效果在于,利用本发明的生物标志物在制备用于重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤诊断的试剂/试剂组中的用途,能够筛选出用于重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤诊断的生物标志物,并进行这些生物标志物影响的生物学功能与通路的分析。
本发明建立了重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤模型,利用基因测序技术寻找重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤差异基因,并通过GO和KEGG对差异基因进行功能分析,明确了重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤基因对机体生物功能和通路,为重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤的发现与解释提供了参考。
本发明在试验中验证卵巢细胞形态、凋亡和周期,试验表明重金属铀致卵巢细胞损伤后,细胞形态明显改变,细胞凋亡和周期结果说明该模型对卵巢细胞造成诱导凋亡。
附图说明
图1为50μmol/L染毒组细胞20倍显微镜下的观察结果。
图2为100μmol/L染毒组细胞20倍显微镜下的观察结果。
图3为300μmol/L染毒组细胞20倍显微镜下的观察结果。
图4为500μmol/L染毒组细胞20倍显微镜下的观察结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。
实施例1:
1、细胞培养与染毒
仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)贴壁生长于25cm2培养瓶中,加90%F-12K培养基,10%FBS胎牛血清、1%青链霉素的F-12K完全培养液5ml,于5%CO2,37℃细胞培养箱中孵育。接种5*104细胞于培养瓶中,每天观察细胞状态,每2-3天给予传代,以保持细胞活力状态。CHO-K1细胞指数生长期的倍增时间约为8-12小时,贴壁生长效率高。
染毒溶液为浓度为500μmol/L的硝酸铀酰。使用CO2培养箱37℃孵育培养染毒24h。用试剂检测对照组和实验组细胞的存活率,通过流式细胞仪检测对照组和实验组细胞的凋亡周期变化情况。在显微镜下观察对照组和实验组细胞形态的改变。两组细胞基因转录组测序。
2、差异筛选
在筛选差异基因之前,先进行探针过滤,在分组的每组样本中至少有一组100%标记为“P”的探针留下进行后续分析。对于有生物学重复的分析,利用T检验得到的差异显著性P值和标准化信号值的差异倍数Fold change值进行筛选,标准为Fold change值>=2.0且P值<=0.01。对于没有生物学重复的分析,仅利用差异倍数Fold change值进行筛选,标准为Fold change值>=2.0。
3、GO分析
对差异基因进行GO分析,从而对这个基因的功能进行描述。GO包括三大板块,Biological Process,Cellular Component和Molecular Function,所以有三类结果。统计每个GO条目中所包括的差异基因个数,并用统计检验的方法计算每个GO条目中差异基因富集的显著性。计算的结果会返回一个富集显著性的P值,小的p值表示差异基因在该GO条目中出现了富集。可以根据GO分析的结果结合生物学意义从而挑选用于后续研究的基因。
4、KEGG分析
利用KEGG数据库对差异基因进行Pathway分析,并且用统计检验的方法计算每个Pathway条目中差异基因富集的显著性。计算的结果会返回一个富集显著性的P值,小的P值表示差异基因在该Pathway中出现了富集。Pathway分析对实验结果有提示的作用,通过差异基因的Pathway分析,可以找到富集差异基因的Pathway条目,寻找不同样品的差异基因可能和哪些细胞通路的改变有关。
5、实验结果
(1)细胞存活、凋亡和形态变化
实验结果表明染毒浓度选择为0μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,300μmol/L,500μmol/L,不同浓度暴露于仓鼠卵巢细胞后,发现随着染毒剂量增加细胞存活率迅速降低。
在流式细胞仪上对样本进行细胞凋亡检测,观察不同染毒组0μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,300μmol/L,500μmol/L细胞凋亡情况,并获得相应数据。C1区域的细胞主要为坏死的细胞,也可能有少数的晚期凋亡细胞,甚至机械损伤细胞;C2区域为晚期凋亡细胞;C3此区域的细胞为活细胞;C4区域为早期凋亡的细胞。分析数据得知,随着染毒剂量的增加,C4期早期凋亡的细胞出现的数量显著的增多,可以认为随着贫铀染毒剂量的增加,严重影响染毒组细胞出现了显著的早期凋亡现象。
各剂量50μmol/L,100μmol/L,300μmol/L,500μmol/L染毒组细胞20倍显微镜下的表现分别见图1-4。可见随着染毒剂量的增加,细胞出现了明显的汇集成团的现象,细胞边界模糊不清,细胞不成形。
(2)差异基因筛选
利用T检验得到的差异显著性P值和标准化信号值的差异倍数Fold change值进行筛选,标准为Fold change值>=2.0且P值<=0.01。试验中共筛选得到差异基因31条,其中上调29条,下调2条,详细结果见表1。
表1重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤差异基因筛选结果
(3)差异基因GO分析
对差异基因进行GO分析,从而对这个基因的功能进行描述。GO包括三大板块,Biological Process,Cellular Component和Molecular Function。用统计检验的方法计算每个GO条目中差异基因富集的显著性。选取P值<0.01的结果,结果表明,重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤差异基因涉及的生物过程有8项,涉及的细胞组分有6项,涉及的分子功能有6项,具体结果详见表2。
表2重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤差异基因GO分析结果
(4)差异基因KEGG分析
利用KEGG数据库对差异基因进行Pathway分析,并且用统计检验的方法计算每个Pathway条目中差异基因富集的显著性。选取P值<0.01的结果,结果表明,重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤差异基因涉及的通路有7条,7条通路主要有内质网蛋白加工蛋白质输出、碳水化合物消化吸收、Fc epsilon RI信号通路、牛磺酸和次牛磺酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢,具体结果详见表3。
表3重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤差异基因KEGG分析结果
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明,本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施,而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此,描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明,任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。
Claims (5)
1.生物标志物在制备用于重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤诊断的试剂/试剂组中的用途,其特征在于,所述的生物标志物选自如下基因中的一种、多种或全部:
Casp3;Fos;Tgfb2;Fgf17;Faslg;Dusp2;Fgf9;Cacng5;Relb;Gadd45b;Hspa1a;Fgf7;Rap1a;Pla2g4c;Cacna1i;Cacna1b;Myc;Pla2g4f;Hspb1;Jun;Cacna1c;Ddit3;Dusp8;Cacnb4;Cacna1f;Rasgrp2;Map4k2;Nr4a1;Rac3;Fgfr4;Map4k1;Cacna1d;Fgf8;Mapk11;Cd14。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述的重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤为硝酸铀酰致卵巢细胞凋亡损伤。
3.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于:所述的重金属铀致卵巢细胞凋亡损伤为硝酸铀酰单次体外染毒致卵巢细胞凋亡损伤。
4.根据权利要求3所述的用途,其特征在于:所述的硝酸铀酰的浓度为50-500μM。
5.根据权利要求3所述的用途,其特征在于:所述的硝酸铀酰的浓度为500μM。
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