CN112630278B - 一种检测神经元特异性烯醇化酶的夹心型电化学免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种检测神经元特异性烯醇化酶的夹心型电化学免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于新型纳米材料与生物传感检测技术领域，提供了一种检测神经元特异性烯醇化酶的夹心电化学免疫传感器的制备方法及应用。具体是以负载钯纳米粒子的双壳Cu2O空心球Pd NPs@DSHSs‑Cu2O为信号放大平台，以负载金纳米粒子的氧化石墨烯掺杂的聚3，4乙二氧基噻吩纳米棒Au NPs/PEDOT/GO为基底材料，制备了一种夹心型电化学免疫传感器并实现了对神经元特异性烯醇化酶的定量检测。

Description

一种检测神经元特异性烯醇化酶的夹心型电化学免疫传感器 的制备方法及应用
技术领域
本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种检测神经元特异性烯醇化酶免疫传感器的制备及应用。
背景技术
神经元特异性烯醇化酶是烯醇化酶的糖酵解神经特异性同工酶，可提供小细胞肺癌和神经母细胞瘤的病程和治疗结果等信息。临床诊断发现，当人血清中的神经元特异性烯醇化酶浓度大于100 ng/mL 时，小细胞肺癌发生的几率很大。此外，已有报道称神经元特异性烯醇化酶也可作为预测脑梗死，创伤性脑损伤和克雅氏病的生物标志物。因此，实现神经元特异性烯醇化酶的定量准确检测对早期临床诊断很有必要。
到目前为止，检测神经元特异性烯醇化酶的分析方法多种多样，如电化学发光酶免疫法，荧光免疫分析法，电化学适配传感器等。值的得注意的是，电化学免疫分析法是将免疫分析与电化学分析相结合的产物。因其相当大的灵敏度、可接受的特异性、操作便捷、成本低等优点而被认为是最有潜力的分析方法。其中，基于抗原和抗体特异性识别的夹心型电化学免疫传感器具有选择性好，背景噪声低的优点，已被用于抗体的定量检测。
本发明采用负载钯纳米粒子的双壳Cu2O空心球Pd NPs@DSHSs-Cu2O作为信号放大策略，具有高比表面积的双壳空心结构提供了丰富的催化活性位点，基于DSHSs-Cu2O与PdNPs的协同作用实现了对H2O2的有效还原，放大了电流信号。更重要的是，通过Pd-N键可以增加与第二抗体Ab2的偶联。采用负载金纳米粒子的氧化石墨烯掺杂的聚3，4乙二氧基噻吩纳米棒Au NPs/PEDOT/GO作为基底材料。纳米棒状结构提供了较高的比表面积，促进了界面电子传递，表面暴露的羧基和负载的小尺寸金纳米粒子有效增加了第一抗体Ab1的结合位点，提高了免疫传感器的灵敏度。测试结果表明，构建的免疫传感器具有良好的特异性，稳定性和重现性。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种检测神经元特异性烯醇化酶的夹心型电化学免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将制备的夹心型电化学免疫传感器用于神经元特异性烯醇化酶的定量检测。
本发明的技术方案，包括以下步骤：
(1)负载钯纳米粒子的双壳Cu2O空心球标记的神经元特异性烯醇化酶第二抗体PdNPs@DSHSs-Cu2O/Ab2的制备；
(2)负载金纳米粒子的氧化石墨烯掺杂的聚3，4乙二氧基噻吩纳米棒Au NPs/PEDOT/GO的制备；
(3)夹心型电化学免疫传感器的制备；
(4)通过时间-电流法对神经元特异性烯醇化酶进行检测。
其中步骤(1)负载钯纳米粒子的双壳Cu2O空心球标记的神经元特异性烯醇化酶第二抗体Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2的制备包括：
①DSHSs-Cu2O的制备
将0.03 ~ 0.07 g 的CuSO4·5H2O溶于90 ~ 110 mL、0.13 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中；然后，将0.18 ~ 0.38 g的抗坏血酸加入上述溶液中，搅拌状态下加热至60℃；保持20 min，后冷却至室温；再将8 ~ 12 mL、0.2 mol/L的NaOH溶液缓慢滴加到上述溶液中，搅拌反应10 min，离心分离，用超纯水和无水乙醇分别洗涤3次； 50℃真空干燥5h制得DSHSs-Cu2O；
②Pd NPs@DSHSs-Cu2O的制备
将7 ~ 8 mg的DSHSs-Cu2O和30 ~ 70 mg的聚乙烯吡咯烷酮加至7 ~ 15 mL超纯水中，搅拌状态下加入4 ~ 10 mL、10 mmol/L的四氯钯酸钠溶液，搅拌20 min后，通过离心收集沉淀物，并用超纯水和无水乙醇洗去杂质，并将得到的沉淀物在55℃真空干燥过夜制得Pd NPs@DSHSs-Cu2O；
③Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2分散液的制备
取上述步骤②制备的Pd NPs@DSHSs-Cu2O3 ~ 4 mg分散在3 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液中，加入2 mL、10 ~ 30 µg/mL的Ab2溶液，在4℃下振荡8 h，离心后将下层沉淀重新分散在2.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液中，制得Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2分散液，4℃下保存。
其中步骤(2)负载金纳米粒子的氧化石墨烯掺杂的聚3，4乙二氧基噻吩纳米棒AuNPs/PEDOT/GO的制备包括：
①制备PEDOT/GO分散液
首先，将560 ~ 580 µL、1.0 mol/L的FeCl3·6H2O加入到430 ~ 440 µL、0.5 mg/mL的氧化石墨烯GO水溶液中超声15 min，此溶液标记为A；将0.8 ~ 1.6 mL的3，4乙二氧基噻吩和160 ~ 170 µL、0.2 mol/L的三氯甲烷混合后得到的溶液标记为B，将A溶液缓慢滴加至B溶液，后60℃下静置过夜，用超纯水洗涤三次；将所得沉淀分散在2 mL超纯水制得PEDOT/GO分散液，备用；
②制备Au NPs溶液
将1 ~ 2 mL的氯金酸溶液加入至99 mL的超纯水中，在匀速搅拌的条件下加热至沸腾，加入2 ~ 3 mL、1.0 wt%的柠檬酸钠溶液后保持沸腾15 min，，冷却至室温，制得AuNPs溶液， 4℃储存备用；
③制备Au NPs/PEDOT/GO
将3 ~ 5 mL、2.3 mg/mL的PEDOT/GO分散液与5 ~ 7 mL的Au NPs溶液混合后超声2h，室温条件下继续振荡7 h，后离心分离，在60℃真空干燥12 h。
其中步骤(3)夹心型电化学免疫传感器的制备包括：
①将直径为3 ~ 5 mm的玻碳电极用粒径为0.05 µm的抛光粉抛光成镜面；
②取6.0 µL、2. ~ 3 mg/mL的Au NPs/PEDOT/GO分散液滴涂到抛光好的电极表面，室温下干燥；
③继续将6.0 µL、8 ~ 12 µg/mL的神经元特异性烯醇化酶抗体滴涂到电极表面，在4℃下干燥；
④继续将6.0 µL、0.8 ~ 1.2 wt%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH = 6.98的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面以除去未结合的牛血清白蛋白溶液，在4℃下干燥；
⑤继续将6.0 µL、0.00005 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原溶液滴涂至电极表面，用pH = 6.98的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，在4℃下干燥；
⑥继续将6.0 µL、2.5 ~ 3.5 mg/mL的Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2分散液滴涂于电极表面，置于4℃中孵育85 min后用pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，在4℃下干燥，制得夹心型电化学免疫传感器。
其中步骤(4)通过时间-电流法对神经元特异性烯醇化酶进行检测包括：
①使用三电极系统进行电化学测试：所制备的夹心型电化学免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在10 mL、50 mmol/L的pH为5.29 ~ 8.04的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②通过时间-电流曲线法进行检测，初始电压为-0.4 V；待电流稳定后，向10 mL的磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的过氧化氢溶液，分别记录不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原所产生的电流值；
③绘制检测神经元特异性烯醇化酶抗原的夹心型电化学免疫传感器的工作曲线。
本发明所用的原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
(1)本发明以负载金纳米粒子的氧化石墨烯掺杂的聚3，4乙二氧基噻吩纳米棒AuNPs/PEDOT/GO作为基底材料，其优势在于具有优异的电导率和环境稳定性，可以促进电子的传递效率。而且纳米棒提供了较大的比表面积，使其通过Au-S键增加金纳米粒子负载量，进而增加Ab1的负载量，提高免疫传感器的灵敏度；
(2)本发明以负载钯纳米粒子的双壳层Cu2O空心球Pd NPs@DSHSs-Cu2O作为第二抗体标记物来实现信号的放大。粗糙的双壳空心结构具有较大的比表面积，不仅暴露了丰富的催化活性位点还能负载更多的钯纳米粒子，从而实现对第二抗体的有效结合。更重要的是，DSHSs-Cu2O和Pd NPs的协同作用可以有效地还原H2O2；
(3)本发明所构建的夹心型电化学免疫传感器通过时间-电流曲线法对神经元特异性烯醇化酶进行检测，实现了精确定量检测神经元特异性烯醇化酶的目的，时间-电流曲线法的检测范围是0.000005 ~ 100.0 ng/mL，最低检测下限为16.67 fg/mL；
本发明的夹心型电化学免疫传感器表现出了优良的特异性、稳定性、重现性与高的灵敏度，免疫分析检测限低、操作简便，可用于临床分析。
实施例1负载钯纳米粒子的双壳Cu2O空心球标记的神经元特异性烯醇化酶第二抗体Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2的制备包括：
①DSHSs-Cu2O的制备
将0.03 g 的CuSO4·5H2O溶于90 mL、0.13 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中；然后，将0.18 g的抗坏血酸加入上述溶液中，搅拌状态下加热至60℃；保持20 min，后冷却至室温；再将8 mL、0.2 mol/L的NaOH溶液缓慢滴加到上述溶液中，搅拌反应10 min，离心分离，用超纯水和无水乙醇分别洗涤3次； 50℃真空干燥5 h制得DSHSs-Cu2O；
②Pd NPs@DSHSs-Cu2O的制备
将7 mg的DSHSs-Cu2O和30 mg的聚乙烯吡咯烷酮加至7 mL超纯水中，搅拌状态下加入4 mL、10 mmol/L的四氯钯酸钠溶液，搅拌20 min后，通过离心收集沉淀物，并用超纯水和无水乙醇洗去杂质，并将得到的沉淀物在55℃真空干燥过夜制得Pd NPs@DSHSs-Cu2O；
③Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2分散液的制备
取上述步骤②制备的Pd NPs@DSHSs-Cu2O3 mg分散在3 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液中，加入2 mL、10 µg/mL的Ab2溶液，在4℃下振荡8 h，离心后将下层沉淀重新分散在2.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液中，制得Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2分散液，4℃下保存。
实施例2负载钯纳米粒子的双壳Cu2O空心球标记的神经元特异性烯醇化酶第二抗体Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2的制备包括：
①DSHSs-Cu2O的制备
将0.05 g 的CuSO4·5H2O溶于100 mL、0.13 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中；然后，将0.28 g的抗坏血酸加入上述溶液中，搅拌状态下加热至60℃；保持20 min，后冷却至室温；再将10 mL、0.2 mol/L的NaOH溶液缓慢滴加到上述溶液中，搅拌反应10 min，离心分离，用超纯水和无水乙醇分别洗涤3次； 50℃真空干燥5 h制得DSHSs-Cu2O；
②Pd NPs@DSHSs-Cu2O的制备
将7.5 mg的DSHSs-Cu2O和50 mg的聚乙烯吡咯烷酮加至10 mL超纯水中，搅拌状态下加入7 mL、10 mmol/L的四氯钯酸钠溶液，搅拌20 min后，通过离心收集沉淀物，并用超纯水和无水乙醇洗去杂质，并将得到的沉淀物在55℃真空干燥过夜制得Pd NPs@DSHSs-Cu2O；
③Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2分散液的制备
取上述步骤②制备的Pd NPs@DSHSs-Cu2O3.5 mg分散在3 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液中，加入2 mL、20 µg/mL的Ab2溶液，在4℃下振荡8 h，离心后将下层沉淀重新分散在2.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液中，制得Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2分散液，4℃下保存。
实施例3负载钯纳米粒子的双壳Cu2O空心球标记的神经元特异性烯醇化酶第二抗体Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2的制备包括：
①DSHSs-Cu2O的制备
将0.07 g 的CuSO4·5H2O溶于110 mL、0.13 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中；然后，将0.38 g的抗坏血酸加入上述溶液中，搅拌状态下加热至60℃；保持20 min，后冷却至室温；再将12 mL、0.2 mol/L的NaOH溶液缓慢滴加到上述溶液中，搅拌反应10 min，离心分离，用超纯水和无水乙醇分别洗涤3次； 50℃真空干燥5 h制得DSHSs-Cu2O；
②Pd NPs@DSHSs-Cu2O的制备
将8 mg的DSHSs-Cu2O和70 mg的聚乙烯吡咯烷酮加至15 mL超纯水中，搅拌状态下加入10 mL、10 mmol/L的四氯钯酸钠溶液，搅拌20 min后，通过离心收集沉淀物，并用超纯水和无水乙醇洗去杂质，并将得到的沉淀物在55℃真空干燥过夜制得Pd NPs@DSHSs-Cu2O；
③Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2分散液的制备
取上述步骤②制备的Pd NPs@DSHSs-Cu2O4 mg分散在3 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液中，加入2 mL、30 µg/mL的Ab2溶液，在4℃下振荡8 h，离心后将下层沉淀重新分散在2.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液中，制得Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2分散液，4℃下保存。
实施例4负载金纳米粒子的氧化石墨烯掺杂的聚3，4乙二氧基噻吩纳米棒Au NPs/PEDOT/GO的制备包括：
①制备PEDOT/GO分散液
首先，将560 µL、1 mol/L的FeCl3·6H2O加入到430 µL、0.5 mg/mL的氧化石墨烯GO水溶液中超声15 min，此溶液标记为A；将0.8 mL的3，4乙二氧基噻吩和160 μL、0.2 mol/L的三氯甲烷混合后得到的溶液标记为B，将A溶液缓慢滴加至B溶液，后60℃下静置过夜，用超纯水洗涤三次；将所得沉淀分散在2 mL超纯水制得PEDOT/GO分散液，备用；
②制备Au NPs溶液
将1 mL的氯金酸溶液加入至99 mL的超纯水中，在匀速搅拌的条件下加热至沸腾，加入2 mL、1 wt%的柠檬酸钠溶液后保持沸腾15 min，冷却至室温，制得Au NPs溶液， 4℃储存备用；
③制备Au NPs/PEDOT/GO
将3 mL、2.3 mg/mL的PEDOT/GO分散液与5 mL的Au NPs溶液混合后超声2 h，室温条件下继续振荡7 h，后离心分离，制得Au NPs/PEDOT/GO。
实施例5制备Au NPs/PEDOT/GO包括：
①制备PEDOT/GO分散液
首先，将570 µL、1 mol/L的FeCl3·6H2O加入到440 µL、0.5 mg/mL的氧化石墨烯GO水溶液中超声15 min，此溶液标记为A；将1.2 mL的3，4乙二氧基噻吩和170 μL、0.2 mol/L的三氯甲烷混合后得到的溶液标记为B，将A溶液缓慢滴加至B溶液，后60℃下静置过夜，用超纯水洗涤三次；将所得沉淀分散在2 mL超纯水制得PEDOT/GO分散液，备用；
②制备Au NPs溶液
将1.5 mL的氯金酸溶液加入至99 mL的超纯水中，在匀速搅拌的条件下加热至沸腾，加入3 mL、1 wt%的柠檬酸钠溶液后保持沸腾15 min，冷却至室温，制得Au NPs溶液， 4℃储存备用；
③制备Au NPs/PEDOT/GO
将4 mL、2.3 mg/mL的PEDOT/GO分散液与6 mL的Au NPs溶液混合后超声2 h，室温条件下继续振荡7 h，后离心分离，制得Au NPs/PEDOT/GO。
实施例6制备Au NPs/PEDOT/GO包括：
①制备PEDOT/GO分散液
首先，将580 µL、1 mol/L的FeCl3·6H2O加入到450 µL、0.5 mg/mL的氧化石墨烯GO水溶液中超声15 min，此溶液标记为A；将1.6 mL的3，4乙二氧基噻吩和180 μL、0.2 mol/L的三氯甲烷混合后得到的溶液标记为B，将A溶液缓慢滴加至B溶液，后60℃下静置过夜，用超纯水洗涤三次；将所得沉淀分散在2 mL超纯水制得PEDOT/GO分散液，备用；
②制备Au NPs溶液
将2 mL的氯金酸溶液加入至99 mL的超纯水中，在匀速搅拌的条件下加热至沸腾，加入4 mL、1 wt%的柠檬酸钠溶液后保持沸腾15 min，冷却至室温，制得Au NPs溶液， 4℃储存备用；
③制备Au NPs/PEDOT/GO
将5 mL、2.3 mg/mL的PEDOT/GO分散液与7 mL的Au NPs溶液混合后超声2 h，室温条件下继续振荡7 h，后离心分离，制得Au NPs/PEDOT/GO。
实施例7夹心型电化学免疫传感器的制备包括：
①将直径为3 mm的玻碳电极用粒径为0.05 µm的抛光粉抛光成镜面；
②取6.0 µL、2 mg/mL的Au NPs/PEDOT/GO分散液滴涂到抛光好的电极表面，室温下干燥；
③继续将6.0 µL、8 µg/mL的神经元特异性烯醇化酶抗体滴涂到电极表面，在4℃下干燥；
④继续将6.0 µL、0.8 wt%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH = 6.98的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面以除去未结合的牛血清白蛋白溶液，在4℃下干燥；
⑤继续将6.0 µL、0.00005 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原溶液滴涂至电极表面，用pH = 6.98的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，在4℃下干燥；
⑥继续将6.0 µL、2.5 mg/mL的Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2分散液滴涂于电极表面，置于4℃中孵育85 min后用pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，在4℃下干燥，制得夹心型电化学免疫传感器。
实施例8制备检测NSE的夹心型电化学免疫传感器的工作电极包括：
①将直径为4 mm的玻碳电极用粒径为0.05 µm的抛光粉抛光成镜面；
②取6.0 µL、2.5 mg/mL的Au NPs/PEDOT/GO分散液滴涂到抛光好的电极表面，室温下干燥；
③继续将6.0 µL、10 µg/mL的神经元特异性烯醇化酶抗体滴涂到电极表面，在4℃下干燥；
④继续将6.0 µL、1 wt%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH = 6.98的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面以除去未结合的牛血清白蛋白溶液，在4℃下干燥；
⑤继续将6.0 µL、0.00005 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原溶液滴涂至电极表面，用pH = 6.98的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，在4℃下干燥；
⑥继续将6.0 µL、3 mg/mL的Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2分散液滴涂于电极表面，置于4℃中孵育85 min后用pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，在4℃下干燥，制得夹心型电化学免疫传感器。
实施例9制备检测NSE的夹心型电化学免疫传感器的工作电极包括：
①将直径为5 mm的玻碳电极用粒径为0.05 μm的抛光粉抛光成镜面；
②取6.0 µL、3 mg/mL的Au NPs/PEDOT/GO分散液滴涂到抛光好的电极表面，室温下干燥；
③继续将6.0 µL、12 µg/mL的神经元特异性烯醇化酶抗体滴涂到电极表面，在4℃下干燥；
④继续将6.0 µL、1.2 wt%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH = 6.98的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面以除去未结合的牛血清白蛋白溶液，在4℃下干燥；
⑤继续将6.0 µL、0.00005 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原溶液滴涂至电极表面，用pH = 6.98的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，在4℃下干燥；
⑥继续将6.0 µL、3.5 mg/mL的Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2分散液滴涂于电极表面，置于4℃中孵育85 min后用pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，在4℃下干燥，制得夹心型电化学免疫传感器。
实施例10通过时间-电流法对神经元特异性烯醇化酶进行检测包括：
①使用三电极系统进行电化学测试：所制备的夹心型电化学免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在10 mL、50 mmol/L的pH为5.29的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②通过时间-电流曲线法进行检测，初始电压为-0.4 V；待电流稳定后，向10 mL的磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的过氧化氢溶液，分别记录不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原所产生的电流值；
③通过工作曲线法测定不同待测样品中的神经元特异性烯醇化酶抗原的浓度。
实施例11通过时间-电流法对神经元特异性烯醇化酶进行检测包括：
①使用三电极系统进行电化学测试：所制备的夹心型电化学免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在10 mL、50 mmol/L的pH为6.98的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②通过时间-电流曲线法进行检测，初始电压为-0.4 V；待电流稳定后，向10 mL的磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的过氧化氢溶液，分别记录不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原所产生的电流值；
③通过工作曲线法测定不同待测样品中的神经元特异性烯醇化酶抗原的浓度。
实施例12通过时间-电流法对神经元特异性烯醇化酶进行检测包括：
①使用三电极系统进行电化学测试：所制备的夹心型电化学免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在10 mL、50 mmol/L的pH为8.04的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②通过时间-电流曲线法进行检测，初始电压为-0.4 V；待电流稳定后，向10 mL的磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的过氧化氢溶液，分别记录不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原所产生的电流值；
③通过工作曲线法测定不同待测样品中的神经元特异性烯醇化酶抗原的浓度。

Claims (2)

1.一种检测神经元特异性烯醇化酶的夹心型电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)负载钯纳米粒子的双壳Cu2O空心球标记的神经元特异性烯醇化酶第二抗体Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2的制备
①DSHSs-Cu2O的制备
将0.03～0.07g的CuSO4·5H2O溶于90～110mL、0.13mol/L的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中；然后，将0.18～0.38g的抗坏血酸加入上述溶液中，搅拌状态下加热至60℃；保持20min后冷却至室温；再将8～12mL、0.2mol/L的NaOH溶液缓慢滴加到上述溶液中，搅拌反应10min，离心分离，用超纯水和无水乙醇分别洗涤3次；50℃真空干燥5h制得DSHSs-Cu2O；
②Pd NPs@DSHSs-Cu2O的制备
将7～8mg的DSHSs-Cu2O和30～70mg的聚乙烯吡咯烷酮加至7～15mL超纯水中，搅拌状态下加入4～10mL、10mmol/L的四氯钯酸钠溶液，搅拌20min后，通过离心收集沉淀物，并用超纯水和无水乙醇洗去杂质，并将得到的沉淀物在55℃真空干燥过夜制得Pd NPs@DSHSs-Cu2O；
③Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2分散液的制备
取上述步骤②制备的Pd NPs@DSHSs-Cu2O 3～4mg分散在3mL、pH＝6.98的磷酸盐缓冲溶液中，加入2mL、10～30μg/mL的Ab2溶液，在4℃下振荡8h，离心后将下层沉淀重新分散在2mL、pH＝6.98的磷酸盐缓冲溶液中，制得Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2分散液，4℃下保存；
(2)负载金纳米粒子的氧化石墨烯掺杂的聚3,4乙二氧基噻吩纳米棒Au NPs/PEDOT/GO的制备
①制备PEDOT/GO分散液
首先，将560～580μL、1mol/L的FeCl3·6H2O加入到430～450μL、0.5mg/mL的氧化石墨烯GO水溶液中超声15min，此溶液标记为A；将0.8～1.6mL的3，4乙二氧基噻吩和160～180μL、0.2mol/L的三氯甲烷混合后得到的溶液标记为B，将A溶液缓慢滴加至B溶液，后60℃下静置过夜，用超纯水洗涤三次；将所得沉淀分散在2mL超纯水制得PEDOT/GO分散液，备用；
②制备Au NPs溶液
将1～2mL的氯金酸溶液加入至99mL的超纯水中，在匀速搅拌的条件下加热至沸腾，加入2～4mL、1wt％的柠檬酸钠溶液后保持沸腾15min，冷却至室温，制得Au NPs溶液，4℃储存备用；
③制备Au NPs/PEDOT/GO
将3～5mL、2.3mg/mL的PEDOT/GO分散液与5～7mL的Au NPs溶液混合后超声2h，室温条件下继续振荡7h，后离心分离，制得Au NPs/PEDOT/GO；
(3)夹心型电化学免疫传感器的制备
①将直径为3～5mm的玻碳电极用粒径为0.05μm的抛光粉抛光成镜面；
②取6.0μL、2～3mg/mL的Au NPs/PEDOT/GO分散液滴涂到抛光好的电极表面，室温下干燥；
③继续将6.0μL、8～12μg/mL的神经元特异性烯醇化酶抗体滴涂到电极表面，在4℃下干燥；
④继续将6.0μL、0.8～1.2wt％的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH＝6.98的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面以除去未结合的牛血清白蛋白溶液，在4℃下干燥；
⑤继续将6.0μL、0.00005～100ng/mL的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原溶液滴涂至电极表面，用pH＝6.98的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，在4℃下干燥；
⑥继续将6.0μL、2.5～3.5mg/mL的Pd NPs@DSHSs-Cu2O/Ab2分散液滴涂于电极表面，置于4℃中孵育85min后用pH＝6.98的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，在4℃下干燥，制得夹心型电化学免疫传感器。
2.如权利要求1所述的制备方法制得的电化学免疫传感器在检测神经元特异性烯醇化酶的应用，其特征在于，所述应用的步骤如下：
①使用三电极系统进行电化学测试：所制备的夹心型电化学免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在10mL、50mmol/L的pH为5.29～8.04的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②通过时间-电流曲线法进行检测，初始电压为-0.4V；待电流稳定后，向10mL的磷酸盐缓冲溶液中注入10μL、5mol/L的过氧化氢溶液，分别记录不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原所产生的电流值；
③通过工作曲线法测定不同待测样品中的神经元特异性烯醇化酶抗原的浓度。
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