CN112646796A - 耐热β-半乳糖苷酶的制备 - Google Patents
耐热β-半乳糖苷酶的制备 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112646796A CN112646796A CN202110043840.6A CN202110043840A CN112646796A CN 112646796 A CN112646796 A CN 112646796A CN 202110043840 A CN202110043840 A CN 202110043840A CN 112646796 A CN112646796 A CN 112646796A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- enzyme
- plasmid
- 15min
- galactosidase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
- C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及耐热β‑半乳糖苷酶的制备，酶基因序列(β‑galactosidase，GenBank:NT_166518.1)在第2010位上发生突变，由原来的A分别突变为C，其有益效果在于，获得的突变β‑半乳糖苷酶最适反应温度大大提高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及耐热β-半乳糖苷酶的制备。
背景技术
乳糖不耐症是一种乳糖消化不良疾病，主要原因是生物体内缺乏乳糖酶或其活性较低，乳糖不能被乳糖酶水解成单糖，人体无法吸收，我国成年人乳糖吸收不良的发病率高达86.7％。
乳糖酶又称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，可将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，乳糖酶的应用领域很广，在医药、乳制品、免疫分析检测、化学合成、生物、环保领域都有应用。目前公认制备乳糖酶比较安全的菌株主要有益生菌、乳酸克鲁维酵母、米曲霉、黑曲霉、脆壁克鲁维酵母。
国内外已经对乳糖酶进行了大量的研究工作，但尚未得到广泛应用，主要原因有：1.乳糖酶的单位产量较低；2.市场上的乳糖酶多为胞内酶，需破碎细胞才能得到，提取纯化工艺复杂，成本高；3.酶的作用温度低、耐热性差，工业生产中容易染杂菌，适用范围窄。本研究主要通过提高乳糖酶的酶活，解决乳糖酶的成本问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐热β-半乳糖苷酶的制备方法，使得β-半乳糖苷酶的最佳作用温度有很大的提高，其具有更高的应用潜力和经济价值。
本发明的制备过程如下：
1.从NCBI上获得β-半乳糖苷酶序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)，交生物公司合成，设计PCR引物F:5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，PCR反应结束后，加20μlCloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切pET20b(+)质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliJM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coli BL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；
2.质粒DNA的提取
将携带有质粒pET20b(+)/β-galactosidase的E.coli BL21基因工程菌接种于LB/Am p(Amp终浓度100μg/mL)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；
3.易错PCR扩增与突变文库的构建
以步骤2获得的质粒为模板，用NotⅠ酶切使质粒线性化，用引物序列5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRa TaqBuffer，dNTPs Mixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA 200ng，Taq DNA聚合酶2.5U，5mmol/LMn2+，0.5U/μl的Taq DNA聚合酶2.5μl，7mmol/L的Mg2+,PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli BL21；
4.突变文库的高通量筛选
将步骤3得到的转化E.coli BL21，37℃孵育1h后收集菌体涂布氨苄青霉素抗性培养基(100μg/mL)，37℃温育12h，将平板上菌落分别刮取，接种至含100μg/mL氨苄青霉素的100mL LB培养基中，37℃振荡培养14h后提取混合质粒，混合质粒经XbaⅠ酶切后电击转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板，待MD平板上出现菌落后，将菌落挑至涂有X-gal的MM培养基上，使X-gal变蓝的菌株即为阳性突变体，挑取阳性菌株接种于48孔培养板中，每孔加入YPD培养基500μL、2％接种量，于28℃、200r/min培养48h，离心收集菌体以500μL BMMY培养基重悬菌体，28℃、200r/min培养48h，每12h补加甲醇至终浓度为0.5％，诱导结束后离心取上清即为粗酶液；
5.酶蛋白纯化
配制AKTA使用的缓冲液，其中A液：20mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH7.5)，B液：1mol/L氯化钠溶液(20mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH7.5)，以5倍柱床体积的A液平衡柱子后，粗酶液经A液流入captorQ(1mL)阴离子柱中，通过B液进行梯度洗脱：以5倍柱床体积的11％的B液洗脱杂蛋白，再以5％B液洗脱目的蛋白；
6.粗酶液中蛋白含量的测定
标准曲线绘制：以牛血清蛋白(BSA)为标准品，配置10mg/mL BSA母液，稀释为以下几个梯度：10.0mg/mL、8.0mg/mL、6.0mg/mL、4.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL，取不同浓度BSA溶液或超纯水40μL，加入5倍稀释后的Bio-Rad考马斯亮蓝蛋白染液260μL，震荡混匀后室温静置15min，取200μL加入酶标板中，于595nm下测定吸光度，记录数值，绘制标准曲线，取粗酶液或纯化后的酶液40μL，加入稀释后染液260μL，混匀后室温静置15min，取200μL加入酶标板中于595nm下测定吸光度，记录数值，根据标准曲线计算酶液的蛋白浓度；
7.酶活及比活力测定
配制不同浓度对硝基苯酚溶液(浓度分别为0.01mmol/L、0.02mmol/L、0.03mmol/L、0.04mmol/L、0.05mmol/L、0.06mmol/L、0.07mmol/L、0.08mmol/L、0.09mmol/L和0.1mmol/L)，定容至10mL，各取2mL，加入2mL 1mol/L Na2CO3溶液显色，420nm波长下测定吸光度值，做对硝基苯酚-光密度标准曲线；
将200μL稀释的酶液加入到800μL2.5g/L经预热的ONPG(pH6.5，1mM磷酸钾缓冲液)溶液中，在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下反应10min，加入1mL 10％Na2CO3溶液终止反应，于420nm测定吸光值，空白以灭活的酶液代替有活性酶液，假设标准曲线为Y＝aX+b；
E:酶活，单位U/mL
t:反应时间
N:酶液稀释倍数
V2：反应终体积
V1：酶液添加量
8.将比活最高的突变子，送生物公司测序。
本发明的有益效果是：
获得的突变β-半乳糖苷酶最适反应温度大大提高
附图说明
图1易错PCR电泳图
图2蛋白标准曲线
图3对硝基苯酚-光密度标准曲线
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1
本实施例涉及的材料和试剂见表1，实验仪器见表2；
表1实验材料和试剂
| E.coli T-A克隆载体pET20b(+) | 上海联迈生物工程有限公司 |
| 质粒小提试剂盒 | 天根生化科技有限公司 |
| 氨苄青霉素 | 上海通蔚生物有限公司 |
| 考马斯亮蓝R-250 | 北京索莱宝科技有限公司 |
| 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 | 大连宝生物工程有限公司 |
| 限制性内切酶 | 大连宝生物工程有限公司 |
| Taq酶 | 大连宝生物工程有限公司 |
| In-Fusion Cloning试剂盒 | 大连宝生生物工程有限公司 |
| 酵母粉 | Dxoid Ltd.England |
| 胰蛋白胨 | Dxoid Ltd.England |
| 酵母氮源 | NEB |
| 巴斯德毕赤酵母GS115 | Invitrogen公司 |
| 邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷 | Applichem公司 |
表2实验仪器设备
LB培养基配方:胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl 10g/l，pH7.0；
固体LB培养基：每100mL液体LB培养基加2g琼脂粉，高压灭菌；
YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，pH6.0；
MD固体培养基：0.00004％Biotin，1.34％YNB，2％葡萄糖，1.5％琼脂糖；
MM固体培养基：0.00004％Biotin，1.34％YNB，0.5％甲醇，1.5％琼脂糖；
BMMY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，0.3％K2HPO4,1.18％KH2PO4，1.34％YNB，0.5％甲醇(V/V)，0.00004％Biotin；
PTM微量盐：0.6％CuSO4，0.008％NaI2，0.3％MnSO4，0.02％Na2MoO4，0.002％H3BO3，0.05％CoCl2，2％ZnCl2，6.5％FeSO4，0.5％硫酸(V/V)；
酵母发酵基础盐培养基：0.5％KH2PO4，5％NH4H2PO4，1.485％MgSO4，1.82％K2SO4，0.093％CaSO4，0.15％KOH，0.00011％Biotin，0.44％PTM微量盐，2％葡萄糖；
酵母发酵基础盐诱导培养基：0.5％KH2PO4，5％NH4H2PO4，1.485％MgSO4，1.82％K2SO4，0.093％CaSO4，0.15％KOH，0.00011％Biotin，0.44％PTM微量盐，0.5％甲醇；
IPTG储存液(200mg/mL):用去离子水配制成200mg/mL异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，用0.22μm过滤器过滤除菌，分装成每管1mL，贮存于-20℃；
氨苄青霉素储存液(200mg/mL)：用去离子水配制成200mg/mL的氨苄青霉素(Amp)贮存液，用0.22μm过滤器过滤除菌，分装成每管1mL，贮存于-20℃；
50×TAE电泳缓冲液：Tris 242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/L EDTA(pH8.0)100mL，用蒸馏水定容至1L；
琼脂糖溶液(1.2％)：称取0.60g琼脂糖，溶解于50mL巴比妥钠-HCl缓冲液中；
1.从NCBI上获得β-半乳糖苷酶序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)，交生物公司合成，设计PCR引物F:5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，PCR反应结束后，加20μlCloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切pET20b(+)质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliJM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coli BL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；
2.质粒DNA的提取
将携带有质粒pET20b(+)/β-galactosidase的E.coli BL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/mL)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；
3.易错PCR扩增与突变文库的构建
以步骤2获得的质粒为模板，用NotⅠ酶切使质粒线性化，用引物序列5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，进行易错PCR扩增基因(见图1)，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRa Taq Buffer，dNTPs Mixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA 200ng，Taq DNA聚合酶2.5U，5mmol/L Mn2+，0.5U/μl的Taq DNA聚合酶2.5μl，7mmol/L的Mg2+,PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli BL21；
4.突变文库的高通量筛选
将步骤3得到的转化E.coli BL21，37℃孵育1h后收集菌体涂布氨苄青霉素抗性培养基(100μg/mL)，37℃温育12h，将平板上菌落分别刮取，接种至含100μg/mL氨苄青霉素的100mL LB培养基中，37℃振荡培养14h后提取混合质粒，混合质粒经XbaⅠ酶切后电击转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板，待MD平板上出现菌落后，将菌落挑至涂有X-gal的MM培养基上，使X-gal变蓝的菌株即为阳性突变体，挑取阳性菌株接种于48孔培养板中，每孔加入YPD培养基500μL、2％接种量，于28℃、200r/min培养48h，离心收集菌体以500μL BMMY培养基重悬菌体，28℃、200r/min培养48h，每12h补加甲醇至终浓度为0.5％，诱导结束后离心取上清即为粗酶液；
5.酶蛋白纯化
配制AKTA使用的缓冲液，其中A液：20mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH7.5)，B液：1mol/L氯化钠溶液(20mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH7.5)，以5倍柱床体积的A液平衡柱子后，粗酶液经A液流入captorQ(1mL)阴离子柱中，通过B液进行梯度洗脱：以5倍柱床体积的11％的B液洗脱杂蛋白，再以5％B液洗脱目的蛋白；
6.粗酶液中蛋白含量的测定
标准曲线绘制：以牛血清蛋白(BSA)为标准品，配置10mg/mL BSA母液，稀释为以下几个梯度：10.0mg/mL、8.0mg/mL、6.0mg/mL、4.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL，取不同浓度BSA溶液或超纯水40μL，加入5倍稀释后的Bio-Rad考马斯亮蓝蛋白染液260μL，震荡混匀后室温静置15min，取200μL加入酶标板中，于595nm下测定吸光度，记录数值，绘制标准曲线(见图2)，取粗酶液或纯化后的酶液40μL，加入稀释后染液260μL，混匀后室温静置15min，取200μL加入酶标板中于595n m下测定吸光度，记录数值，根据标准曲线计算酶液的蛋白浓度(见表3)；
表3酶液蛋白浓度(mg/mL)
7.酶活及比活力测定
配制不同浓度对硝基苯酚溶液(浓度分别为0.01mmol/L、0.02mmol/L、0.03mmol/L、0.04mmol/L、0.05mmol/L、0.06mmol/L、0.07mmol/L、0.08mmol/L、0.09mmol/L和0.1mmol/L)，定容至10mL，各取2mL，加入2mL 1mol/L Na2CO3溶液显色，420nm波长下测定吸光度值，做对硝基苯酚-光密度标准曲线(图3)，酶活标准曲线为y＝0.0498x-0.0505R2＝0.9991；
将200μL稀释的酶液加入到800μL2.5g/L经预热的ONPG(pH6.5，1mM磷酸钾缓冲液)溶液中，在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下反应10min，加入1mL 10％Na2CO3溶液终止反应，于420nm测定吸光值，空白以灭活的酶液代替有活性酶液；
E:酶活，单位U/mL
t:反应时间
N:酶液稀释倍数
V2：反应终体积
V1：酶液添加量
表4乳糖酶比酶活
8.将比酶活最高的突变子，送生物公司测序(见表5)。
表5比酶活最高突变子序列与野生型序列对比
本发明获得了突变体最适温度提高了20℃，具有更好的工业应用价值。
Claims (2)
1.耐热β-半乳糖苷酶的制备，其特征在于，所述酶基因序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)在第2010位，由原来的A分别突变为C，构建方法包括以下步骤：
1)从NCBI上获得β-半乳糖苷酶序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)，交生物公司合成，设计PCR引物F:5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，PCR反应结束后，加20μlCloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切pET20b(+)质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliJM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coli BL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；
2)质粒DNA的提取
将携带有质粒pET20b(+)/β-galactosidase的E.coli BL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/mL)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；
3)易错PCR扩增与突变文库的构建
以步骤2获得的质粒为模板，用NotⅠ酶切使质粒线性化，用引物序列5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRa TaqBuffer，dNTPs Mixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA 200ng，Taq DNA聚合酶2.5U，5mmol/LMn2+，0.5U/μl的Taq DNA聚合酶2.5μl，7mmol/L的Mg2+,PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli BL21；
4)突变文库的高通量筛选
将步骤3得到的转化E.coli BL21，37℃孵育1h后收集菌体涂布氨苄青霉素抗性培养基(100μg/mL)，37℃温育12h，将平板上菌落分别刮取，接种至含100μg/mL氨苄青霉素的100mLLB培养基中，37℃振荡培养14h后提取混合质粒，混合质粒经XbaⅠ酶切后电击转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板，待MD平板上出现菌落后，将菌落挑至涂有X-gal的MM培养基上，使X-gal变蓝的菌株即为阳性突变体，挑取阳性菌株接种于48孔培养板中，每孔加入YPD培养基500μL、2％接种量，于28℃、200r/min培养48h，离心收集菌体以500μL BMMY培养基重悬菌体，28℃、200r/min培养48h，每12h补加甲醇至终浓度为0.5％，诱导结束后离心取上清即为粗酶液；
5)酶蛋白纯化
配制AKTA使用的缓冲液，其中A液：20mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH7.5)，B液：1mol/L氯化钠溶液(20mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH 7.5)，以5倍柱床体积的A液平衡柱子后，粗酶液经A液流入captorQ(1mL)阴离子柱中，通过B液进行梯度洗脱：以5倍柱床体积的11％的B液洗脱杂蛋白，再以5％B液洗脱目的蛋白；
6)粗酶液中蛋白含量的测定
标准曲线绘制：以牛血清蛋白(BSA)为标准品，配置10mg/mL BSA母液，稀释为以下几个梯度：10.0mg/mL、8.0mg/mL、6.0mg/mL、4.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL，取不同浓度BSA溶液或超纯水40μL，加入5倍稀释后的Bio-Rad考马斯亮蓝蛋白染液260μL，震荡混匀后室温静置15min，取200μL加入酶标板中，于595nm下测定吸光度，记录数值，绘制标准曲线，取粗酶液或纯化后的酶液40μL，加入稀释后染液260μL，混匀后室温静置15min，取200μL加入酶标板中于595nm下测定吸光度，记录数值，根据标准曲线计算酶液的蛋白浓度；
7)酶活及比活力测定
配制不同浓度对硝基苯酚溶液(浓度分别为0.01mmol/L、0.02mmol/L、0.03mmol/L、0.04mmol/L、0.05mmol/L、0.06mmol/L、0.07mmol/L、0.08mmol/L、0.09mmol/L和0.1mmol/L)，定容至10mL，各取2mL，加入2mL 1mol/L Na2CO3溶液显色，420nm波长下测定吸光度值，做对硝基苯酚-光密度标准曲线；
将200μL稀释的酶液加入到800μL2.5g/L经预热的ONPG(pH6.5，1mM磷酸钾缓冲液)溶液中，在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下反应10min，加入1mL 10％Na2CO3溶液终止反应，于420nm测定吸光值，空白以灭活的酶液代替有活性酶液，假设标准曲线为Y＝aX+b；
E:酶活，单位U/mL
t:反应时间
N:酶液稀释倍数
V2：反应终体积
V1：酶液添加量
8)将比活最高的突变子，送生物公司测序。
2.根据权利要求1所述的耐热β-半乳糖苷酶的应用，其特征在于，所述的耐热β-半乳糖苷酶应用于医药、乳制品、免疫分析检测、化学合成、生物、环保领域。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110043840.6A CN112646796A (zh) | 2021-01-13 | 2021-01-13 | 耐热β-半乳糖苷酶的制备 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110043840.6A CN112646796A (zh) | 2021-01-13 | 2021-01-13 | 耐热β-半乳糖苷酶的制备 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112646796A true CN112646796A (zh) | 2021-04-13 |
Family
ID=75368327
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110043840.6A Withdrawn CN112646796A (zh) | 2021-01-13 | 2021-01-13 | 耐热β-半乳糖苷酶的制备 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112646796A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1778928A (zh) * | 2005-10-11 | 2006-05-31 | 山东大学 | 一种转糖基α一半乳糖苷酶基因 |
| CN102250856A (zh) * | 2011-06-23 | 2011-11-23 | 江南大学 | 一种耐热β-半乳糖苷酶突变体的构建 |
| CN105950589A (zh) * | 2016-07-21 | 2016-09-21 | 江南大学 | 一种具有转糖苷活性耐热β-半乳糖苷酶突变体及其制备方法 |
| CN111363731A (zh) * | 2020-04-17 | 2020-07-03 | 马金佑 | 高活性的葡萄糖氧化酶的制备和应用 |
| CN111500554A (zh) * | 2020-04-24 | 2020-08-07 | 梁泸月 | 高活性的β-木糖苷酶的制备和应用 |
-
2021
- 2021-01-13 CN CN202110043840.6A patent/CN112646796A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1778928A (zh) * | 2005-10-11 | 2006-05-31 | 山东大学 | 一种转糖基α一半乳糖苷酶基因 |
| CN102250856A (zh) * | 2011-06-23 | 2011-11-23 | 江南大学 | 一种耐热β-半乳糖苷酶突变体的构建 |
| CN105950589A (zh) * | 2016-07-21 | 2016-09-21 | 江南大学 | 一种具有转糖苷活性耐热β-半乳糖苷酶突变体及其制备方法 |
| CN111363731A (zh) * | 2020-04-17 | 2020-07-03 | 马金佑 | 高活性的葡萄糖氧化酶的制备和应用 |
| CN111500554A (zh) * | 2020-04-24 | 2020-08-07 | 梁泸月 | 高活性的β-木糖苷酶的制备和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 尹蕾等: "耐热β-半乳糖苷酶(Pyrococcus furiosus DSM 3638)活性位点N415S点突变对其酶活性的影响", 《山东大学学报. 理学版》 * |
| 无: "Accession. NT_166518.1, Aspergillus niger CBS 513.88 supercontig An01", 《GENBANK》 * |
| 董艺凝 等: "嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）来源耐热β-半乳糖苷酶BgaB转糖苷催化活性改造", 《食品与发酵工业》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105624077B (zh) | 一种顺序酶表面共展示系统及其应用 | |
| CN113088528B (zh) | 一种α-L-鼠李糖苷酶突变酶的应用 | |
| CN110358754B (zh) | 一种提高毕赤酵母表面展示β-葡萄糖醛酸苷酶活性的方法 | |
| CN117625581B (zh) | 一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体Ea2F及其应用 | |
| CN115960875A (zh) | 一种热稳定性提高的褐藻胶裂解酶的突变体酶 | |
| US5712142A (en) | Method for increasing thermostability in cellulase ennzymes | |
| CN113337495A (zh) | 一种提高唾液酸产量的方法与应用 | |
| CN112646796A (zh) | 耐热β-半乳糖苷酶的制备 | |
| CN110184259B (zh) | 一种厌氧芽孢杆菌来源普鲁兰酶突变体及其应用 | |
| CN112608914A (zh) | 高活性β-半乳糖苷酶的制备 | |
| CN114703165B (zh) | 一种β-葡萄糖苷酶突变体及其应用 | |
| CN113249363A (zh) | 一种热稳定果胶裂解酶 | |
| CN115960879A (zh) | 一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法及获得的突变体 | |
| CN110628792B (zh) | 一种冷耐受乳糖酶基因及其表达载体和蛋白 | |
| CN113088507A (zh) | 一种热稳定α-淀粉酶 | |
| CN111154741A (zh) | 一种热稳定性酸性乳糖酶及基因与菌株和应用 | |
| CN113151220A (zh) | 一种耐酸α-淀粉酶 | |
| CN114752582B (zh) | 一种葡萄糖耐受性提高的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用 | |
| Chulkin et al. | Enzymological properties of endo-(1–4)-β-glucanase Eg12p of Penicillium canescens and characteristics of structural gene egl2 | |
| CN112442474B (zh) | 一种(-)γ-内酰胺的制备方法 | |
| CN113201518A (zh) | 一种高活性α-淀粉酶 | |
| CN117645989A (zh) | 一种海洋木聚糖酶突变体及其应用 | |
| CN118006590A (zh) | 一种Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶的突变体及方法和应用 | |
| CN107338263B (zh) | 一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产衣康酸的构建方法 | |
| CN116218822A (zh) | 一种提高碱性蛋白酶热稳定性的方法及突变体ThAPT3-M5和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20210413 |
|
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |