CN112625922B

CN112625922B - 一株尖孢镰刀菌及其应用

Info

Publication number: CN112625922B
Application number: CN202110053266.2A
Authority: CN
Inventors: 程扬健; 卢园园
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2021-01-15
Filing date: 2021-01-15
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2041-01-15
Also published as: CN112625922A

Abstract

本发明提供了一株尖孢镰刀菌及其应用，所述尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）FZU‑07，于2020年12月3日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为：CGMCC NO.21085。该菌株可以对稀土离子镧进行吸附及诱导矿化，能够用于稀土矿山开采废水中稀土离子镧的吸附及诱导矿化回收。该方法比较于传统稀土离子处理方法二次污染小，成本低，回收率高，同时开展微生物富集、矿化回收稀土元素的研究可以为实现稀土环境友好型提取奠定理论基础。

Description

一株尖孢镰刀菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株尖孢镰刀菌及其应用。

背景技术

稀土元素包括轻稀土元素镧（La），铈(Ce)，镨(Pr)，钕(Nd)，钷(Pm)、钐(Sm)和铕(Eu)；钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)、钪(Sc)和钇 (Y)的重稀土。稀土元素有许多独特的物理化学性质，随着原子序数的增加，镧系离子半径出现了降低，这与“镧系收缩”相对应。这些原子特性使稀土特别适合生产非常轻和高效的合金或催化剂，这些合金或催化剂可用于所有类型的现代工业，各种镧系化合物的电致发光特性使它们成为电致发光器件中的热门发射体，镧基试剂在有机合成中也越来越受欢迎，同时镧系元素是塑料光纤激光器、离子导电氧化物(燃料电池的关键成分)、微电子器件中氧化物的MOCVD的重要组成部分，被国家列为重要的战略资源。中国稀土资源丰富，特别是离子稀土资源，占世界总量的90%。江西南部离子稀土资源占我国离子稀土资源的三分之二。重稀土矿区主要分布在陇南县，轻稀土矿区主要分布在旬武县。华南稀土矿区土壤中稀土物质含量为396-2314 mg/kg，远高于全国平均水平。研究发现，稀土元素的毒性有明显的Hormesis 效应，低浓度的稀土有促进生物体生长的作用，高浓度的稀土则对植物、动物、微生物及人体的生命健康安全造成不良影响。

据调查，我国每年因稀土冶炼废水的排放而造成近千吨的稀土流失（以REO计）。同时，稀土矿石的开采将地下矿物暴露于地表环境，导致矿物的化学形态和存在形式发生了改变，加大了稀土元素向环境的释放量，造成矿区内的土壤稀土污染问题。由于稀土金属本身是可循环利用的，对这些稀土金属的回收和再利用可以减少处置的负面影响，节约能源，减轻供应和安全风险，改善环境的可持续性。传统的处理金属污染的方法有化学沉淀法、化学氧化还原法、离子交换法和电化学处理法等，但传统的金属物化回收方法是能源密集型的，会造成进一步的污染。低成本和环保的技术，包括生物活性炭、生物电化学系统(BESs)、生物浸出和生物矿化，已经成为重要金属回收的替代品。

综上所述：微生物方法相比传统的处理方法具有不产生二次污染、适用范围广、能耗低等优点，它是消除稀土开采过程中稀土离子对环境危害和回收废水中稀土离子最有潜力的方法之一。经过查阅相关的文献，发现近年来国内外学者对于利用微生物处理稀土元素已有基础性的研究，但是对于产脲酶真菌用于诱导矿化回收稀土离子的研究还比较少，生物体通过改变胞外微环境，为矿物相的胞外化学沉淀创造有利条件，从而形成含金属化合物，从某种意义上来讲是另一种形式的富集浓缩，同时降低了离子迁移转化的可能性。

发明内容

本发明的目的在于一株尖孢镰刀菌及其应用，目前处理稀土废水的传统方法具有成本高、造成二次污染大的缺陷，且稀土是极为重要的战略资源，稀土资源回收是稀土行业绿色发展的必然方向。

本发明具体的技术方案为：

一株尖孢镰刀菌，所述尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）FZU-07，于2020年12月3日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为：CGMCCNO.21085。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

上述所述尖孢镰刀菌应用于吸附及诱导矿化回收稀土离子镧（La³⁺）。

所述尖孢镰刀菌应用于吸附及诱导矿化回收稀土离子镧（La³⁺），包括以下具体步骤：

（1）菌种产脲酶特性筛选：将尖孢镰刀菌接种至尿素琼脂培养基，培养三天观察。

（2）菌种的培养：将菌种接种至斜面PDA培养基，37℃ 培养5天备用。

（3）孢子悬液的制备：将步骤（2）培养的接种菌株的斜面PDA培养基加入4 mL无菌水，并用接种环轻轻刮下孢子，制备为孢子悬液备用。

（4）稀土离子镧母液准备：用超纯水及硝酸溶液配制浓度为5000 mg/L稀土离子镧的50wt.%硝酸溶液母液。

（5）尖孢镰刀菌对稀土离子镧的耐受性：步骤（4）制备的含稀土离子镧的母液，加入至灭菌的PDA液体培养基中，稀土离子镧浓度为0-1000 mg/L；取步骤（3）孢子悬液200 μL接种至含稀土离子镧浓度为0-1000 mg/L的PDA液体培养基中，在温度为37℃，转速为160rpm的摇床内培养5天。

（6）尿素母液准备：用超纯水配制浓度为200 g/L的尿素溶液。

（7）尖孢镰刀菌与稀土离子相互作用：

1）将步骤（4）制备的含稀土离子镧的母液，加入至灭菌的PDA液体培养基中获得含稀土离子镧浓度为200 mg/L 的PDA液体培养基；取步骤（3）孢子悬液200 μL接种至含稀土离子镧浓度为200 mg/L 的PDA液体培养基中，在温度为37℃，转速为160rpm的摇床内培养5天；

2）将步骤（6）制备的尿素母液，加入至灭菌的含40 mM Ca²⁺的PDA液体培养基中，获得含40 mM Ca²⁺、尿素20g/L 的PDA液体培养基，即2 w/v %；将步骤（4）制备的含稀土离子镧的母液，加入至灭菌的含40 mM Ca²⁺、尿素20g/L的PDA液体培养基中，稀土离子镧浓度为200mg/L；取步骤（3）孢子悬液200 μL接种至含稀土离子镧浓度为200 mg/L 、40 mM Ca²⁺、尿素20g/L的PDA液体培养基中，在温度为37℃，转速为160rpm 的摇床内培养5天；

（7）形成的产物进行物相分析。

上述步骤（1）中，尖孢镰刀菌接种至尿素琼脂培养基，使培养基由黄变红。

上述步骤（2）中，尖孢镰刀菌用接种环接种值PDA培养基斜面于37℃ 静置培养5d。

上述步骤（4）中，尖孢镰刀菌在对稀土离子镧浓度为200mg/L以下有较好的耐受性。

上述步骤（6）中，尖孢镰刀菌与含200 mg/L 的La³⁺相互作用5天，吸附回收效率为46.19%，矿化回收效率为99.16%。

上述步骤（7）中，尖孢镰刀菌诱导矿化形成含有镧的碳酸钙。

所述尖孢镰刀菌应用于稀土矿山开采废水中稀土离子镧的吸附及诱导矿化回收。

本发明的优点在于：

本发明所述菌株可以对稀土离子镧进行吸附及诱导矿化，能够用于稀土矿山开采废水中稀土离子镧的吸附及诱导矿化回收。该方法比较于传统稀土离子处理方法二次污染小，成本低，回收率高。

附图说明

图1为尖孢镰刀菌菌落形态。a.正面；b.反面。

图2为尖孢镰刀菌产脲酶特性效果图。

图3为尖孢镰刀菌的系统发育树。

图4为尖孢镰刀菌在不同镧离子浓度的的PDA培养基中生长效果图。从左到右La³⁺浓度依次为0、100mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L、800mg/L、900 mg/L、1000 mg/L。

图5为尖孢镰刀菌与镧离子反应后的物相分析-XRD。

具体操作步骤如下：

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

实施例1：尖孢镰刀菌分离、培养

准备无菌水30 mL（将去离子水置于高压灭菌锅中，121℃ 灭菌25 min），将5 g采集的土样（采样地点为：福建省福州市罗源县罗源湾红树林公园的滩涂浅滩、采样时间2018年11月）添加至无菌水中，后摇匀，取100 μL浑浊液（稀释不同浓度梯度：10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5）于PDA固体培养基（土豆200 g/L、葡萄糖 20 g/L、链霉素0.03 g/L、琼脂 20 g/L）并用涂布棒涂布，后置于37℃ 培养箱进行培养，待固体培养基中长出真菌，后挑取单菌落于PDA斜面培养基进行纯培，获得尖孢镰刀菌纯培养物，并对尖孢镰刀菌纯培养物进行鉴定。

分离所得尖孢镰刀菌纯培养物的菌落形态见图1，图1结果表明：该菌落凸起絮状、菌丝呈白色，菌落呈深粉红色。

实施例2：尖孢镰刀菌的鉴定

实验真菌物种鉴定是使用 ITS rDNA 作为 Marker 片段，通过引物扩增出基因中ITS 序列，与NT数据库进行比对，获得相似序列的物种信息，借助同源比对的方法辅助判断物种信息。ITS引物序列ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC

以尖孢镰刀菌的基因组DNA为模板PCR扩增该菌株基因中的ITS序列。 PCR反应条件为： 95℃5min； 95 ℃ 30s， 56 ℃ 30s， 72℃ 90s，循环25次； 72℃ 10min。电泳条件：1%琼脂糖凝胶，120 V 电压电泳30min。测序所得尖孢镰刀菌的基因序列如下所示。

基因序列：

tcttccgtaaggggtacCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTTAAACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGACGGCCCGCCGCAGGACCATCAAACCCTGAATTTTATTGTAACTTCTGAGTAAAAAAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGGGTTTGGTGTTGGGGATCGGGTCCTGCGAGCAATCGCGGCCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGCGGCCTCCTTTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGAACGCGGCGCGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAtaaaccggaggaa。

系统发育树的构建及分析：将尖孢镰刀菌菌株的基因序列在网站https://blast.ncbi.nlm.nih.gov中与模式菌株的基因序列进行同源性比较。通过软件ClustalX将菌株的基因序列与亲缘关系较近Fusarium属的菌株进行多重序列比对，并使用MEGA 7.0软件构建邻接法系统进化树见图3，从图3可以得尖孢镰刀菌属于尖孢镰刀属。同时命名其为尖孢镰刀菌FZU-07。

实施例3：尖孢镰刀菌的产脲酶特性

将尖孢镰刀菌FZU-07接种至尿素琼脂培养基（蛋白胨：1 g、氯化钠：5 g 、磷酸二氢钾：2 g、酚红：0.012 g （0.2% 的酚红溶液6 mL )、尿素：2% （w/v）即20 g、葡萄糖：1 g、琼脂： 15 g、PH ：7.0 ± 0.1），放置在37℃培养箱中培养3天，可观察到接种尖孢镰刀菌的尿素琼脂培养基颜色由黄色变为红色。是由于尖孢镰刀菌产生脲酶，脲酶可分解尿素为NH₃和CO₂，NH₃呈碱性，使酚红指示剂颜色发生改变。

实施例4：尖孢镰刀菌对稀土离子镧的耐受性

尖孢镰刀菌孢子悬液的制备：配置PDA培养基（土豆200 g/L、葡萄糖 20 g/L、链霉素0.03 g/L、琼脂 20 g/L），于121℃下灭菌25 min，待培养基冷却至60℃，从高压灭菌锅中取出，倾斜放置，制备为斜面培养基。将尖孢镰刀菌接种至斜面PDA培养基上，于37℃培养箱中培养5天，后加入经121℃下灭菌25 min的去离子水4mL，制备为孢子悬液。

稀土离子镧母液准备：用超纯水及硝酸溶液配制浓度为5000 mg/L稀土离子镧的50wt.%硝酸溶液母液。

尖孢镰刀菌对稀土离子镧的耐受性：将制备的含稀土离子镧的母液，加入至灭菌的PDA液体培养基（土豆200 g/L、葡萄糖 20 g/L、链霉素0.03 g/L）中，稀土离子镧浓度分别为0、100mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L、800 mg/L、900 mg/L、1000 mg/L；

将孢子悬液200 μL接种至含稀土离子镧浓度分别为0、100mg/L、200 mg/L、300mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L、800 mg/L、900 mg/L、1000 mg/L的PDA液体培养基中（15mL试管内含PDA液体培养基5 mL），在温度为37℃，转速为160rpm 的摇床内培养5天。尖孢镰刀菌在对稀土离子镧浓度为200mg/L以下有较好的耐受性。通过观察可看尖孢镰刀菌在不同浓度的La³⁺的生长状况如图4。

实施例5：尖孢镰刀菌与稀土离子镧相互作用

尖孢镰刀菌孢子悬液的制备：配置PDA培养基（土豆200 g/L、葡萄糖 20 g/L、链霉素0.03 g/L、琼脂 20 g/L），于121℃下灭菌25 min，待培养基冷却至60℃，从高压灭菌锅中取出，倾斜放置，制备为斜面培养基。将尖孢镰刀菌接种至PDA斜面培养基上，于37℃培养箱中培养5天，后加入经121℃下灭菌25 min的去离子水4mL，制备为孢子悬液。

尿素母液准备：用超纯水配制浓度为200 g/L的尿素溶液。

稀土离子镧的吸附：将制备的含稀土离子镧的母液，加入至灭菌的PDA液体培养基（土豆200 g/L、葡萄糖 20 g/L、链霉素0.03 g/L）中，稀土离子镧浓度为200 mg/L；取孢子悬液200 μL接种至含稀土离子镧浓度为200 mg/L 的PDA液体培养基中（100 mL锥形瓶内含PDA液体培养基30 mL），在温度为37℃，转速为160rpm 的摇床内培养5天后1000 g离心收集上清液与菌体，用无菌水洗涤三次，后采用ICP对上清液中La³⁺浓度进行分析测定，见表1。对离心沉淀物菌体进行冷冻真空干燥，研磨至粉末状，后进行物相分析，见图5，产物为无定型，说明镧离子与尖孢镰刀菌相互作用没有形成矿物。

将制备的尿素母液，加入至灭菌的含40 mM Ca²⁺的PDA液体培养基中，尿素浓度为20 g/L，即2%（w/v）；将制备的含稀土离子镧的母液，加入至灭菌的含20 g/L 尿素、40 mMCa²⁺的PDA液体培养基中，稀土离子镧浓度为200 mg/L；取孢子悬液200 μL接种至含稀土离子镧浓度为200 mg/L 、40 mM Ca²⁺、尿素20 g/L的PDA液体培养基（100 mL锥形瓶内含PDA液体培养基30 mL）中，在温度为37℃，转速为160rpm 的摇床内培养5天后1000 g离心收集上清液与菌体，用无菌水洗涤三次，后采用ICP对上清液中La³⁺浓度进行分析测定，见表1。对离心沉淀物菌体进行冷冻真空干燥，研磨至粉末状，后进行物相分析，见图5，产物为球霰石晶型的碳酸钙，说明尖孢镰刀菌诱导矿化形成含La³⁺的碳酸钙沉淀。

表1：尖孢镰刀菌与稀土离子镧相互作用后镧离子的去除率

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一株尖孢镰刀菌及其应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcttccgtaa ggggtacctg cggagggatc attaccgagt ttacaactcc caaacccctg 60

tgaacatacc ttaaacgttg cctcggcgga tcagcccgcg ccccgtaaaa cgggacggcc 120

cgccgcagga ccatcaaacc ctgaatttta ttgtaacttc tgagtaaaaa aaacaaataa 180

atcaaaactt tcaacaacgg atctcttggt tctggcatcg atgaagaacg cagcaaaatg 240

cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg 300

cccgccagta ttctggcggg catgcctgtt cgagcgtcat ttcaaccctc aagcccccgg 360

gtttggtgtt ggggatcggg tcctgcgagc aatcgcggcc cggccccgaa atctagtggc 420

ggtctcgctg cggcctcctt tgcgtagtag ctaacacctc gcaactggaa cgcggcgcgg 480

ccaagccgtt aaacccccaa cttctgaatg ttgacctcgg atcaggtagg aatacccgct 540

gaacttaagc atatcaataa accggaggaa 570

Claims

1.一株尖孢镰刀菌，其特征在于：所述尖孢镰刀菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）FZU-07，于2020年12月3日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为：CGMCC NO.21085。

2.如权利要求1所述的一株尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）FZU-07在吸附及诱导矿化回收稀土离子镧La³⁺中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下具体步骤：

（1）菌种产脲酶特性筛选：将尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）FZU-07接种至尿素琼脂培养基，培养五天；

（2）菌种的培养：将菌种接种至斜面PDA培养基，37℃培养5天，备用；

（3）孢子悬液的制备：将步骤（2）培养的接种菌株的斜面PDA培养基加入4 mL无菌水，并用接种环轻轻刮下孢子，制备为孢子悬液备用；

（4）稀土离子镧母液准备：用超纯水及硝酸溶液配制浓度为含5000 mg/L稀土离子镧的50wt .%硝酸溶液母液；

（5）尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）FZU-07对稀土离子镧的耐受性：步骤（4）制备的含稀土离子镧的50wt .%硝酸溶液母液，加入至灭菌的PDA液体培养基中，使稀土离子镧浓度为0-1000 mg/L；取步骤（3）中孢子悬液100 μL接种至含稀土离子镧浓度为0-1000 mg/L的PDA液体培养基中，在温度为37℃，转速为160 rpm的摇床内培养5天；

（6）尿素母液准备：用超纯水配制浓度为200 g/L的尿素溶液；

（7）尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）FZU-07与稀土离子镧的相互作用：

1）将步骤（4）制备的含稀土离子镧的母液，加入至灭菌的PDA液体培养基中获得含稀土离子镧浓度为200 mg/L 的PDA液体培养基；取步骤（3）中孢子悬液200 μL接种至含稀土离子镧浓度为200 mg/L 的PDA液体培养基中，在温度为37℃，转速为160rpm的摇床内培养5天；

2）将步骤（6）制备的尿素母液，加入至灭菌的含40 mM Ca²⁺的PDA液体培养基中，获得含40 mM Ca²⁺、尿素20g/L的PDA液体培养基；将步骤（4）制备的含稀土离子镧的母液，加入至灭菌的含40 mM Ca²⁺、尿素20g/L的PDA液体培养基中，使稀土离子镧浓度为200 mg/L；取步骤（3）中孢子悬液200 μL接种至含稀土离子镧浓度为200 mg/L 、40 mM Ca²⁺、尿素20g/L的PDA液体培养基中，在温度为37℃，转速为160rpm 的摇床内培养5天；

（8）形成的产物进行物相分析。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述步骤（1）中尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）FZU-07接种至尿素琼脂培养基，使培养基由黄变红。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述步骤（2）中尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）FZU-07用接种环接种至PDA培养基斜面于37℃静置培养5d。