CN103842506A - 唾液收集、处理、稳定化及储存方法 - Google Patents

唾液收集、处理、稳定化及储存方法 Download PDF

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Abstract

本文提供一种一体化唾液收集设备，其收集唾液以允许唾液过滤以将唾液成分(如不存在于完整细胞内的胞外蛋白质和核酸)同所提取样品中剩余的完整细胞和残渣分离。可将经过滤的唾液样品等分为两部分，用于蛋白质和/或核酸分析。本发明进一步描述了经过滤的唾液核酸在室温下的长期储存方案，以及添加了乙醇溶液的经过滤的唾液蛋白质在室温下的长期储存方案。经过滤的无细胞唾液样品具有诊断应用性。

Description

唾液收集、处理、稳定化及储存方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2012年8月4日提交的USSN61/515,169的优先权，其通过引用全文纳入本文。
关于政府权利的声明
本发明在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号CA0126733的政府资助下完成。政府享有该发明中的某些权利。
技术领域
本公开涉及用于分析唾液无细胞样品中存在的蛋白质与核酸的设备和方法。
背景技术
人们对于用唾液作为疾病检测和健康监护的诊断工具的兴趣正与日俱增，原因在于其无创可得性、经济性、易于样本收集和处理，以及越来越多的科学依据(Yan等，Proteomics Clin.Appl.3:116(2009)；Lee和Wong，Am J.Dent.22:241-8(2009))。唾液已用于检测，例如龋病风险、牙周炎、口腔癌、乳腺癌、肺癌、干燥综合征( syndrome)、唾液腺疾病和传染性疾病(如肝炎、HIV和HCV)。因此，唾液是替代血液、血清或血浆的一种吸引人的诊断样品。
唾液对于核酸分析而言是理想的。通过使用微阵列技术，在2004年首次发现了无细胞唾液中的人类唾液转录组(Li等，J.Dent.Res.83:199-203(2004))。随后研究了唾液RNA的特点，使得唾液转录组学的发展成为研究焦点(Park等，Clin.Chem52:988-94(2006)；Park等，Arch.Oral.Biol.,52:30-5(2007))。
此外，唾液对于蛋白质组学分析而言也是理想的。在疾病进展病程中剖析唾液中的蛋白质能揭示疾病不同阶段指示性的生物标志物，这可用于早期检测和/或医疗诊断(Hu等，Proteomics6:6326(2006))。蛋白质组学被广泛设想为针对生物标志物发展的独特且有力的方法。随着蛋白质组学技术日臻成熟，蛋白质组学对于唾液蛋白质组学生物标志物的发展和进一步的临床应用而言具有很大潜力(Xiao和Wong，Bioinformation5:294(2011)；Zhang等,Mol.Diagn.Ther.13:245(2009))。
然而，目前从唾液提取核酸和蛋白质的方法要求在收集唾液样品后立即处理，并且需要特殊的仪器和受训人员。例如，目前用于唾液转录组学诊断的标准方法需要进行耗时费力的mRNA分离。此外，过程复杂性的增加使得操作员之间的差异增大。虽然多款市售可得的自动化装置能够提高mRNA的分离效率(如KINGFISHER<QIACUBE和MAXWELL16)，但生产能力仍然受限于每次运行所处理的样品数量。此外，处理RNA时需要特别小心，因为其本身不稳定且RNA酶无处不在。同样地，目前用于唾液蛋白质组学诊断的标准方法需要添加蛋白酶抑制剂以防止蛋白质水解。结果是，目前用于转录组学和蛋白质组学诊断的方法需要向唾液样品添加核酸和蛋白质稳定剂，之后储存于-80℃。
分析唾液以监测健康状况和疾病的能力是口腔健康促进与研究的一个非常希望达到的目标。为全面实现唾液作为生物标志物来源的诊断和研究应用，需要在用户友好的集成型医疗点(point of care)收集系统中由非专业人员收集、处理及室温储存唾液的系统。
发明内容
唾液是理想的转化研究工具和诊断介质，并以独特方式被用于提供针对多种口腔和全身性疾病与病症的分子生物标志物。口腔健康促进和研究非常需要分析唾液以监测健康状况和疾病的能力。唾液已被用于检测龋病风险、牙周炎、口腔癌、乳腺癌、唾液腺疾病和传染性疾病(如肝炎、HIV和HCV)。唾液分析物的检测需要最优化的收集、处理和储存过程与条件。
在一个实施方式中，提供一种使分离自唾液样品的RNA和蛋白质样品稳定的方法。所述方法包括：a)从对象收集唾液样品；b)过滤该唾液样品以形成无细胞的经过滤样品；c)将所述经过滤样品收集在至少第一和第二接收装置中；d)向所述第一接收装置添加醇溶液以形成含醇的经过滤样品，该样品包含蛋白质样品，前提是不向第二接收装置添加醇以形成无醇的经过滤样品，该样品包含核酸样品；其中使所述蛋白质样品和核酸样品在25摄氏度下储存时稳定至少3天；以及e)对所述第一和第二接收装置内收集的经过滤样品进行分析，所述分析包括如下一种或多种：对含醇的经过滤样品的进行蛋白质分析或对无醇的经过滤样品进行核酸分析。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述核酸是DNA。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述核酸分析是聚合酶链式反应(PCR)。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述核酸是RNA。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述核酸分析是RT-PCR。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述RT-PCR为反转录定量实时PCR(RT-qPCR)。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述乙醇溶液包含20％乙醇。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述乙醇溶液包含15-25％乙醇。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述乙醇溶液包含5-35％乙醇。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述蛋白质分析包括western印迹、质谱蛋白质鉴定或ELISA。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述经过滤的样本储存于室温下。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述经过滤的样品在室温下储存至少两周，其中所述经过滤的样品中存在的蛋白质或核酸的降解不超过50％。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述经过滤的样品在室温下储存至少两周，其中所述经过滤的样品中存在的蛋白质或核酸的降解不超过25％。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述经过滤的样品在室温下储存至少十周，其中所述经过滤的样品中存在的蛋白质或核酸的降解不超过50%。在又一个实施方式中，根据任何上述事实方式或结合任何上述实施方式，所述经过滤的样品在室温下储存至少十周，其中所述经过滤掉样品中存在的蛋白质或核酸的降解不超过25%。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述滤器选自下组：0.22μm、0.45μm和5.0μm亲水膜。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述滤器是0.22μm亲水膜。
在另一个实施方式中，提供收集唾液样品供生物标志物检测的的装置。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述装置包含样本收集垫、滤器、两个或更多个接收装置，其中所述接收装置选自mRNA收集管、多肽收集管和DNA收集管，其中所述多肽收集管包含乙醇溶液，而所述DNA收集管包含DNA稳定剂，其中所述滤器被可操作地连接至所述接收装置。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述滤器选自下组：0.22μm、0.45μm或5.0μm亲水膜。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述滤器是0.22μm亲水膜。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，提供一种使用所述装置的方法。所述方法包括：将样本收集垫插入口腔保持足够时间以使所述样本收集垫润湿，将收集垫插入接收管，施加足够的力使所述收集垫中收集的物质通过滤器，由此形成经过滤的样品，以及将所述经过滤的样品收集入一个或多个接收装置。
在另一个实施方式中，提供一种使分离自唾液样品的RNA和蛋白质样品稳定的方法。所述方法包括：a)收集来自人类对象的唾液样品；b)使用0.22μm～5.0μm亲水膜过滤所述唾液样品以形成无细胞的经过滤样品；c)将所示经过滤样品收集在第一和第二接收装置中；d)向所述第一接收装置添加乙醇溶液以形成含20％乙醇的经过滤样品，该样品包含蛋白质样品，前提是不向所述第二接收装置添加醇以形成无醇的经过滤样本，该样品包含核酸样品；其中使所述蛋白质样品和核酸样品在25摄氏度下储存时稳定至少3天。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述方法还包括如下步骤：(e)对所述第一和第二接收装置内收集的经过滤样品进行分析，所述分析包括如下一种或多种：对含乙醇的经过滤样品进行蛋白质分析或对无醇的经过滤样品进行核酸分析。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，使所述蛋白质样品在25摄氏度下储存时稳定至少2周。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，使所述核酸样品在25摄氏度下储存时稳定至少10周。在一些实施方式中，所述乙醇溶液包含15-25％乙醇。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述乙醇溶液包含5-35％乙醇。在又一个实施方式中，根据任何上述实施方式或结合任何上述实施方式，所述亲水膜是0.22μm膜。
附图说明
图1显示实施例1的实验设计的示意图。
图2显示使用人细胞基因组DNA(300μg/ml)作为模板证明通过所述DNA酶处理法获得的DNA去除效果。实心柱代表GAPDH、白色柱代表ACTB，而条纹柱代表RPS9。
图3显示在第0天通过标准方法和DSTA方法分析的3种SIRG mRNA的表达水平。
图4显示无稳定剂存在时在室温下储存10周期间测量的3种SIRG mRNA的表达水平。
图5采用盒须图显示OSCC唾液转录本验证研究中使用的90个临床样品的Cq值分布。各转录本的结果单独显示：(A)H3F3A；(B)IL1B；(C)IL8；(D)OAZi；(E)SAT1；(F)DUSP1以及(G)S100P。在第0天和第10周通过标准和流水化的方法在27名OSCC对象和63名正常对象中检测各转录本(仅DSTA法)，其在X轴上用1－6表示：1：通过标准方法分析的正常对象；2：通过标准方法分析的OSCC对象；3：第0天通过SDTA法分析的正常对象；4：第0天通过DSTA法分析的OSCC对象；5：第10周通过DSTA法分析的正常对象；以及6：第10周使用DSTA法分析的OSCC对象；Y轴表示各图中的原始Cq值。
图6显示(A)各自通过标准方法检测的7个OSCC唾液转录本的ROC曲线，(B)各自在第0天通过DSTA检测的7个OSCC唾液转录本的ROC曲线，以及(C)各自在第10周通过DSTA检测的7个OSCC唾液转录本的ROC曲线。
图7显示实施例2的唾液样品收集和实验设计的示意图。
图8显示唾液β-肌动蛋白的ELISA分析：RT+R：RT＋蛋白酶抑制剂；4℃+R：4度＋蛋白酶抑制剂(n＝5)(*：p<0.05)。
图9显示无(A)和有(B)淀粉酶消耗的唾液蛋白质的SDS-Page，样品在对应的处理下储存3天(C)经标记的4条条带的相对定量(D)7天后β-肌动蛋白的western印迹(E)对图(D)中western印迹的定量数据(n＝3)。使所有的定量针对阳性对照中的对应条带进行标准化。RT w/E：室温＋20％乙醇(a)无淀粉酶消耗；(b)有淀粉酶消耗。
图10显示通过变性使蛋白质稳定。(A)β-肌动蛋白的Western印迹，RT w/B：RT＋煮沸，RT w/e：RT＋添加20倍体积的乙醇(B)对图(A)中western印迹的定量数据(n＝5)。
图11显示β-肌动蛋白的western印迹：(A)在第3天、第7天和第14天添加或不添加乙醇。其定量数据示于点状图(B)(n＝8)。RT w/E：室温＋添加20％乙醇。
图12显示不同条件下唾液样品(n＝10)中IL1β的ELISA。(A)储存7天(B)储存14天(C)储存30天。RT w/E：室温＋添加20％乙醇。
图13描述实施例3中所述的唾液收集、处理、稳定化和储存(SCPSS)方案的示意图。提供注射器、吸收垫、滤器、管和稳定剂。显示多种生物标志物的收集方案。
具体实施方式
引言
人类唾液包含可作为生物标志物用于转化应用和临床应用的大量分析物(蛋白质、mRNA和DNA)。例如，唾液可用于检测龋病风险、牙周炎、口腔癌、乳腺癌、肺癌、干燥综合征、唾液腺疾病和传染性疾病(如肝炎、HIV和HCV)。
使用唾液作为生物标志物来源的价值在于易于取样且对象的采样依从性高。通过实施例中详述的多种方法证实唾液的无细胞液相部分中RNA和蛋白质的存在。然而，用于从唾液提取核酸和蛋白质的现有方法需要利用特殊仪器和受训人员在收集后立刻处理唾液样品、添加核酸及蛋白稳定剂，和在-80℃储存。
令人感兴趣的是针对主要唾液诊断分析物提供用户友好且易于使用的收集器设备的能力。本发明提供用于收集唾液和唾液生物标志物的方法和设备。所述方法可由非专业人员在用户友好的集成型治疗点收集系统中实行，其允许在不添加常用核酸和蛋白质稳定剂的条件下于室温下储存和运输。
定义
除非另有说明，本文所用的技术术语遵循本领域技术人员所理解的通常用法。分子生物学中常见术语的定义可见于标准文本(如Benjamin Lewin，《基因V》(Genes V)，牛津大学出版社(Oxford University Press)出版，1994(ISBN0-19854287-9)；Kendrew等(主编)，《分子生物学百科全书》(The Encyclopediaof Molecular Biology)，布莱克威尔科学有限公司(Blackwell Science Ltd)出版，1994(ISBN0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers(主编)，《分子生物学与生物技术：综合性案头参考》(Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference)，VCH出版公司出版，1995(ISBN1-56081-569-8))。
“唾液样品”表示源自产唾液动物来源的唾液的样品。唾液是大多数动物中生成的口腔液体的成分。
“经过滤样品”表示经处理以去除细胞的唾液样品，其中通过分离唾液的细胞相和液相来去除细胞。经过滤样品的细胞去除率可以是超过50％、超过75％、超过95％或100％。过滤样品以避免对细胞组分的机械破坏，这种破坏可能会导致在无细胞相中检测到不需要的分析物。经过滤样品可进一步排除外源性物质，包括但不限于食物碎屑。
术语“醇溶液”表示含醇(例如甲醇、异丙醇和乙醇)的任何溶液。醇溶液可包含例如5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或100%的醇，如乙醇。术语“含醇的经过滤样品”表示包含醇(如乙醇溶液)的无细胞唾液样品，如本文所述。
术语“无醇的经过滤的样品”表示至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%不含醇的无细胞唾液样品，所述醇包括但不限于：异丙醇、甲醇或乙醇。
本文所用术语“分析”表示对唾液成分的任何定量或定性检测或计量。其非限制实例有：确定核酸或蛋白质的存在与否的分析；确定核酸或蛋白质过表达或低表达的分析；或确定唾液样品的基因组学、转录组学或蛋白质组学检测的分析。
术语“收集设备”表示可用于收集唾液的任何设备。如本文中所用，收集设备包括本文所述的样品收集垫、能够从本文所述的样品分离细胞的滤器，以及能够接收本文所述的经过滤样品的接收装置。
术语“收集垫”表示适合于唾液收集的任何材料。其实例可包括但不限于：硝化纤维素、醋酸纤维素、聚醚砜织物、纤维素纤维如纸带或棉花、尼龙、泡沫胶、玻璃纤维、聚碳酸酯、聚丙烯、醋酸酯、人造纤维、聚酯吸收垫或能够收集唾液的其它合成材料。
术语“滤器”表示能够从唾液样品分离细胞的任何滤器。示例性的滤器可包括但不限于：纤维素纤维基质、亲水滤器如基于聚偏二氟乙烯膜的滤器，或基于聚丙烯膜的滤器。滤器可具有多种尺寸的微孔，包括但不限于0.22μm、0.45μm和5.0μm。术语“过滤”表示将含有细胞的液体样品(如唾液样品)施加至膜滤器。过滤是使样品通过微孔膜滤器来从液体样品的过量液体移除细胞和/或细胞部件的过程。
短语“无细胞”表示样品溶液已根据本发明方法经过过滤从而该样本溶液是完全或基本无细胞的。
术语“降解”表示，例如蛋白质经蛋白水解切割成为较小肽段和氨基酸；或核酸经催化作用成为较小成分。本文所用的降解导致蛋白质和核酸的基因表达及临床效用受影响。
术语“接收装置”表示能够收集经过滤样品的任何装置。接收装置可包括但不限于完全或部分由塑料制成的装置，如聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸脂、聚氨酯、或聚乙烯、聚碳酸脂、聚四氟乙烯、搪瓷、尼龙、陶瓷或其任何混合物，或由玻璃和/或金属材料制成的装置。接收装置可以是，例如扣入盖(snap cap)、螺旋盖(screw cap)和环状盖(loop-cap)的微量离心管。
术语“室温”表示周围环境的温度，一般指临床条件下的室内温度。室温通常为20～25摄氏度。
本文所用术语“细胞外”表示细胞质膜外的液态空间。所述细胞外空间的组成可包括蛋白质、核酸、脂类、激素、微生物产物等。
术语“稳定”或“稳定化”表示本发明方法的导致生物分子结构和/或活性稳定、生物分子保存期延长和/或保护生物分子对抗胁迫的任何效果。这导致在很大程度上保留生物分子的生物学活性。示例性的稳定化可以是核酸或蛋白质在室温下稳定2～10周或更久。
术语“核酸”表示单链或双链形式及其互补链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语表示所有形式的核酸(例如基因、前体mRNA、mRNA)及其多态性变体、等位基因、突变体和种间同源物。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸交换使用。该术语涵盖了天然形成或重组的核酸。核酸能够(1)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与参比核酸所编码多肽或本文所述氨基酸序列，优选在至少约25、50、100、200、500、1000个或更多个氨基酸的区域中，之间的氨基酸序列相同性大于约60%，65%、70%、75%、80%、85%、90%，优选氨基酸序列相同性91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高；(2)特异性结合针对免疫原产生的抗体(如多克隆抗体)，所述免疫原包括参比氨基酸序列、其免疫原性片段及其保守修饰的变体；(3)在严谨杂交条件下与编码参比氨基酸序列的核酸及其保守修饰的变体特异性杂交；(4)与参比核酸序列，优选在至少约25、50、100、200、500、1000个或更多个核苷酸的区域上，具有高于约95％，优选高于约96%、97%、98%、99%或更高的核苷酸序列相同性的核酸序列。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，表示氨基酸残基的聚合物。该术语适用于表示其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然形成氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然形成的氨基酸聚合物和非天然形成的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”表示天然形成的和人工合成的氨基酸，以及与天然形成的氨基酸功能相似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然形成的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及经后续修饰的氨基酸，如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然形成氨基酸具有相同基础化学结构的化合物，如α碳原子结合有氢原子、羧基基团、氨基基团和R基团，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍(methionine methyl sulfonium)。这种类似物具有经修饰的R基团(如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留了与天然形成的氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物指结构与氨基酸的一般化学结构不同，但功能与天然形成的氨基酸相似的化学化合物。氨基酸在本文中可由其公知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会建议的单字母符号表示。同样，核苷酸可由其普遍接受的单字母代码表示。
提及蛋白质、核酸、抗体或小分子化合物时，短语“特异性(或选择性)结合”表示决定蛋白质或核酸(如本发明的差异表达的基因)一般在蛋白质或核酸及其他生物产品的异质群中的存在的结合反应。就抗体而言，在指定的免疫测定条件下，特定抗体与具体蛋白质的结合可以至少两倍于背景，或更典型地，大于10倍～100倍于背景。在该条件下与抗体的特异性结合需要根据对具体蛋白质的特异性来选择抗体。例如，可选择多克隆抗体以仅获得与选定的抗原而非其他蛋白质具有特异性免疫反应性的那些多克隆抗体。可通过剔除与其他分子交叉反应的抗体来实现这一选择。可使用多种免疫测定形式来选择与特定蛋白质具有特异性免疫反应性的抗体。例如，常规使用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白质具有特异性免疫反应性的抗体(例如，参见Harlow和Lane，《抗体，实验手册》(Antibodies,A Laboratory Manual)(1988)中关于可用于测定特定免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述)。
核酸分析
本文所述的实施方式包括对唾液源性核酸的流水化室温处理、稳定化和储存方法。可在室温下且不添加稳定剂条件下采用无细胞唾液上清液代替经分离的核酸进行直接的唾液转录组和基因组分析，如本文所述，其包括唾液样品的处理、稳定化和储存。在一些实施方式中，可包括稳定剂。在一些实施方式中，可包括醇。
在疾病进展过程中剖析唾液核酸能够揭示指示疾病不同阶段的可能的生物标志物，这有利于疾病的早期检测。对于现场应用或日常临床操作而言，需要极低温度或核酸稳定化化学品的核酸稳定化不具实用性。此外，核酸稳定剂可影响下游分析。本文描述细胞外核酸的提取，所述核酸不需要额外稳定化化学品即可在室温下储存直至下游应用(如PCR)需要时。
本发明的核酸可在室温下储存长于1周、2周、5周、10周或25周或更久的时间。
收集无细胞唾液样品后制备适于检测的形式的核酸的方法是本领域公知的。此类方法可包括但不限于：PCR、反转录酶PCR(RT-PCR)、实时PCR、反转录定量实时PCR(RT-qPCR)、连接酶链式反应、链替代扩增反应(SDA)、自主序列复制(3SR)或原位PCR。可使用本领域已知的用于检测特定核酸(例如，RNA或DNA)的任何合适的定性或定量方法。例如，可使用反转录酶PCR或含多聚A mRNA的northern印迹及本领域熟知的其它方法来检测核酸。
适用的PCR扩增技术在Ausubel等和Innis等(出处同上)中有描述。一般核酸杂交方法在Anderson，《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)，BIOS科学出版社(BIOS Scientific Publishers)，1999中有描述。对于PCR，约36℃的温度通常用于低严谨性扩增，但退火温度可根据引物长度在约32℃～48℃之间变化。对于高严谨性PCR扩增，通常采用约62℃的温度，但高严谨性退火温度可根据引物长度及特异性在约50℃～约65℃之间变化。就高严谨性和低严谨性扩增而言，典型的循环条件包括：变性阶段90℃～95℃持续30秒～2分钟，退火阶段持续30秒～2分钟，和延伸阶段约72℃持续约1～2分钟。低严谨性和高严谨性扩增反应的方法和指导在如Innis等，《PCR方法：方法和应用指南》(PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications)，学术出版社(纽约)公司(Academic Press,Inc.N.Y.)(1990)中有提供。
可使用实时、定量反转录酶PCR(RT-PCR)或反转录定量实时PCR(RT-qPCR)来确定突变的存在。可通过本领域技术人员已知的任何方法来进行RNA提取，例如涉及蛋白酶K组织消化和基于醇的核酸沉淀的方法、采用DNA酶处理以消化污染DNA、采用硅-胶-膜技术的RNA纯化、使用市售试剂盒如Trizol和RNeasy的方法，或其任意组合。可通过本领域技术人员已知的任何方法进行实时RT-PCR，例如采用应用生物系统公司(Applied Biosystem)试验的Taqman实时PCR。
可使用本文公开的多核苷酸序列生成核酸引物或探针。所述探针优选为多肽或核酸连续序列的至少长约12、15、16、18、20、22、24或25个核苷酸的片段。可通过例如化学合成、PCR扩增、使用限制性酶从较长的多核苷酸产生或其他本领域熟知的方法来生成探针。
核酸探针可被用作诊断法，其中，必要时可处理待分析的生物样品(如唾液)以提取其中所含的核酸。可将从所述样品获得的核酸进行凝胶电泳或其他尺寸分离技术；或者，所述核酸样品可不经尺寸分离而进行斑点印迹。随后，从所述样品提取的核酸在合适严谨性的杂交条件下用经标记的探针处理。探针可制成与靶核酸或其部分(例如，与编码目标的序列的全部或部分)完全互补。因此，通常需要高严谨性条件以避免假阳性或至少使假阳性最小化。然而，仅当探针与目标中缺乏异质性的区域互补时才应使用高严谨性条件。杂交的严谨性是由杂交期间和清洗过程中的一系列因素决定的，包括温度、离子强度、时间长度和甲酰胺浓度(Sambrook等(1989)，《分子克隆；实验室手册》(“MolecularCloning;A Laboratory Manual”)第二版(纽约冷泉港的冷泉港出版社(Cold SpringHarbor Press)))。
核酸探针或者来自样品的核酸可以溶液提供用于此类试验，或可固定在载体上(如固体或半固体载体)。可用载体的实例有硝化纤维(如膜或微量滴定孔形式)、聚氯乙烯(如片状或微量滴定孔形式)、聚苯乙烯乳胶(如珠或微量滴定孔板形式)、聚偏二氟乙烯、重氮纸、尼龙膜、经活化的珠和Protein A珠。
本发明还可使用不基于PCR的、序列特异的DNA扩增技术来检测核酸。此类技术的实例包括但不必限于侵染检测(Invader assay)(参见例如Kwiatkowski等，Mol Diagn.1999,4:353-64。也可参见美国专利号5,846,717)。
可对核酸进行可检测的标记。示例性的可检测标记物包括但不限于：放射性标记物、荧光染料(如异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明、德克萨斯红、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、6-羧基荧光素(6-FAM)、2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基荧光素、6-羧基-X-若丹明(ROX)、6-羧基-2’,4’,T,4,7-六氯荧光素(HEX)、5-羧基荧光素(5-FAM)或N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA))、放射性标记物(如32P、35S和3H)等。所述可检测标记物可涉及两级系统(如生物素－亲和素、半抗原－抗半抗原抗体等)。
对来自唾液样品的核酸样品的分析可使用本领域已知的技术，包括但不限于：电泳分析或序列分析。电泳分析的非限制实例包括：平板凝胶电泳(如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳)、毛细管电泳和变性梯度凝胶电泳(DGGE)。核酸分析的其它方法包括但不限于：限制性分析，如基于等位基因特异性限制性核酸内切酶切割的限制性片段长度多态性检测(Kan和Dozy，Lancet ii:910-12(1978))、使用等位基因特异性寡核苷酸探针的杂交(Wallace等，Nucl.Acids Res.6:3543-3557(1978))，包括经固定的寡核苷酸(Saiki等，PNAS86:6230-6234(1989))、寡核苷酸阵列(Maskos和Southern，Nucl.Acids Res.21:2269-2270(1993))、寡核苷酸连接试验(OLA)(Landegren等，Science241:1077(1988))、等位基因特异性连接链式反应(LCR)(Barrany，PNAS88:189-193(1991))、缺口LCR(Abavaya等，Nuc.l Acids Res.23:675-682(1995))、单链构象多态性检测(Orita等，Genomics5:874-879(1983))、错配碱基对位置的RNA酶切割(Myers等，Science230:1242(1985))、异源双链DNA的切割、基于等位基因特异性引物延伸的方法、遗传位点分析(GBA)(Nikiforov等，Nucl.Acids Res.22:4167-4175(1994))、原位杂交、Southern印迹、Northern印迹分析、变性高效液相色谱(DHPLC)(Kim等，Genetic Testing12:295-298(2008))。序列分析的非限制性实例包括：吉尔伯特二氏(Maxam-Gilbert)测序、桑格(Sanger)测序、毛细管阵列DNA测序、热循环测序(Sears等，Biotechniques,13:626-633(1992))、固相测序(Zimmerman等，Methods Mol.CellBiol.,3:39-42(1992))、采用质谱(如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS))的测序(Fu等，Nat.Biotechnol.,16:381-384(1998))和通过杂交的测序(Chee等，Science,274:610-614(1996)；Drmanac等，Science,260:1649-1652(1993)；Drmanac等，Nat.Biotechnol.,16:54-58(1998))、NGS(新一代测序)(Chen等，Genome Res.18:1143-1149(2008)；Srivatsan等，PloS Genet.4:e1000139(2008))、聚合酶克隆测序(Polony sequencing)(Porreca等，Curr.Protoc.Mol.Biol.第7章；7.8单元(2006))、离子半导体测序(Elliott等，J.Biomol Tech.1:24-30(2010))、DNA纳米球测序(Kaji等，Chem Soc Rev39:948-56(2010))、单分子实时测序(Flusberg等，Nat.Methods6:461-5(2010))、或纳米孔DNA测序(Wanunu，Phys Life Rev9:125-58(2012))。
可在阵列上提供探针(或样品核酸)用于在唾液提取后检测。可通过例如将多核苷酸探针以二维矩阵或阵列的形式点涂在基质(如玻璃、硝化纤维等)上来产生阵列。可通过共价键或非特异性相互作用(如疏水相互作用)使探针连接至基质。可对多核苷酸样品进行可检测标记(如使用放射性标记物或荧光标记物)，随后使其与探针杂交。一旦洗去样品的未连接部分，即可检测双链多核苷酸，其包括连接至探针多核苷酸的经标记的样品多核苷酸。用于构建阵列的技术和使用这些阵列的方法可见于EP799897；WO97/29212；WO97/27317；EP785280；WO97/02357；美国专利号5,593,839；美国专利号5,578,832；EP728520；美国专利号5,599,695；EP721016；美国专利号5,556,752；WO95/22058；和美国专利号5,631,734。阵列在某些情况下尤其有用，例如，在需要分析单个样品是否存在两个或更多个核酸靶区域时尤其有用，因为可在单个阵列上提供针对各靶区域以及对照(阳性对照和阴性对照)的多种探针。因此，阵列有助于快速且方便的分析。
蛋白质分析
本文所述的实施方式包括对于唾液源性蛋白质的流水化室温处理、稳定化和储存。可以在室温下使用无细胞唾液上清液代替经分离的蛋白质来进行直接的唾液蛋白质组学分析，如本文所述，其包括对唾液样品的处理、稳定化和储存。
在疾病进展期间剖析唾液蛋白质能够揭示指示疾病不同阶段的生物标志物，这有利于疾病的早期检测。对于现场应用或日常临床操作，需要极低温度或蛋白质稳定化化学品的蛋白质稳定化不具可行性。此外，蛋白质稳定剂会影响下游分析。在一些实施方式中，可以使用蛋白质稳定剂。在其它实施方式中，不使用蛋白质稳定剂。在其它实施方式中，可使用乙醇来稳定本发明的唾液蛋白质。
本文描述的是进一步添加醇以提高无细胞唾液样品在室温下的稳定性。不受理论约束，醇可以代替暴露的疏水基团周围的有序水分子，从而包围蛋白质的非极性侧链并由此提高唾液蛋白质的稳定性。醇可包括但不限于乙醇。醇可以例如5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的浓度添加。醇可以例如25-35%、20-40%、15-45%、10-50%、5-50%的浓度添加。
本发明中的核酸样品可在室温储存超过1周、2周、5周、10周或25周或更久。
用于制备适合于无细胞唾液样品收集后检测的形式的蛋白质的方法是本领域熟知的。可通过标准技术将胞外蛋白质纯化至基本纯，所述标准技术包括采用诸如硫酸铵的物质进行选择性沉淀、柱色谱、免疫纯化方法等(参见例如Scopes，《蛋白质纯化：原理与实践》(Protein Purification:Principles and Practice)(1982)；美国专利号4,673,641；Ausubel等，同上；以及Sambrook等，同上)。
可利用蛋白质的分子量使用超滤法通过孔径不同的膜(例如Amicon或Millipore膜)使所述蛋白质与较大或较小分子量的其它蛋白质分离。作为第一步骤，通过孔径分子量截止值小于感兴趣蛋白质的分子量的膜超滤蛋白质混合物。随后，上述超滤残留物超滤过分子截止值大于感兴趣蛋白质的分子量的膜。重组蛋白会通过膜进入滤液。随后可对滤液进行色谱分析。
还可基于蛋白质大小、净表面电荷、疏水性和配体或底物亲和性，采用柱色谱法将所述蛋白质与其它蛋白质分离。此外，可使针对蛋白质形成的抗体与柱基质和经免疫纯化的蛋白质结合。所有这些方法都是本领域熟知的。技术人员能显见，色谱技术可以任何规模并采用多个不同生产商(如法马西亚生物技术公司(PharmaciaBiotech))的仪器进行。
可在试验中采用抗体试剂，使用本领域技术人员已知的多种免疫测定中的任何一种来检测唾液样品中的蛋白质。免疫测定技术和步骤的一般描述可见：Price和Newman，《免疫测定的原理与实践》(Principles and Practice of Immunoassay)，第二版，Grove词典出版公司，1997；和Gosling，《免疫测定：实践方法》(Immunoassays:A Practical Approach)，牛津大学出版社(Oxford University Press)，2000。可使用多种免疫测定技术，包括竞争性和非竞争性免疫测定(参见例如Self等，Curr.Opin.Biotechnol7:60-65(1996))。术语免疫测定涵盖但不限于以下技术：酶免疫测定(EIA)，如酶放大免疫测定技术(EMIT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、IgM抗体捕获ELISA(MAC ELISA)和微粒子酶免疫测定(MEIA)；免疫组化测定、毛细管电泳免疫测定(CEIA)；放射免疫测定(RIA)；免疫放射测定(IRMA)；荧光偏振免疫测定(FPIA)；以及化学发光测定(CL)。需要时，可使此类免疫测定自动化。免疫测定也可与激光诱导的荧光联用。(参见如Schmalzing等，Electrophoresis,2518:2184-93(1997)；Bao,J Chromatogr.B.Biomed.Sci.,699:463-80(1997))。脂质体免疫测定，如流动注射脂质体免疫测定和脂质体免疫传感器，也适用于本发明(参见如Rongen等，J.Immunol.Methods,204:105-133(1997))。此外，散射比浊测定(Nephelometryassay)也适用于本发明方法，其中蛋白质/抗体复合物的形成导致光散射增强并转换成峰率信号，该信号与标志物浓度呈函数关系()。散射比浊测定可从贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)市售获得(加利福尼亚州布利市；试剂盒#449430)，并可使用贝林(Behring)比浊分析仪实行(Fink等，J Clin.Chem.Clin.Biochem.,27:261-276(1989))。
可以直接或间接地检测抗体的特定免疫结合。可使用可检测部分(直接或间接检测)。多种可检测部分为本领域技术人员所熟知，并且可以是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电子、光学或化学手段检测的任何物质。可采用可检测部分，视所需灵敏度、与抗体结合的容易程度、稳定性要求和现有仪器及处理规定来选择标记物。合适的可检测部分包括但不限于：放射性核素、荧光染料(如荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、Oregon GreenTM(俄勒冈绿)、若丹明、德克萨斯红、四若丹明异硫氰酸酯(TRITC)、Cy3、Cy5等)、荧光标志物(如绿色荧光蛋白(GFP)、藻红蛋白等)、由肿瘤相关蛋白酶激活的自淬灭(autoquenched)荧光化合物、酶(如荧光素酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、纳米颗粒、生物素、地高辛、金属等。直接标记物包括连接至抗体的荧光标签或发光标签、金属、染料、放射性核素等。可使用经碘-125(125I)标记的抗体。采用核酸或蛋白质特异性化学发光抗体的化学发光测定适用于核酸或蛋白质水平的灵敏、非放射性检测。由荧光染料标记的抗体同样适用。荧光染料的示例包括但不限于：DAPI、荧光素、Hoechst33258、R-藻蓝蛋白、R-藻红蛋白、若丹明、德克萨斯红和丽丝胺。间接标记物包括本领域已知的多种酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、脲酶等。辣根过氧化物酶系统可以与，例如，显色底物四甲基联苯胺(TMB)联用，其在过氧化氢存在下生成可在450nm处检测的可溶性产物。碱性磷酸酶检测系统可以与，例如，显色底物对硝基苯磷酸酯联用，其产生可容易地在405nm处检测的可溶性产物。相似地，β-半乳糖苷酶检测系统可以与显色底物邻硝基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)联用，其产生可在410nm处检测的可溶性产物。脲酶检测系统可以与诸如尿素酶溴甲酚紫(urebromocresol purple)(密苏里州圣路易斯的西格玛免疫化学品公司(Sigma Immunochemicals))的底物联用。能够特异性结合免疫球蛋白恒定区的其它蛋白质(如A蛋白或G蛋白)也可用作标记试剂。这些蛋白质显示与多种物种来源的免疫球蛋白恒定区具有强非免疫反应性(参见如Kronval等，Immunol.111:1401-1406(1973)；Akerstrom等，J.Immunol.135:2589-2542(1985))。
可使用Western印迹(免疫印迹)分析来检测并定量样品中抗原的存在。该技术通常包括：基于分子量通过凝胶电泳分离样品蛋白质、将经分离的蛋白质转移至合适固体载体(如硝化纤维滤器、尼龙滤器、衍生尼龙滤器)，以及使样本与特异性结合抗原的抗体孵育。在固体载体上，抗-抗原的抗体与抗原特异性结合。这些抗体可被直接标记或可采用与所述抗-抗原的抗体特异性结合的经标记的抗体(如经标记的绵羊抗鼠抗体)来后续检测。
可按下述步骤使用ELISA法：(1)使抗体或抗原与底物结合；(2)使结合受体接触含病毒、病毒抗原或针对该病毒的抗体的液体或组织样品；(3)使上述物质接触连接有可检测部分(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗体；(4)使上述物质接触酶的底物；(5)使上述物质接触显色剂；(6)观察颜色变化。易对上述上述方法进行修改以检测样品中的抗体或特定蛋白及病毒的存在。
可采用捕获测定法检测抗原和/或针对该病毒的对象抗体。简言之，为检测样品中的抗体，使针对免疫球蛋白的抗体(如抗IgG(或IgM))结合至固相基质并被用于从血清捕获患者的免疫球蛋白。随后，使抗原或所述抗原的反应性片段接触与所述固相，然后添加经标记的抗体。随后可通过结合的经标记抗体的量来对特异性抗体定量。也可采用微量凝集测试来检测测试样品中抗原的存在。简言之，用抗体被覆乳胶珠并与测试样品混合，从而组织或体液中与所述抗体特异性反应的抗原与所述受体交联，造成凝集。沉淀物中凝集的抗体-病毒复合物可由肉眼观察到或通过分光光度计检测到。
也可采用竞争性试验来间接检测样品中存在的抗原的量。简言之，使来自对象的血清或其他体液与结合至基质(如ELISA96孔板)的抗体反应。彻底清洗除去过量血清。随后，使经标记(酶联、荧光、放射性等)的单克隆抗体与先前反应的抗体复合物反应。相对于对照检测对单克隆抗体结合的抑制的量。就对抗体-抗原复合物具有特异性反应性的单克隆抗体(MAB)而言，也可通过IFA使用单克隆抗体直接检测样品。
半抗原抑制试验是另一种竞争性试验。在该试验中，可使已知抗原固定在固体基质上。向样品添加已知量的抗-抗原抗体，然后使样品接触已固定的抗原。与已知已固定抗原结合的抗体的量与样品中存在的抗原的量呈反比。可通过检测固定的抗体部分或留在溶液中的抗体来检测已固定抗体的量。如前文所述，检测可以是直接进行(抗体经标记)或间接进行(通过后续添加特异性结合抗体的经标记部分)。
也可采用竞争结合形式的免疫测定来确定交叉反应性。例如，可使抗原固定至固体载体。可向该测定添加蛋白质，所述蛋白质竞争抗血清与固定抗原的结合。将所添加的蛋白质的竞争抗血清与固定抗原结合的能力和抗原竞争其自身的能力作比较。使用标准计算方法计算上述蛋白质的交叉反应性百分比。选择并汇集与添加的各上述蛋白质的交叉反应性低于10%的抗血清。可任选地通过与所添加的考虑的蛋白质(如远系同源物)的免疫吸附来从所述经汇集的抗血清去除交叉反应性抗体。随后，免疫吸附的且汇集的抗血清可用于在上述竞争性结合免疫测定以比较第二蛋白(认为可能是抗原的等位基因或多态变体)和免疫原蛋白。为进行该比较，以大范围浓度分别分析两种蛋白质并确定使抗血清与固定蛋白质的结合抑制50%所需的各蛋白质的量。如果抑制50%结合所需第二蛋白质的量小于抑制50%结合所需抗原的量的10倍，则认为所述第二蛋白质与针对抗原产生的多克隆抗体特异性结合。
可以分析来自直接或间接标记物的信号，例如，使用分光光度计检测显色底物的颜色；使用辐射计数器检测放射性(如用于125I检测的伽玛计数器)；或使用荧光计在特定波长的光存在下检测荧光。当标记物是放射性标记物时，检测工具包括自动射线照相术中的闪烁计数器或感光胶片。当标记物是荧光标记物时，其可通过采用合适波长的光激发荧光染料并检测产生的荧光来检测该标记。荧光可以通过使用电子检测器如电荷耦合装置(CCD)或光电倍增管等来被直观检测到。相似地，可通过提供酶的合适底物并检测生成的反应产物来检测酶标记物。比色标记物或化学发光标记物可通过观察与所述标记物相关联的颜色来简单地检测。因此，在多种浸染棒试验(dipstick assay)中，结合的金常呈现粉红色，而不同的结合珠呈现珠的颜色。为检测酶联抗体，可使用分光光度计(如EMAX微板酶标仪(加利福尼亚州门洛帕克的分子装置公司(Molecular Devices))按照生产商说明书进行定量分析。需要时，可使本发明的测定自动化或由机器人操作，并且可同时检测来自多个样品的信号。
可使抗体固定在多种固体载体上，如磁性颗粒或色谱基质颗粒、试验板(如微量滴定孔)的表面、片状的固态基质材料或膜(如塑料、尼龙、纸)等。可通过在固态载体上的以阵列形式被覆抗体或多种抗体来制备测试条(assay strip)。随后可将该测试条浸入测试样品中并通过清洗和检测步骤快速处理以生成可检测的信号(如显色斑点)。
本领域的技术人员会理解，常需要使免疫测定中的非特异性结合最小化。具体而言，当所述测定涉及固定在固体基质上的抗原或抗体时，需要使对于所述基质的非特异性结合量最小化。降低这类非特异性结合的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，该技术涉及用蛋白质组合物来被覆所述基质。具体而言，广泛使用的蛋白质组合物有例如牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉和明胶，其中最优选使用奶粉。
唾液收集设备和试剂盒
本发明中的实施方式涉及源自唾液无细胞液相部分的胞外核酸及蛋白质的分析。将唾液的收集、处理、稳定化和储存(SCPSS)设计成一体化试剂盒以收集、处理、稳定和储存唾液样本以供研究和临床应用(如基于蛋白质、RNA和DNA的分子诊断学)。
所述唾液无细胞液相部分中核酸和蛋白质的存在通过实施例中所述的方法来确定。测得核酸和蛋白质的质量符合相关技术要求，如PCR、qPCR、微阵列测定、ELISA、Western印迹等。
为获得经过滤样品，可给予对象吸收垫以在舌下放置足够长的时间以吸收唾液。可以使用能吸收唾液的任何类型的吸收垫，且SCPSS对任何产生唾液的动物有效。合适的吸收材料可包括但不限于：硝化纤维素、醋酸纤维素、聚醚砜织物、纤维素纤维(如纸条或棉花)、尼龙、泡沫胶、玻璃纤维、聚碳酸酯、聚丙烯、醋酸酯、人造纤维、聚酯吸收垫或能够收集唾液的其它合成材料。可使用本领域已知的任何其它方法来收集唾液。例如，也可采用喷吐法作为收集唾液样品的手段。一种获得唾液样品的替代性方法是使用抽吸器将唾液从口腔吸出的方法。也可简单地将在口腔中收集的唾液滴入样品容器。
在一个实施方式中，可将吸收垫单独放置在末端连接有滤器的注射器内。所述滤器可以是本文所述能够将唾液分离成无细胞液相的任何类型的滤器，例如5.0μm亲水PVDF滤器(Millex-SV，密理博公司(Millipore))。随后可使用注射器柱塞将唾液推出吸收垫并通过滤器进入收集管(图7)。所述管可预装载有蛋白质、RNA和DNA的特定稳定剂。所述管也可预装载有醇溶液。所述收集设备可以是任何类型的市售收集垫。例如，可使用SUPER·SAL或VERSI·SAL收集装置(华盛顿州温哥华市的奥西斯诊断公司(Oasis Diagnostics))收集唾液样品并进一步设置与样品过滤设备联用。在其他实施方式中，所述唾液收集装置能够在过滤后将样品分离成两份或更多份。双分离的示例装置是ULTRA·SAL-2唾液收集装置(华盛顿温哥华市的奥西斯诊断公司)(图13)。
一个实施方式描述唾液收集方法中的本文所述设备。该方法包括：将样品收集垫插入口腔足够长的时间以湿润所述样品收集垫，将所述收集垫插入接收管，施加足够的力以使所述收集垫中收集的物质通过滤器，由此形成经过滤样品，并将所述经过滤样品收集入一个或多个接收装置内。
应理解，除了核酸和蛋白质以外，还可以分析各种类型的化合物，如病毒、朊病毒、细菌(如结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、碳水化合物(如糖)、脂、脂肪酸、激素、胆固醇、代谢物和小分子药物化合物。
还应理解，该设备可用于诊断对象内的疾病。所述疾病可包括但不限于：肺癌、乳腺癌、胃癌、肝硬化、肾衰竭、溃疡癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、口腔癌、食道癌、甲状腺癌、喉癌、白血病、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、支气管癌、胰腺癌、龋齿风险、牙周炎、唾液腺疾病、头部癌、颈部癌、皮肤癌、糖尿病、吸烟状况和传染性疾病如肝炎、HIV和HCV。还应理解，该装置可用于监测对象内的pH水平。还应理解，该设备可用于测试药物使用，所述药物包括但不限于处方药品和管制药品、醇、甲基苯丙胺、可卡因、咖啡因、吗啡、可待因、安非他命、麻黄素、那可汀、DMT和MDMA。
实施例
在以下实施例中进一步说明本文所述的方法系统，其以说明的方式提供而非意在限制。
实施例1：唾液转录组直接分析(DSTA)
唾液转录组学分析的标准操作方法需要低温和漫长的mRNA分离过程。本实施例描述了用于唾液RNA临床分析的一种流水化室温处理、稳定化和储存方案。
材料和方法
DSTA方案
唾液转录组直接分析(DSTA)方法在室温下进行且使用唾液上清液(SS)替代分离的mRNA供于转录组检测，所述方法包括唾液样本的处理、稳定化和储存。通过将收集的未经刺激的全唾液在4℃2600g离心15分钟，然后从沉淀抽吸来制备SS。然后，将收获的无细胞SS密封并储存在凉爽干燥、无稳定剂的室温环境中直至使用。用储存的SS作为模板，通过反转录定量实时PCR(RT-qPCR)试验直接检测唾液mRNA。
唾液样品的收集和处理
按照机构审查委员会(Institutional Review Board)批准的方案，从5名知情同意的健康个体(平均年龄34岁)收集唾液样品。所述个体皆无恶性肿瘤史、免疫缺陷史、自体免疫紊乱史、肝炎或HIV感染史(表1)。
表1：用于DSTA性能和唾液mRNA稳定性评价的样品信息
样品ID 人种 年龄 性别 吸烟 诊断
唾液Sup-1 亚裔 34 M 否 正常
唾液Sup-2 亚裔 32 M 否 正常
唾液Sup-3 高加索人 33 M 否 正常
唾液Sup-4 亚裔 33 F 否 正常
唾液Sup-5 亚裔 38 M 否 正常
缩写：M：男性；F：女性
如前所述，在上午9～10点间收集未经刺激的全唾液样品(NavazeshM,Ann.NYAcad.Sci694:72-7(1994))，并通过离心处理以获得无细胞SS(Li等，J.Dent.Res.I83:199-203(2004))。通过显微镜确定收获的SS中无细胞。随后，将收集的各研究参与者的SS分为3等分试样(各300μL)，如图1所示。将等分试样#1直接转移至1.5-mL微量离心管中并储存。等分试样#2和#3通过DNA酶处理和唾液mRNA分离分别立即处理。采用经DNA酶处理的SS(来自等分试样#2的产物)作为对照组以反映原始SS(来自等分试样#1的产物)中的DNA干扰。对经分离的mRNA(来自等分试样#3的产物)应用唾液RNA检测的标准方法，并用作阳性对照以评价DSTA法的性能。所有SS样品(来自等分试样#1和#2的产物)都在无稳定剂条件下于室温(25℃)储存，并且将经分离的mRNA冻存于-80℃直至使用。在第0天(即收集所有样品的那天)以及储存1、2和10周后，对所有样品进行RT-qPCR试验以检测3种唾液内参基因(SIRG)的mRNA表达水平：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、9肌动蛋白β(ACTB)和核糖体蛋白S9(RPS9)。通过比较获自原始SS和经分离的mRNA的3种SIRG的mRNA表达水平来评估DSTA法的有效性。通过检测原始SS在中储存的10周期间各mRNA表达水平的变化来评价无稳定剂条件下室温储存的唾液mRNA的稳定性。
进一步进行病例对照唾液生物标志物研究来测试与长期室温储存联用的DSTA法的临床应用的可行性。从三个研究机构收集90份样品，包括来自口腔鳞状细胞癌(OSCC)患者的27份样品和来自健康对照的63份样品(参见表2)。
表2：用于DSTA口腔癌mRNA生物标志物验证的样品信息
验证样品ID 人种 年龄 性别 吸烟 诊断
V-口腔癌-001 高加索人 59 M 否 OSCC
V-口腔癌-002 高加索人 76 M 是 OSCC
V-口腔癌-003 高加索人 64 F 是 OSCC
V-口腔癌-004 高加索人 61 M 是 OSCC
V-口腔癌-005 高加索人 59 M 是 OSCC
V-口腔癌-006 高加索人 60 M 是 OSCC
V-口腔癌-007 高加索人 59 M 否 OSCC
V-口腔癌-008 高加索人 65 M 否 OSCC
V-口腔癌-009 拉丁裔 77 M 是 OSCC
V-口腔癌-010 高加索人 68 F 否 OSCC
V-口腔癌-011 高加索人 68 M 否 OSCC
V-口腔癌-012 高加索人 59 M 否 OSCC
V-口腔癌-013 高加索人 65 F 否 OSCC
V-口腔癌-014 高加索人 74 M 是 OSCC
V-口腔癌-015 高加索人 51 M 是 OSCC
V-口腔癌-016 高加索人 78 M 是 OSCC
V-口腔癌-017 高加索人 51 M 否 OSCC
V-口腔癌-018 高加索人 70 M 是 OSCC
V-口腔癌-019 高加索人 84 M 是 OSCC
V-口腔癌-020 亚裔 54 F 否 OSCC
V-口腔癌-021 高加索人 81 M 否 OSCC
V-口腔癌-022 高加索人 63 M 否 OSCC
V-口腔癌-023 高加索人 66 M 否 OSCC
V-口腔癌-024 高加索人 52 M 是 OSCC
V-口腔癌-025 拉丁裔 71 M 否 OSCC
V-口腔癌-026 拉丁裔 49 M 否 OSCC
V-口腔癌-027 高加索人 71 M 否 OSCC
V-对照-001 高加索人 65 M 否 正常
V-对照-002 高加索人 66 M 是 正常
V-对照-003 高加索人 65 F 否 正常
V-对照-004 高加索人 56 F 否 正常
V-对照-005 高加索人 62 M 是 正常
V-对照-006 高加索人 69 M 否 正常
V-对照-007 高加索人 74 M 否 正常
V-对照-008 高加索人 62 M 否 正常
V-对照-009 高加索人 80 M 是 正常
V-对照-010 高加索人 52 M 否 正常
V-对照-011 高加索人 69 M 是 正常
V-对照-012 高加索人 75 M 否 正常
V-对照-013 拉丁裔 54 M 是 正常
V-对照-014 高加索人 57 F 否 正常
V-对照-015 高加索人 72 M 否 正常
V-对照-016 亚裔 37 M 否 正常
V-对照-017 拉丁裔 64 M 是 正常
V-对照-018 拉丁裔 45 M 否 正常
V-对照-019 高加索人 56 F 否 正常
V-对照-020 高加索人 59 M 否 正常
V-对照-021 高加索人 60 M 否 正常
V-对照-022 拉丁裔 63 M 是 正常
V-对照-023 高加索人 57 M 是 正常
V-对照-024 高加索人 72 M 是 正常
V-对照-025 高加索人 62 M 否 正常
V-对照-026 高加索人 66 M 否 正常
V-对照-027 高加索人 72 M 否 正常
V-对照-028 高加索人 56 M 是 正常
V-对照-029 拉丁裔 62 F 否 正常
V-对照-030 高加索人 57 M 是 正常
V-对照-031 高加索人 45 M 否 正常
V-对照-032 高加索人 54 F 是 正常
V-对照-033 高加索人 52 M 是 正常
V-对照-034 高加索人 62 M 是 正常
V-对照-035 高加索人 55 M 是 正常
V-对照-036 高加索人 70 M 否 正常
V-对照-037 高加索人 67 F 否 正常
V-对照-038 拉丁裔 35 M 否 正常
V-对照-039 高加索人 81 M 否 正常
V-对照-040 高加索人 59 F 是 正常
V-对照-041 高加索人 61 M 否 正常
V-对照-042 高加索人 63 M 是 正常
V-对照-043 高加索人 71 M 否 正常
V-对照-044 高加索人 62 M 否 正常
V-对照-045 高加索人 54 M 是 正常
V-对照-046 拉丁裔 64 M 否 正常
V-对照-047 高加索人 64 M 是 正常
V-对照-048 高加索人 59 M 否 正常
V-对照-049 高加索人 58 M 是 正常
V-对照-050 高加索人 66 M 否 正常
V-对照-051 高加索人 77 M 是 正常
V-对照-052 高加索人 70 M 否 正常
V-对照-053 亚裔 44 M 否 正常
V-对照-054 高加索人 61 M 是 正常
V-对照-055 高加索人 51 M 否 正常
V-对照-056 高加索人 74 M 是 正常
V-对照-057 高加索人 61 M 否 正常
V-对照-058 高加索人 61 M 是 正常
V-对照-059 高加索人 82 M 是 正常
V-对照-060 高加索人 57 M 否 正常
V-对照-061 高加索人 47 M 是 正常
V-对照-062 高加索人 61 M 是 正常
V-对照-063 高加索人 47 M 否 正常
缩写：M：男性；F：女性；OSCC：口腔鳞状细胞癌。
90份唾液样品募自三个研究机构：加州大学洛杉矶分校(UCLA)、南加州大学(USC)和大洛杉矶退伍军人医院(VAGLA)。
所有患者都曾被诊断为早期OSCC且未经过化疗和/或放疗。对照组与OSCC组在性别、年龄、人种和吸烟史方面匹配，如表3所示。
表3.OSCC mRNA生物标志物验证研究中参与者的人口统计信息
人口统计变量 OSCC(n＝27) 健康对照(n＝63)
平均年龄(SD)，y 65.00(9.56) 61.29(9.28)
性别，n(％)
男性 23(85.2) 55(87.3)
女性 4(14.8) 8(12.7)
人种，n(％)
白种人 23(85.2) 54(85.7)
拉丁裔 3(1.11) 7(11.1)
亚裔 1(3.7) 2(3.2)
吸烟，n(％)
是 12(44.4) 27(42.9)
否 15(55.6) 36(57.1)
该唾液收集过程得到所有参与机构的伦理审查委员会和机构审查委员会的批准。所有参与者在样品收集前提供了书面的知情同意书。此次研究中，我们采用了来自7种OSCC唾液生物标志物基因的mRNA：人H3组蛋白家族3A(H3F3A)、白细胞介素1-β(IL1B)、白细胞介素8(IL8)、鸟胺酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)、亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶1(SAT1)、双特异性磷酸酶1(DUSP1)和S100钙结合蛋白P(S100P)(Li等，Clin.Cancer Res.10:8442-50(2004))。采用这些生物标志物基因作为概念验证(proof-of-concept)标志物并在所有研究参与者中进行测试。使用标准方法和DSTA法在第0天和在无稳定剂室温储存10周后，同时对90份样品中的7种转录本进行定量。通过可被区分的标志物的数量来评价DSTA法在临床应用中的可行性，并将其诊断性能与通过标准方法获得的结果作比较。
DNA酶处理
通过按照生产商说明书采用TURBO无DNA TM试剂盒(应用生物系统公司(Applied Biosystems))进行严格DNA酶处理，然后使DNA酶失活，来消除40μL SS中的基因组DNA(图1，各研究参与者的等分试样#2)中的基因组DNA。通过用人细胞基因组DNA(300μg/mL)进行上述DNA酶处理过程()来显示DNA去除效果(图2)。
唾液mRNA分离
使用
Figure BDA0000487180000000261
仪器(热电公司(Thermo Electron Corporation))和MagMAX病毒RNA分离试剂盒
Figure BDA0000487180000000262
(应用生物系统公司(Applied Biosystems))从300μL SS(图1，各研究参与者的等分试样#3)分离唾液mRNA。然后，用TURBO无DNA试剂盒处理经分离的mRNA，随后使DNA酶失活以去除DNA污染。使用ND-1000分光光度计(热科学公司(Thermo Scientific))利用A260/A280比值(可接受范围：1.8－2.0)来评估经分离的mRNA的纯度。通过不经反转录的qPCR显示经分离mRNA中DNA的完全除去(参见图2)。此外，通过使用RT-qPCR试验检测GAPDH、ACTB和RPS9mRNA的表达水平来评价经分离的mRNA的质量。只有那些显示全部3种基因的PCR产物的样品才被用于后续分析(Li等，Clin.Cancer Res.10:8442-50(2004))。
RT-qPCR
进行两步RT-qPCR(反转录PCR(RT-PCR)后进行qPCR，分开操作)以检测唾液转录组。通过使用SuperScript III铂金qRT-PCR系统(英杰公司(Invitrogen))和汇集的外引物组(各200nmol/L，参见表4)，并通过GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统公司(Applied Biosystems))和固定的热循环程序(参见表5)执行，来进行3种SIRG mRNA的多重RT-PCR预扩增。各研究参与者提供6L原始SS，7.08μL经DNA酶处理的SS和2μL经分离的mRNA作为RT-PCR的三种不同模版，其中样品基于mRNA量来均衡。除15份实验RT-PCR样品(5名研究参与者，每名研究参与者3份模版)以外，还制备了以无核酸酶的水作为反应模版的阴性对照(即空白组)。各反应的总体积使用无核酸酶的水调节为30μL。RT-PCR产物通过ExoSAP-IT(USB)纯化并立即进行qPCR或储存在-20℃直至使用。
表43种SIRG和7种OSCC唾液转录本的引物
Figure BDA0000487180000000271
表5RT-PCR预扩增的热循环程序
Figure BDA0000487180000000281
进行SYBR Green qPCR以定量检测唾液转录本的表达水平。通过将2X qPCR主混物(应用生物材料公司(Applied Biological Materials))、内引物(900nmol/L，参见表4)和2μL cDNA模版混合来制备qPCR样品。各反应的总体积用无核酸酶的水调节为10μL。通过使用AB-7500HT系统(应用生物系统公司(Applied Biosystems))和固定的热循环程序(表6)进行qPCR及相关的解链曲线分析。所有样品，包括阴性对照(其中cDNA模版是RT-PCR预扩增中阴性对照的产物)，对各基因以三份重复进行测试。RT-qPCR中使用的所有引物均使用PRIMER3软件跨越内含子设计，并在BLAST检索后由西格玛公司(Sigma)生产。
表6qPCR的热循环程序
Figure BDA0000487180000000291
统计学分析
由原始定量循环(Cq)值分析通过流水化方案和标准方法检测的3种SIRGmRNA和7种OSCC唾液转录本的表达水平。所有qPCR实验以三份重复进行并以平均(SD)Cq的形式显示。基于威尔克逊符号等级检验(Wilcoxon signed-rank test)以P<0.05的显著性水平使用ANOVA进行统计学比较。在病例对照唾液生物标志物研究中，当转录本在OSCC患者和对照之间出现显著差异水平(P<0.05)时，即可确认该转录本有效。此外，还对各经检测的转录本构建ROC曲线并使用MedCalc软件通过数值积分来计算该ROC曲线的曲线下面积(AUC)的值。OSCC和对照之间的P值联合AUC值代表所述生物标志物的诊断性能。
结果
为探索能否在不需要RNA分离的条件下直接检测唾液转录组，使用无细胞SS作为模板以检测3种SIRG的mRNA表达水平，并将该结果与采用标准方法得到的结果作比较。图3所示结果为唾液样品收集后立即(第0天)进行检测的结果。水(water)组的Cq值是三个重复qPCR实验的平均值，并对所有3种基因显示33。此外，无论使用何种SIRG引物，水组的解链曲线分析未显示任何峰(数据未列出)，表明RT-qPCR过程中没有试剂污染。实验安排(SS(DSTA)、SS+DNA酶和经分离的mRNA)中各基因的Cq值均是来自5名健康研究参与者的样品结果的平均值，各样品以三份重复进行分析(共15个数据点)。就GAPDH、ACTB和RPS9而言，由原始SS(DSTA)获得Cq值分别为22.84(2.36)、21.57(1.63)和20.35(1.39)，而获自经分离的mRNA的Cq值分别为25.28(1.44)、23.16(2.2)和21.42(1.33)。通过比较各SIRG的SS(DSTA)与经分离mRNA的Cq值对GAPDH、ACTB和RPS9获得的P值分别为0.092、0.233和0.247。为确保所获得的Cq值来自不受基因组DNA干扰的特定mRNA，随各qPCR运行进行解链曲线分析。在所有样品中观察到相同基因的单峰具有相似的解链温度(数据未列出)。此外，将经DNA酶处理的SS组中的SIRG的Cq值与SS(DSTA)组的值作比较时，GAPDH、ACTB和RPS9的P值分别是0.645、0.13和0.58(图3；P值：SS(DSTA)对比SS+DNA酶)。这些结果表明SS(DSTA)组的结果仅来自mRNA而不受DNA干扰，并且DSTA法的性能与唾液mRNA检测的标准方法的性能相当。应注意，SIRG的外引物和内引物都通过跨越内含子设计，这也为mRNA测定提供了额外的特异性。
为评价无稳定剂和/或核酸酶抑制剂的室温条件下的唾液mRNA的稳定性，将唾液样品储存在25℃(实验室室温)，并在第0天以及储存1、2和10周后使用RT-qPCR分析3种SIRG的mRNA表达水平。如图4所示，对于所评价的3种SIRG，通过SS(DSTA)检测平均Cq值在保存后10周略有上升且显示在整个时程内无显著差异(P>0.05；图4；P值：SS(DSTA)-第X周对比SS(DSTA)-第0天，当X为10时)。此外，在各时间点使用SS值获得的Cq值与通过经分离的mRNA检测的值都相似(P>0.05)(图4；P值：第0天和第1、2和10周的SS(DSTA)对比经分离的mRNA)。使用经DNA酶处理的SS样品以评估室温储存期间的DNA污染。如图4所示，平均Cq值与在各时间点通过原始SS检测的结果都相似(P>0.05)，表明在DSTA过程中不存在DNA干扰(图4；P值：第0天和第1、2和10周的SS(DSTA)对比SS+DNA酶)。这些结果证明SS中的mRNA可以在无稳定剂存在的室温条件下稳定长达10周而没有显著降解，并通过DSTA法分析。
采用观察到的DSTA法的性能，评价DSTA在临床研究中的可行性。对90份唾液样品(27份来自OSCC患者，而63份来自匹配的对照)分析7种先前已鉴定的OSCC唾液RNA标志物：SAT1、OAZ1、H3F3A、IL1B、IL8、DUSP1和S100P(Li等，Clin.Cancer Res.10:8442-50(2004))。为测试长期室温储存对标志物辨别力的影响，在第0天(即样品收集后立刻进行)和室温无稳定剂储存10周后通过DSTA法分析7种唾液转录本。采用标准方法平行进行7种唾液转录本的鉴定以作为阳性对照。健康对照和OSCC患者中各转录本的Cq值的定量分布示于图5，且在表7中进行统计学描述。
表7通过标准方法和流水化方法且在第0天和储存10周后分析的7种OSCC唾液mRNA生物标志物的统计学分析
Figure BDA0000487180000000301
Figure BDA0000487180000000311
a进行RT-qPCR以在独立的临床唾液样品(包括27名OSCC患者和63名健康对照)中验证7种先前已鉴定的OSCC生物标志物。
b△Cq：63名健康对照的平均Cq值－27名OSCC患者的平均Cq值。
c基于威尔克逊符号等级检验，若P<0.05，则证实该生物标志物。
通过DSTA和标准方法分析OSCC组群中所有7种唾液口腔癌RNA标志物都显示上调。采用标准方法时，7种基因转录本中的6种，H3F3A、IL1B、IL8、OAZ1、SAT1和DUSP1显示在正常样品和OSCC样品间具有显著不同的表达水平(P<0.05)。采用DSTA法时，在第0天和第10周分别证实7种口腔癌标志物中的6种(H3F3A、IL1B、IL8、OAZ1、SAT1和S100P)和5种(H3F3A、IL1B、IL8、DUSP1和S100P)(P<0.05)。采用标准方法和DSTA法分别在第0天和第10周证实唾液口腔癌标志物中的5种(H3F3A、IL1B、IL8、OAZ1和SAT1)和4种(H3F3A、IL1B、IL8和DUSP1)。值得注意的是，采用DSTA法测定时，在第0天有4种标志物(H3F3A、IL1B、IL8和SAT1)且在第10周有3种标志物(H3F3A、IL1B和IL8)显示较高的ROC图AUC值(参见表7、图6)。这些结果表明，就区分口腔癌唾液mRNA生物标志物而言，DSTA法与标准方法相当。
讨论
唾液RNA检测是分子诊断学的新兴领域(Martin等，Cancer Res.70:5203-6(2010))。本研究旨在开发一种有效、易用、室温适宜且经济的方法以进一步促进唾液转录组在转化和临床应用中的使用。
本研究显示，3种SIRG mRNA的表达水平在室温储存的唾液上清液中保持稳定长达10周。该结果与显示唾液RNA在唾液中受到特定机制保护来抵御核酸酶的结果一致。不受理论的约束，该保护现象可能是归因于唾液RNA与大分子如粘蛋白、如富含AU(腺嘌呤和尿苷)原件的结合蛋白、唾液伴侣Hsp70和凋亡小体相关联。外来体也可能在保护唾液转录组中起重要作用，其为已在唾液中发现的用于胞内mRNA转移的囊泡。外来体可在胞外RNA酶的存在下提供庇护以使唾液mRNA稳定。此外，外来体中RNA谱分析显示无核糖体RNA且大多数RNA分子的长度小于200个核苷酸(Skog等，Nat.Cell Biol.10:1470(2008))，这与唾液mRNA的平均大小一致。
先前已对7种口腔癌唾液mRNA生物标志物进行临床验证研究(Li等，Clin.Cancer Res.10:8442-50(2004))以评价DSTA法的临床性能。对已经验证有效的唾液RNA标志物数目计为基准(即在OSCC患者中显示显著上调的转录本；P<0.05)及其诊断性能，并将这些结果与通过DSTA法分析的结果作比较。通过随所有qPCR分析生成解链曲线来评价通过标准方法和DSTA法获得的产物的质量。所有样品均显示关于相同基因的单峰和相似的解链温度，表明实验中没有出现DNA污染、引导错误和/或引物二聚体矫作物。若在样品收集后立即分析唾液，通过标准方法和DSTA法获得等同的验证效率(验证7种标志物中的6种有效)，其中5种标志物是重叠的。室温储存10周后，OSCC患者中的所有7种转录本的表达仍有增加，且两种方法均证实了4种标志物。由DSTA法验证的大多数标志物显示出比标准方法分析的标志物更高的ROC图AUC值(甚至在室温储存10周后也是如此)，表明DSTA法可增强对口腔癌唾液生物标志物的检测性能。
实施例2：唾液中蛋白质组的稳定化
材料与方法
样品收集和处理
本实施例显示通过向样品添加醇，唾液蛋白质组在室温(RT)稳定约两周且不降解。
唾液样品收集自10名健康对象。所述对象均无任何恶性肿瘤病史、免疫缺陷史、自体免疫紊乱史、肝炎和/或HIV感染史，且平均年龄为35岁。对象被要求在收集前至少一小时内不进食、饮水且不使用口腔清洁产品。用水漱口后，从每名对象处收集5mL唾液至50mL Falcon管中。使用0.45μm PVDF膜(美国马塞诸塞州比尔瑞卡的密理博公司(Millipore))过滤这些唾液样品以除去细胞和任何残渣。收集流出液。在样品制备期间，唾液样品始终置于冰上。图7为样品制备的示意图。
随后，将经过滤的唾液样品等分入微量离心管并在完成下述四种不同处理后分别储存在室温、4℃和-80℃：(I)含蛋白酶抑制剂的唾液样品被制备、等分并室温放置且4℃储存。所有样品均由蒸馏水制成以保持相同体积。在所有实验中，用一份已在-80℃储存并含蛋白酶抑制剂的等分唾液样品作为阳性对照。蛋白酶抑制剂储液通过向1mL蒸馏水添加一片罗氏(Roche)完全药片(德国曼海姆的罗氏诊断公司(Roche Diagnostics GmbH)，罗氏应用科学公司(Roche Applied Science))来制得。对于每1mL唾液，添加20μL储液并通过涡旋短时混合。(II)根据之前的报道进行唾液淀粉酶消耗(Deutsch等，Electrophoresis29:4150(2008))。简言之，使唾液样品通过淀粉柱洗脱以特异性地消耗淀粉酶。(III)为进行蛋白变性实验，将唾液样品在95℃煮沸10分钟或添加20倍体积的无水乙醇(美国新泽西州的费舍尔科学公司(Fisher Scientific))。将已变性样品在室温下放置两周。随后通过20,000g离心20分钟使唾液蛋白质沉淀。(IV)对于非变性方法，向各100μL唾液添加20μL无水乙醇。所有样品用蒸馏水补至相等体积。在不同的时间点，将1份储存在室温下或4℃的唾液样品转移至-80℃冰箱并储存直至进一步分析。
蛋白浓度检测
采用BCA蛋白分析试剂盒(美国伊利诺伊州的热科学公司皮尔斯公司(ThermoScientific Pierce))检测各唾液样品的蛋白浓度。向96孔板添加等体积的各样品，重复两次。按照生产商说明书进行实验并在562nm处读板。
SDS-PAGE和Western印迹
使用等体积的各唾液样品进行SDS-PAGE和western印迹。对于SDS-PAGE，让10%Bis-Tris胶以150V在MES SDS电泳缓冲液中跑动1小时。使用预染蛋白质标准品(美国加利福尼亚州的英杰公司(Invitrogen))跟踪蛋白质迁移。随后用简单蓝(simple blue)(美国加利福尼亚州的英杰公司)对胶进行染色。对于western印迹(Zhang等，PloS ONE5:e15573)，进行唾液蛋白电泳并使用iBlot(美国加利福尼亚州的英杰公司)将其转移至PVDF膜上。根据生产商说明书，使该膜与一抗(抗肌动蛋白的小鼠单克隆抗体，美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))孵育并随后与二抗(抗小鼠IgG，来自绵羊的连接有过氧化物酶的物种特异性全抗体)在室温下孵育1小时。最后，清洗该膜并采用ECL Plus检测试剂盒(美国威斯康星州的GE医疗保健公司(GE Healthcare))显色。
胶内胰蛋白酶消化和NanoLC-MS/MS分析
胶内胰蛋白酶消化和质谱蛋白质鉴定与先前描述的相同(Xiao和Wong，Bioinformation5:294(2011))。简言之，使各片切得的凝胶脱色，并于37℃进行胶内胰蛋白酶消化过夜。随后，提取消化所致的胰蛋白酶产生的肽段并将其加载至LC-MS/MS(Eksige NanoLC-2D和Thermo LTQXL)以供蛋白质鉴定。使用Xcalibur软件v3.3.0(马萨诸塞州沃尔瑟姆的热科学公司(Thermo Scientific))收集和处理图谱。将MS与MS/MS合并的图谱从RAW转换至mzXML(ReAdW4.3.1版)并使用X!Tandem(2010.04.21版)提交检索人类蛋白质序列数据库(Human Swissprot)。搜索的参数为：酶胰蛋白酶、1个漏切位点(missed cleavage)、固定的脲甲基化修饰(C)、可变的氧化修饰(M)、母离子容差4Da和片段大小容差±0.4Da。蛋白质鉴定采用两条肽段和log(E-值)<-10的标准。
ELISA
根据生产商说明书进行β-肌动蛋白(总β-肌动蛋白夹心ELISA试剂盒(Totalβ-actin Sandwich ELISA Kit)，美国马萨诸塞州的细胞信号转导技术公司(CellSignaling Technology))和ILlβ(美国伊利诺伊州的热科学皮尔斯公司(ThermoScientific Pierce))的ELISA测试。对于ILlβ，所有唾液样品使用样品稀释液稀释2倍，对于β-肌动蛋白则稀释10倍。
数据分析
所有数据分析均使用Graphpad Prism(版本5.01)进行。基于T检验计算P值且采用p<0.05作为显著性的截止值。运行单向ANOVA以确定各组的经检测特征是否有实际差异。使用Image J软件(美国马里兰州贝塞斯达的国家卫生研究所(NIH))对western印迹条带的信号强度定量。
结果
通常在样品收集期间添加蛋白酶抑制剂以避免蛋白水解。本研究还评估了蛋白酶混合物(protease cocktail)和不同温度条件对蛋白质组稳定化的影响，因为已知它们大幅影响蛋白水解速率(Chevalier等，Clin.Proteomics3:13(2007))。除去淀粉酶可增加其他唾液蛋白质的稳定性并且便于低丰度蛋白质的鉴定(Hu等，Proteomics6:6326(2006))。已充分评价了乙醇对于蛋白质稳定化的影响(Gekko和Timasheff，Biochemistry20:4677(1981))。测试并评价所有这些方法在蛋白质组稳定化中的效率。
检测室温储存和-80C储存的唾液样品的蛋白质浓度。在-80℃储存30天后阳性对照的平均总蛋白浓度为1.19±0.15μgμL-1。发现室温储存30天的唾液的总蛋白浓度为0.76±0.215μgμL-1，比阳性对照少36％(p=0.0063,n=5)，这表明唾液蛋白质组已显著降解。
当样品在室温下储存时，人类唾液中的β-肌动蛋白降解。如图8所示，通过ELISA系统性地比较了不同处理条件下β-肌动蛋白的稳定性。如果唾液样品储存在室温下且不加任何处理，唾液样品会发生显著降解。3天后，相比于阳性对照仅剩余71.72±18%。如果将唾液保持在4℃且添加蛋白酶抑制剂，可在唾液中检测到高于85±12%的蛋白质且和阳性对照相比无显著改变。在添加蛋白酶抑制剂的室温储存唾液样品中，发现β-肌动蛋白仅稳定3天。当唾液样品储存在4℃且添加蛋白酶抑制剂时，发现β-肌动蛋白稳定约1个月而无显著降解。
淀粉酶是唾液中含量最丰富的蛋白质且显著影响其他唾液蛋白质的稳定性。将淀粉酶从唾液中除去之后，唾液蛋白质变得更稳定。图9A和B显示了进行或不进行淀粉酶消耗的唾液蛋白质的SDS-PAGE图像。在图9A中，不去除淀粉酶，室温(RT)泳道标记的条带a、b、c和d明显弱于比添加20%乙醇在室温储存3天的条带。对全部4条条带定量，随后针对对应的阳性对照条带进行标准化(图9C)。数据显示，如果不涉及处理，-80C和室温条件之间存在显著差异(p=0.024，n=4)。当唾液样品储存在室温下并添加20%乙醇时，相比于-80C条件下的样品没有显著改变(图9A)(p=0.31,n=4)。相反，如果从唾液中除去淀粉酶，-80C和室温条件或室温且添加20％乙醇的条件之间没有显著降解(图9B)(p值分别为：p=0.17和p=0.36，n＝4)。储存7天后唾液中β-肌动蛋白的western印迹显示除去淀粉酶后β-肌动蛋白更加稳定(图9D和E)。如果添加了20％乙醇，β-肌动蛋白的稳定化效率更高。为了检测去除淀粉酶会保护何种蛋白质，对图9B室温(RT)泳道的4条条带进行LC-MS/MS以鉴定蛋白质。条带a中，鉴定出三种蛋白质，包括桥粒斑蛋白、脑恶性肿瘤缺失基因1(deleted in malignant brain tumors1)蛋白和多配体聚糖结合蛋白2(syndecan-binding protein2)。在条带b中，发现7种蛋白质(粘蛋白-7、四肽重复同源异形盒蛋白1、杀菌/通透性增加蛋白样1、乳运铁蛋白、过氧化物酶体增殖因子活化受体γ辅助激活蛋白1、α-2-巨球蛋白和聚免疫球蛋白受体)。在条带c中，出现了免疫球蛋白的若干同种型，如重链V-III、α-2、γ-1、γ-2和γ-4。此外，还鉴定了碳酸酐酶6、结合珠蛋白相关蛋白和胞质1肌动蛋白。在条带d中，发现了6种蛋白质。它们是Igλ-1、Igκ、酶原颗粒蛋白16、短颚肺和鼻上皮细胞癌症关联蛋白2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和L-乳酸脱氢酶。
我们还探索了热变性及乙醇变性以使唾液蛋白质组稳定的应用。通过95C煮沸10分钟或通过采用20倍体积乙醇沉淀来处理唾液样品。随后在室温下储存这些唾液样品。两周后，使用western印迹检测这些样品中的β-肌动蛋白并与阳性对照作比较(图10A)。这些经变性的样品在室温放置后没有显著变化。尤其对于乙醇沉淀，β-肌动蛋白的稳定性在这五个样品中非常一致(图10B，p=0.42,n=5)，而煮沸处理的唾液样品中存在相对较大的偏差(p=0.071,n=5)。
通过比较所用的使唾液蛋白稳定的这些方法，选择20％乙醇作为室温下使唾液蛋白质组稳定的最佳方法。通过向样品添加乙醇并使其在室温下保持不同的时间间隔，通过免疫测定来检测两种蛋白质，包括β-肌动蛋白和IL1β。
图11A显示了不同处理条件下β-肌动蛋白的western印迹结果。其对应的定量结果示于图11B。这些结果显示，相比于-80C，室温下第3、7和14天后出现了显著的β-肌动蛋白降解。通过向唾液样品添加20％乙醇，在室温下观察到的蛋白降解被阻止，相比于-80C没有显著差异(图11B)(p>0.05,n=8)。但在30天后，即使添加了乙醇仍能观察到β-肌动蛋白的显著降解(p=0.0071,n=7)。
已经验证IL1β是一种口腔癌唾液生物标志物，在本研究中通过ELISA测试该蛋白质。虽然在延长的时程中出现了降解，但图12中的数据显示，在室温下甚至在30天后IL1β仍能保持稳定(p>0.05)。通过添加20％乙醇，提高了该蛋白质的稳定性(p>0.05,n=10)。
讨论
除了蛋白质以外，人类唾液中还存在其他类型的分析物，如RNA(19)、微小RNA(Michael等，Oral Dis.16:34(2010))、DNA(Jiang等，Clin.Cancer Res.11:2486(2005))、代谢物(Sugimoto等，Metabolomics6:78(2010))、细胞(Xie等，Proteomics7:486(2008))和微生物(Ryu等，J.Oral Rehabil.37:194(2010))。所有这些分析物都有可能影响唾液蛋白质组的质量和组成。例如，唾液中含有不同种类的蛋白酶，其能够消化不同蛋白质。本研究中使用的蛋白酶抑制剂混合物片剂被设计为抑制广谱的丝氨酸、半胱氨酸和金属蛋白酶以及钙激活酶(Chevalier等，Proteomics3:13(2007))。微生物也会产生一些能够改变人类唾液蛋白质组组成的代谢物。RNA可能会与蛋白质相互作用并变得稳定(Palanisamy等，J.Dent.Res.87:772(2008))。储存温度也会改变不同蛋白酶的活性，从而改变不同蛋白质的稳定性。考虑到所有这些因素，唾液蛋白质组面临着在不同环境下被消化或改变的巨大风险。
通过测试所选蛋白质靶标评价了不同方法的有效性。为了适当地使唾液蛋白质稳定，应抑制唾液蛋白酶的活性。否则，如图9A所示，唾液蛋白会快速降解。为了降低微生物的代谢，应将唾液样品保持在-80℃。
因为不经任何处理的唾液样品会被非常快速地消化，所以添加蛋白酶抑制剂以阻止蛋白质降解，但室温下30天后唾液蛋白质浓度显著低于阳性对照。本文所提供的数据显示，添加蛋白酶抑制剂和4℃储存能使蛋白质有效稳定约两周。但添加蛋白酶抑制剂仅能使唾液样品在室温下稳定3天而无明显变化。
淀粉酶消耗后，唾液蛋白质组变得更加稳定。相比于不进行淀粉酶消耗，除去淀粉酶后室温下唾液蛋白质的降解不明显(图9A和B)。总之，在所选4条凝胶条带中鉴定出24种可能因去除淀粉酶而受到保护的蛋白质。其大部分含有结合性分子功能和催化活性。去除淀粉酶将十分有利于低丰度蛋白的表征(Hu等，Proteomics6:6326(2006))。然而，虽然这一策略在使唾液蛋白质稳定方面具有前景，但该方法仍有一些劣势。首先，唾液样品需要额外处理，增加了样品收集的复杂性。其次，淀粉酶消耗后，唾液样品会被稀释5～10倍，这可能会影响下游分析。最后，使用淀粉柱也会除去一些唾液蛋白质。
蛋白质的变性杀死微生物并改变蛋白质结构。加热和有机溶剂都能通过改变蛋白质结构来使蛋白质稳定(Polson等，Anal.Technol.Biomed.Life Sci.785:263(2003))。本文所提供的数据显示，经变性的唾液样品能在室温下储存两周，且相比于阳性对照无明显改变。然而，在临床使用中，这些蛋白质不适用于一些分析，如结构相关的分析和测定，以及免疫测定(如ELISA)。通过将乙醇的添加量降低至20％，仍能够使唾液中的蛋白质在室温下稳定至少两周并使其不出现明显降解(图11和12)。
实施例3：唾液收集、处理、稳定化和储存(SCPSS)
对象被要求在收集前至少2小时内不进食、喝水、吸烟或进行口腔清洁活动。然后，使用Oasis唾液收集器“Super·SAL”(图13)10～15分钟以收集未经刺激的全唾液。随后，将收集的唾液针对各分子构成成分(DNA、蛋白质和RNA)的稳定化和储存进行处理。
收集管中预先加载蛋白质、RNA和DNA的特定稳定剂。所有样品可在室温下运输和储存。
哺乳动物和微生物DNA的分离
将一份等分全唾液(1～2mL)分配至微量离心管中。添加等体积的2x裂解液和DNA稳定缓冲液(Oasis Diagnostics)并保持在室温下。
RNA的分离
为获得唾液RNA和蛋白质，推动经收集的唾液使其通过在样品过滤末端带有过滤装置(密理博(Millipore)MGGF滤器，5μm亲水PVDF膜)的空心圆管以除去细胞、微生物和残渣。
将一半体积的唾液滤液在室温下储存于微量离心管中用于下游应用，包括唾液转录组直接分析。该样品被保持在室温下。
多肽的分离
将一半的唾液滤液置于微量离心管中，向样品添加等体积的40％乙醇。该样品被保持在室温下。
实施例4：经收集的唾液样品中蛋白质和核酸的分析
对象被要求在收集前至少2小时内不进食、喝水、吸烟和进行口腔清洁活动。然后使用用于唾液收集的设备以收集未经刺激的全唾液，所述设备包括样品收集垫、接收装置和与接收装置相连的滤器。所述滤器是能够滤去细胞和微生物的5μm亲水膜。
将无细胞、微生物和残渣的经过滤样品(1～2ml)等分至两个微量离心收集管中。第一管内将含有20％乙醇溶液而第二管内不含乙醇。所有收集步骤均在室温下进行。
蛋白质分析
使含20％乙醇溶液的第一管中收集的经过滤样品在室温储存至多两周以供下游应用。
对用于蛋白质分析的经过滤样品进行蛋白质浓度检测，而所述样品将用于SDS-PAGE和western印迹分析。对唾液蛋白质进行电泳并将其转移至蛋白质膜上。使含所述蛋白质的膜与一抗并继而与二抗孵育。随后采用胶内胰蛋白酶消化和质谱鉴定胞外唾液蛋白质。
RNA分析
使不加乙醇的第二管中收集的经过滤样品在室温下储存至多10周以供下游应用，包括唾液转录组直接分析。然后，采用DNA酶处理经过滤的样品。随后，使用RT-qPCR来分析胞外唾液mRNA的表达水平。使用原始定量循环(Cq)值的标准方法检测唾液转录本的表达水平。基于威尔克逊符号等级检验以P<0.05的显著性水平通过ANOVA进行统计学比较。
本实施例描述了对收集自唾液样品的蛋白质和核酸进行双重分析，所述分析可由任何人进行而并不要求接受过特殊培训的技术人员。收集并等分样品以供蛋白质和核酸分析，并且在分析前于室温下储存样品。
提供上述实施例以对本领域普通技术人员完全公开如何制备并使用本公开中的组合物、系统和方法的实施方式，而非意在限制发明人所认为的其公开的范围。对本领域技术人员而言显而易见的用于实施本公开的上述模式的修改形式也落在下述权利要求的范围内。说明书中所提及的专利和发表物表示本公开适用的本领域技术人员的技术水平。本公开中引用的所有参考文献均通过引用纳入本文，如同每篇参考文献均分别通过引用其全文纳入本文。

Claims (28)

1.一种使分离自唾液样品的核酸和蛋白质样品稳定的方法，所述方法包括：
a)从对象收集唾液样品；
b)过滤该唾液样品以生成无细胞的经过滤样品；
c)将所述经过滤样品收集在至少第一和第二接收装置中；
d)向所述第一接收装置添加乙醇溶液以生成含醇的经过滤样品，该样品包含蛋白质样品，条件是不向所述第二接收装置添加醇以生成无醇的经过滤的样品，该样品包含核酸样品；其中，使所述蛋白质样品和所述核酸样品在25摄氏度下储存时稳定至少3天；和
e)对所述第一和第二接收装置中收集的经过滤样品进行分析，所述分析包括如下一种或多种：对含醇的经过滤样品进行蛋白质分析和对无醇的经过滤样品进行核酸分析。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸是DNA。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述核酸分析是聚合酶链式反应(PCR)。
4.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述核酸是RNA。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述核酸分析是RT-PCR。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR是反转录定量实时PCR(RT-qPCR)。
7.如权利要求1～6所述的方法，其特征在于，所述醇溶液包含20%乙醇。
8.如权利要求1～7所述的方法，其特征在于，所述蛋白质分析包括western印迹、质谱蛋白质鉴定或ELISA。
9.如权利要求1～8所述的方法，其特征在于，所述经过滤样品在室温下储存。
10.如权利要求1～9所述的方法，其特征在于，所述经过滤样品在室温下储存至少两周且所述经过滤样品中存在的蛋白质或核酸的降解不超过50%。
11.如权利要求1～10所述的方法，其特征在于，所述经过滤样品在室温下储存至少两周且所述经过滤样品中存在的蛋白质或核酸的降解不超过25%。
12.如权利要求1～11所述的方法，其特征在于，所述经过滤样品在室温下储存至少十周且所述经过滤样品中存在的蛋白质或核酸的降解不超过50%。
13.如权利要求1～12所述的方法，其特征在于，所述经过滤样品在室温下储存至少十周且所述经过滤的样品中存在的蛋白质或核酸降解不超过25%。
14.如权利要求1～13所述的方法，其特征在于，所述醇溶液包含15～25%的乙醇。
15.如权利要求1～14所述的方法，其特征在于，所述醇溶液包含5～35%的乙醇。
16.如权利要求1～15所述的方法，其特征在于，所述滤器选自下组：0.22μm、0.45μm和5.0μm亲水膜。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述滤器是0.22μm亲水膜。
18.一种唾液收集设备，所述设备包括样品收集垫、滤器、两个或更多个接收装置，其特征在于，所述接收装置选自：mRNA收集管、多肽收集管和DNA收集管，其中，所述多肽收集管包含乙醇溶液，且所述DNA收集管包含DNA稳定剂，其中，所述滤器可操作地连接至所述接收装置。
19.如权利要求18所述的设备，其特征在于，所述滤器选自下组：0.22μm、0.45μm和5.0μm亲水膜。
20.如权利要求19所述的设备，其特征在于，所述滤器是0.22μm亲水膜。
21.一种使用权利要求18所述设备的方法，所述方法包括：将所述样品收集垫插入口腔足够长的时间以润湿所述样品收集垫，将所述收集垫插入接收管，施加足够的力使所述收集垫中收集的物质通过所述滤器，由此形成经过滤样品，并将所述经过滤样品收集进入一个或多个接收装置。
22.一种使分离自唾液样品的核酸和蛋白质样品稳定的方法，所述方法包括：
a)从人类对象收集唾液样品；
b)使用0.22μm～5.0μm的亲水膜过滤所述唾液样品以生成无细胞的经过滤样品；
c)将所述经过滤的样品收集在至少第一和第二接收装置中；
d)向所述第一接收装置添加乙醇溶液以生成含20%乙醇的经过滤样品，该样品包含蛋白质样品，条件是不向所述第二接收装置添加醇以生成无醇的经过滤样品，该样品包含核酸样品；其中，使所述蛋白质样品和核酸样品在25摄氏度下储存时稳定至少3天。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，使所述蛋白质样品在25摄氏度下储存时稳定至少2周。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，使所述核酸样品在25摄氏度下储存时稳定至少10周。
25.如权利要求22～24所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：(e)对所述第一和第二接收装置中收集的经过滤样品进行分析，所述分析包括如下一种或多种：对含乙醇的经过滤样品进行蛋白质分析和对无醇的经过滤样品进行核酸分析。
26.如权利要求22～25所述的方法，其特征在于，所述乙醇溶液包含15～25%的乙醇。
27.如权利要求22～26所述的方法，其特征在于，所述乙醇溶液包含5～35%的乙醇。
28.如权利要求22～27所述的方法，其特征在于，所述亲水膜是0.22μm。
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