CN112640885B - 一种疲劳人体唾液样品的室温保存方法 - Google Patents

一种疲劳人体唾液样品的室温保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种疲劳人体唾液样品的室温保存方法，包括如下步骤，A、收集疲劳人体的唾液样品；B、向收集的唾液样品中先加入吸附剂后继续加入蛋白酶抑制剂；C、继续向唾液样品中加入质量浓度为30%的乙醇并储存至室温，本发明中通过在唾液中加入吸附剂、蛋白酶抑制剂和质量浓度为30%乙醇，测量唾液样品中核连蛋白‑2在1天、7天、10天、15天、18天、19天可知，在常温下，唾液中的核连蛋白‑2含量在超过18天显著降解，在18天内无明显降解，证明在常温下含有核连蛋白‑2的唾液样品可以保存18天。

Description

一种疲劳人体唾液样品的室温保存方法
技术领域
本发明涉及人体唾液领域，尤其是一种疲劳人体唾液样品的室温保存方法。
背景技术
唾液无色无味，PH为6.6到7.1。正常人每日分泌量约为1.0到1.5升。人的唾液水分占80％，有机物主要有黏蛋白、黏多糖、唾液淀粉酶、溶菌酶、免疫球蛋白(lgA、lgG、lgM)、血型物质(a、B、H)、尿素、尿酸和游离氨基酸等；无机物有Na+、K+、Ca2+、Cl-、HCO3-以及一些气体分子，由于唾液无创可得，而且经济，易于收集，现在医学上通过分析唾液以监测人体健康状况的研究越来越多，针对专利号为CN 106706929 B，一种利用唾液检测人体疲劳的方法中，通过测定人体疲劳是唾液中产生的核连蛋白-2的含量来反应人体的疲劳程度，但是唾液收集后需要储存在-80～-70℃下，唾液中的核连蛋白-2含量不会发生变化，也就是说唾液中的核连蛋白-2在-80～-70℃下不被降解，而实际应用中，常常是要在室温情况下对唾液中的核连蛋白-2进行检测来反应人体的疲劳程度，要求唾液中的核连蛋白-2在室温下不被降解，所以急需一种方法能在室温情况下对含有核连蛋白-2的唾液进行保存。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种疲劳人体唾液样品的室温保存方法，在室温下对核连蛋白-2的唾液进行保存，保证唾液中的核连蛋白-2不被降解。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种疲劳人体唾液样品的室温保存方法，包括如下步骤，
A、收集疲劳人体的唾液样品；
B、向收集的唾液样品中先加入吸附剂后继续加入蛋白酶抑制剂；
C、继续向唾液样品中加入质量浓度为30％的乙醇并储存至室温。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤A中收集疲劳人体的唾液样品的方法为：先用生理盐水漱口至少两次，再用清水漱口至少两次，然后收集唾液。
本发明技术方案的进一步改进在于：每次漱口所用生理盐水或清水的体积为20～30ml，每次漱口时间为20～30s。
本发明技术方案的进一步改进在于：唾液样品、吸附剂、蛋白酶抑制剂和乙醇的含量比为1：20：10：8。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤B中的吸附剂选用聚乙二醇和蔗糖的混合液，所述聚乙二醇和蔗糖的含量比为2:1。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤B中的蛋白酶抑制剂选用乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽的混合液，所述乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽的含量比为10:2:2:5。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤C中唾液样品收集后室温储存时间为18天。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
本发明中通过在唾液中加入吸附剂、蛋白酶抑制剂和质量浓度为30％的乙醇，吸附剂选用聚乙二醇和蔗糖且含量比为2:1；蛋白酶抑制剂选用乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽且含量比为10:2:2:5,唾液样品、吸附剂、蛋白酶抑制剂和乙醇的含量比为1：20：10：8，测量唾液样品中核连蛋白-2在放置1天、7天、10天、15天、18天、19天可知，在常温下，唾液中的核连蛋白-2含量在超过18天显著降解，在18天内无明显降解，证明在常温下含有核连蛋白-2的唾液样品可以保存18天。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：
一种疲劳人体唾液样品的室温保存方法，包括如下步骤，
A、收集人体疲劳的唾液样品：先用生理盐水漱口至少两次，再用清水漱口至少两次，每次漱口所用生理盐水或清水的体积为20～30ml，每次漱口时间为20～30s，然后收集唾液；
B、向收集的唾液样品中先加入吸附剂，吸附剂选用聚乙二醇和蔗糖的混合液，所述聚乙二醇和蔗糖的含量比为2:1，继续加入蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂选用乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽的混合液，所述乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽的含量比为10:2:2:5；
C、继续向唾液样品中加入质量浓度为30％的乙醇，唾液样品、吸附剂、蛋白酶抑制剂和乙醇的含量比为1：20：10：8，唾液样品收集后室温储存时间为18天。
具体实施：采集同一个志愿者持续工作4小时后的唾液样品8个，每个唾液样品0.2ml。
实施例：
对唾液样品1进行检测：
向唾液样品中加入吸附剂，吸附剂选用聚乙二醇和蔗糖的混合液，聚乙二醇和蔗糖的含量比为2:1；继续加入蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂选用乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽的混合液，所述乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽的含量比为10:2:2:5；继续向唾液样品中加入质量浓度为30％的乙醇，唾液样品、吸附剂、蛋白酶抑制剂和乙醇的含量比为1：20：10：8。
将唾液进行离心处理得到上清液Ⅰ，离心处理的转速调节成5000～7000rpm之间的任一转速，离心处理在10～15分钟之间完成，向上清液Ⅰ中滴入质量分数是0.2～0.4％的DTT和质量分数在15～25％之间的TCA丙酮溶液后，将其放入至温度在-18～-25℃范围之内的冰箱中，冷冻10～12小时即可，冷冻得到冷冻液；将冷冻液进行离心处理，离心处理的转速调节在12000～14000rpm之间的任一转速，离心处理在10～15分钟完成，取下后，将下层液再次放入冷冻冰箱冷冻，得到蛋白干粉，冷冻的温度在-75～-85℃之间，冷冻时间在1.0～1.5小时之间；将蛋白干粉溶于水化液中并离心处理，离心处理的转速调节在5000～7000rpmm之间的任一转速，得上清液Ⅱ，离心处理在10～15秒完成；将上清液Ⅱ与NH4HCO3溶液混合，并转移至3K的超滤管中进行离心处理，离心处理的转速调节在5000～7000rpm之间的任一速度，离心处理在2～4分钟内完成，重复上述步骤两次；将离心处理后向得到的上清液中加入胰酶，控制温度在36～40℃之间，消化酶解控制在8～10小时之内；利用体外标记法进行TMT试剂标记酶解后的溶液，并将标记后的溶液采用高通量的液相-质谱联用分析，可以得到样品的液相-质谱图，并计算出核连蛋白-2的含量，核连蛋白-2的含量为260ng/ml；
将存有核连蛋白-2的唾液样品1放置于室温下储存，分别检测防置1天、7天、10天、15天、18天、19天的唾液中核连蛋白-2的含量如表1：
表1
时间(天) 1 7 10 15 18 19
唾液中核连蛋白-2的含量(ng/ml) 259 257 255 253 235 210
综上所述：通过唾液样品、吸附剂、蛋白酶抑制剂和质量浓度为30％的乙醇的含量比为1：20：10：8，吸附剂选用聚乙二醇和蔗糖且含量比为2:1；蛋白酶抑制剂选用乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽且含量比为10:2:2:5,测量唾液样品1中核连蛋白-2在放置1天、7天、10天、15天、18天、19天可知，在常温下，唾液中的核连蛋白-2含量在超过18天显著降解，在18天内无明显降解，证明在常温下含有核连蛋白-2的唾液样品可以保存18天。
对照例1：
对唾液样品2进行检测：与实施例不同之处在于吸附剂采用聚乙二醇，计算出核连蛋白-2的含量为220ng/ml；将存有核连蛋白-2的唾液样品2放置于室温下储存，分别检测放置1天、7天、10天、15天、16天、19天的唾液中核连蛋白-2的含量如表2：
表2
时间(天) 1 7 10 15 16 19
唾液中核连蛋白-2的含量(ng/ml) 218 216 214 210 170 143
综上所述：通过唾液样品、吸附剂、蛋白酶抑制剂和质量浓度为30％乙醇的含量比为1：20：10：8，吸附剂选用聚乙二醇；蛋白酶抑制剂选用乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽且含量比为10:2:2:5，测量唾液样品中核连蛋白-2在放置1天、7天、10天、15天、16天、19天可知，在常温下，唾液中的核连蛋白-2含量在超过15天显著降解。
对照例2：
对唾液样品3进行检测：与实施例不同之处在于蛋白酶抑制剂选用乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽且含量比为8:3:3:6，计算出核连蛋白-2的含量为240ng/ml，将存有核连蛋白-2的唾液样品3放置于室温下储存，分别检测防置1天、7天、10天、11天、13天、15天的唾液中核连蛋白-2的含量如表3：
表3
时间(天) 1 7 10 11 13 15
唾液中核连蛋白-2的含量(ng/ml) 239 237 234 206 194 159
综上所述：通过唾液样品、吸附剂、蛋白酶抑制剂和质量浓度为30％乙醇的含量比为1：20：10：8，吸附剂选用聚乙二醇和蔗糖且含量比为2:1；蛋白酶抑制剂选用乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽且含量比为8:3:3:6,测量唾液样品中核连蛋白-2在放置1天、7天、10天、11天、13天、15天可知，在常温下，唾液中的核连蛋白-2含量在超过10天显著降解。
对照例3：
对唾液样品4进行检测：与实施例不同之处在于不采用30％乙醇，计算出核连蛋白-2的含量为245ng/ml，将存有核连蛋白-2的唾液样品4放置于室温下储存，分别检测防置1天，2天、3天、4天、5天、6天的唾液中核连蛋白-2的含量如表4：
表4
时间(天) 1 2 3 4 5 6
唾液中核连蛋白-2的含量(ng/ml) 240 236 230 194 167 130
综上所述：通过唾液样品、吸附剂、蛋白酶抑制剂含量比为1：20：10，吸附剂选用聚乙二醇和蔗糖且含量比为2:1；蛋白酶抑制剂选用乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽且含量比为10:2:2:5,测量唾液样品中核连蛋白-2在放置1天，2天、3天、4天、5天、6天可知，在常温下，唾液中的核连蛋白-2含量在超过3天就显著降解。
对照例4：
对唾液样品5进行检测：与实施例不同之处在于采用质量浓度为20％的乙醇，计算出核连蛋白-2的含量为242ng/ml，将存有核连蛋白-2的唾液样品5放置于室温下储存，分别检测防置1天、7天、10天、14天、15天、16天的唾液中核连蛋白-2的含量如表5：
表5
时间(天) 1 7 10 14 15 16
唾液中核连蛋白-2的含量(ng/ml) 240 238 237 235 183 154
综上所述：通过唾液样品、吸附剂、蛋白酶抑制剂和质量浓度为20％乙醇的含量比为1：20：10：8，吸附剂选用聚乙二醇和蔗糖且含量比为2:1；蛋白酶抑制剂选用乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽且含量比为10:2:2:5,测量唾液样品中核连蛋白-2在放置1天、7天、10天、14天、15天、16天可知，在常温下，唾液中的核连蛋白-2含量在超过14天显著降解。
对照例5：
对唾液样品6进行检测：与实施例不同之处在于唾液样品、吸附剂、蛋白酶抑制剂和质量浓度为30％的乙醇的含量比为1：20：10：6，计算出核连蛋白-2的含量为256ng/ml，将存有核连蛋白-2的唾液样品6放置于室温下储存，分别检测放置1天、7天、10天、14天、15天、16天的唾液中核连蛋白-2的含量如表6：
表6
时间(天) 1 7 10 14 15 16
唾液中核连蛋白-2的含量(ng/ml) 254 253 250 248 244 203
综上所述：通过唾液样品、吸附剂、蛋白酶抑制剂和质量浓度为30％乙醇的含量比为1：20：10：6，吸附剂选用聚乙二醇和蔗糖且含量比为2:1；蛋白酶抑制剂选用乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽且含量比为10:2:2:5,测量唾液样品中核连蛋白-2在放置1天、7天、10天、14天、15天、16天可知，在常温下，唾液中的核连蛋白-2含量在超过15天显著降解。
对照例6：
对唾液样品7进行检测：与实施例不同之处在于唾液样品、吸附剂、蛋白酶抑制剂和质量浓度为30％的乙醇的含量比为1：17：10：8，计算出核连蛋白-2的含量为238ng/ml，将存有核连蛋白-2的唾液样品7放置于室温下储存，分别检测防置1天、7天、10天、13天、14天、15天的唾液中核连蛋白-2的含量如表7：
表7
时间(天) 1 7 10 13 14 15
唾液中核连蛋白-2的含量(ng/ml) 237 235 233 230 204 163
综上所述：通过唾液样品、吸附剂、蛋白酶抑制剂和质量浓度为30％乙醇的含量比为1：17：10：8，吸附剂选用聚乙二醇和蔗糖且含量比为2:1；蛋白酶抑制剂选用乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽且含量比为10:2:2:5,测量唾液样品中核连蛋白-2在放置1天、7天、10天、13天、14天、15天可知，在常温下，唾液中的核连蛋白-2含量在超过13天显著降解。
对照例7：
对唾液样品8进行检测：与实施例不同之处在于唾液样品、吸附剂、蛋白酶抑制剂和质量浓度为30％的乙醇的含量比为1：20：12：8，计算出核连蛋白-2的含量为270ng/ml，将存有核连蛋白-2的唾液样品8放置于室温下储存，分别检测防置1天、7天、10天、13天、15天、16天的唾液中核连蛋白-2的含量如表8：
表8
时间(天) 1 7 10 13 15 16
唾液中核连蛋白-2的含量(ng/ml) 269 267 264 263 262 239
综上所述：通过唾液样品、吸附剂、蛋白酶抑制剂和质量浓度为30％乙醇的含量比为1：20：12：8，吸附剂选用聚乙二醇和蔗糖且含量比为2:1；蛋白酶抑制剂选用乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽且含量比为10:2:2:5,测量唾液样品中核连蛋白-2在放置1天、7天、10天、13天、15天、16天可知，在常温下，唾液中的核连蛋白-2含量在超过15天显著降解。

Claims (3)

1.一种疲劳人体唾液样品的室温保存方法，其特征在于：包括如下步骤，
A、收集疲劳人体的唾液样品；
B、向收集的唾液样品中先加入吸附剂后继续加入蛋白酶抑制剂，吸附剂选用聚乙二醇和蔗糖的混合液，所述聚乙二醇和蔗糖的含量比为2:1，蛋白酶抑制剂选用乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽的混合液，所述乙二胺四乙酸、胰蛋白抑制剂、胃蛋白抑制剂和亮抑蛋白酶肽的含量比为10:2:2:5；
C、继续向唾液样品中加入质量浓度为30%的乙醇并储存至室温，唾液样品收集后室温储存时间为18天；
唾液样品、吸附剂、蛋白酶抑制剂和乙醇的含量比为1： 20：10：8。
2.根据权利要求1所述的一种疲劳人体唾液样品的室温保存方法，其特征在于：所述步骤A中收集疲劳人体的唾液样品的方法为：先用生理盐水漱口至少两次，再用清水漱口至少两次，然后收集唾液样品。
3.根据权利要求2所述的一种疲劳人体唾液样品的室温保存方法，其特征在于：每次漱口所用生理盐水或清水的体积为20～30ml，每次漱口时间为20～30s。
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