CN112602729B - 用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂及应用 - Google Patents
用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明旨在提供用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂及其制备方法与应用，以非洲角瓜作为原料对其不同部位进行提取、萃取，创造性的提供用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂及其制备方法与应用，与现有技术相比，该制剂对南方根结线虫有较好的杀灭作用。且本发明采用纯天然植物提取，对环境生态平衡不具有破坏性，增加了非洲角瓜除食用以外的另一种开发价值，对于制备防治南方根结线虫药物中具有广泛的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物防治的研发技术领域。具体地，本发明涉及用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂及其制备方法与应用的技术领域。
背景技术
南方根结线虫[Meloidogyne incongnita(Kofold&White)Chitwood]寄主范围广，可加重土传性真菌病害和部分细菌病害的发生，严重威胁蔬菜、粮食作物、西甜瓜等多种植物的生长。随着重茬年限的增加、根结线虫虫体数量积累日益增多，危害程度也呈上升趋势，严重者甚至绝收，根结线虫病害的防治研究工作刻不容缓。
目前常用的杀线虫剂主要有溴甲烷、克百威、噻唑磷、阿维菌素等。但大多数化学防治办法种类使用成本高、毒性大、长期施用化学防治办法可使线虫产生耐药性、对环境污染严重。其他防止办法如晒土需要定期翻耕，土壤浸泡，成本高且浪费水资源。
近年来，随着抗根结线虫育种的研究深入，在与甜瓜同科即葫芦科中相继发现了一些对根结线虫具有较高抗性的野生资源，其中非洲角瓜对根结线虫表现为高抗，可以有效控制南方根结线虫、花生根结线(Meloidogyne arenaria)和爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)。
植物源农药易分解为无毒物质，对环境友好等优点成为研究开发的热点。为找到更多能抑杀甜瓜南方根线虫的植物源农药，作者选用非洲角瓜提取液及萃取分离物对南方根线虫进行室内抑杀试验，为使用天然植物源农药防治南方根线虫提供技术支撑。
现有技术中仅有关于非洲角瓜植株活体对于南方根线虫抑制作用的披露，但是对于采用何种工艺能够将其有效成分进行提取，并对南方根结线虫是否有显著的防治效果，现有技术鲜有报道。
发明内容
针对现有技术中对于采用非洲角瓜制备防治南方根结线虫制剂鲜有报道。本发明旨在提供一种用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂及其制备方法和应用，对南方根结线虫具有显著的防治效果，对于开展仿生合成环境友好性、耐储存，成本低的新型生物农药提供思路。
本发明提供用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂，所述的制剂包含非洲角瓜的茎叶及根的萃取分离物。
优选的，所述的用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂包含0.5-2mg/mL的非洲角瓜的茎叶及根的萃取分离物。
进一步的，本发明还提供了上述用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂的制备方法，具体的采用以下步骤制备获得：
(1)将供试新鲜的非洲角瓜的茎叶及根，去除杂质，分别用铡刀轧成小段；
(2)将步骤(1)中制备获得的样品分别按照样品及溶液质量体积比1：30加入乙醇冷浸7天，过滤得滤液1；
(3)将步骤(2)过滤剩余的样品再加入等量乙醇微波超声4小时再过滤得滤液2；
(4)将步骤(2)中制备获得的滤液1和步骤(3)中制备获得的滤液2合并50℃减压浓缩为浸膏，即为非洲角瓜的茎叶及根的乙醇提取物；
(5)将步骤(4)中制备获得的非洲角瓜的茎叶及根浸膏加入水和乙酸乙酯进行萃取，反复多次得到水相化合物和乙酸乙酯相化合物；
(6)将步骤(5)中制备获得的水相化合物减压浓缩得水相化合物浸膏；
(7)将步骤(6)中制备获得的浸膏与无菌水混合均匀即制得用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂。
进一步的，本发明提供的上述用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂在防治南方根结线虫中的应用。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果：
本发明旨在提供用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂及其制备方法与应用，以非洲角瓜作为原料对其不同部位进行萃取，创造性的提供用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂及其制备方法与应用，与现有技术相比，该制剂对南方根结线虫有较好的杀灭作用。且本发明采用纯天然植物提取，对环境生态平衡不具有破坏性，增加了非洲角瓜除食用以外的另一种开发价值，对于制备防治南方根结线虫药物中具有广泛的实用价值。
附图说明
图1所示为根的乙醇提取液抑杀南方根线虫的毒力测定效果图。
其中，图A所示为根的乙醇提取液提取液4mg/mL第24h触杀效果；图B所示为根的乙醇提取液提取液2mg/mL第24h触杀效果；图C所示为根的乙醇提取液提取液1mg/mL第24h触杀效果；图D所示为根的乙醇提取液提取液0.5mg/mL第24h触杀效果：图E所示为根的乙醇提取液提取液0.25mg/ml第24h触杀效果；图F所示为CK(无菌水)第24h效果：图G所示为1mg/mL阿维菌素第24h触杀效果。
图2所示为茎叶的乙醇提取液抑杀南方根线虫的毒力测定效果图。图
A1所示为茎叶的乙醇提取液提取液1mg/mL第24h触杀效果；图B1所示为茎叶的乙醇提取液提取液0.5mg/mL第24h触杀效果；图C1所示为茎叶的乙醇提取液提取液0.25mg/mL第24h触杀效果；图F所示为CK(无菌水)第24h效果：图G所示为1mg/mL阿维菌素第24h触杀效果。
图3所示为根的水相化合物抑杀南方根线虫的毒力测定效果图。图
A2所示为根的水相化合物1mg/mL第24h触杀效果；图B2所示为根的水相化合物0.5mg/mL第24h触杀效果；图C2所示为根的水相化合物0.25mg/mL第24h触杀效果；图F所示为CK(无菌水)第24h效果：图G所示为1mg/mL阿维菌素第24h触杀效果。
图4所示为茎叶的水相化合物抑杀南方根线虫的毒力测定效果图。
图A3所示为茎叶的水相化合物1mg/mL第24h触杀效果；图B3所示为茎叶的水相化合物0.5mg/mL第24h触杀效果；图C3所示为茎叶的水相化合物0.25mg/mL第24h触杀效果；图F所示为CK(无菌水)第24h效果：图G所示为1mg/mL阿维菌素第24h触杀效果。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中涉及的材料和设备：
本发明所采用的材料为：非洲角瓜、无水乙醇、乙酸乙酯、灭菌水。
供试植物：供试材料非洲角瓜于2020年7月采自新疆农业科学院海南三亚农作物育种试验中心南繁基地，采集部位为非洲角瓜的根和茎叶。
供试南方根结线虫：由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所线虫实验室提供。
本发明所采用的设备为：铡刀、移液枪、吸头、试管、96孔板、滤纸、漏斗、玻璃棒、微波超声仪、减压浓缩装置、荧光数码生物显微镜。
本发明中选用的所有材料、试剂及仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施。
实施例一：用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂，所述的制剂包含非洲角瓜的茎叶及根的萃取分离物。
优选的，所述的用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂包含0.5-2mg/mL的非洲角瓜的茎叶及根的萃取分离物。
进一步的，本发明还提供了上述用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂中非洲角瓜的茎叶及根的乙醇提取物的制备方法，具体的采用以下步骤制备获得：
(1)将供试新鲜的非洲角瓜的茎叶及根，去除杂质，分别用铡刀轧成小段；
(2)将步骤(1)中制备获得的样品分别按照样品及溶液质量体积比1：30加入乙醇冷浸7天，过滤得滤液1；
(3)将步骤(2)过滤剩余的样品再加入等量乙醇微波超声4小时再过滤得滤液2；
(4)将步骤(2)中制备获得的滤液1和步骤(3)中制备获得的滤液2合并50℃减压浓缩为浸膏，即为非洲角瓜的茎叶及根的乙醇提取物。
(5)将步骤(4)中制备获得的非洲角瓜的茎叶及根浸膏加入水和乙酸乙酯进行萃取，反复多次得到水相化合物和乙酸乙酯相化合物；
(6)将步骤(5)中制备获得的水相化合物减压浓缩得水相化合物浸膏；
(7)将步骤(6)中制备获得的浸膏与无菌水混合均匀即制得用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂。
实施例二：用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂杀线虫活性测定
(1)杀线虫活性测定
在96孔板，每孔加入线虫悬液(约200～300条线虫)，无菌水65μL，样品溶液5μL，样品终浓度为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL，空白对照为用等量的无菌水替代样品溶液，阳性对照为用等量的1mg/mL阿维菌素水溶液替代样品溶液，3次重复，96孔板周围的孔加200μL无菌水保湿。混匀后于室温下培养24h，于荧光数码生物显微镜下计数线虫死亡数，统计的线虫数量不少于100条。分别计算线虫的死亡率和校正死亡率。
(2)数据处理与分析
参照杀线虫活性强弱分级标准进行分级。具体分级标准：“-”表示无活性，校正死亡率≤10％；“+”表示弱活性，校正死亡率为10％～30％；“++”表示中等活性，校正死亡率为30％～50％；“+++”表示较强活性，校正死亡率为50％～80％；“++++”表示强活性，校正死亡率＞80％。
①线虫死亡率(％)＝死亡线虫数/供试线虫数×100
②线虫校正死亡率(％)＝(处理组线虫死亡率-对照组线虫死亡率)/(1-对照组线虫死亡率)×100。
③使用DPS软件对结果进行统计分析，计算LC50值，并进行差异显著性分析。
(3)结果与分析
①非洲角瓜无水乙醇提取液对南方根结线虫的毒杀活性评价
非洲角瓜无水乙醇提取液抑杀南方根线虫的毒力测定结果见表1，部分测定效果见附图1和附图2。结果表明，植物茎叶及根的乙醇提取液对南方根结线虫都表现出强毒杀活性，且校正死亡率随着南方根结线虫暴露时间的延长和提取液浓度上升而上升。用浓度为1mg/mL茎叶及根的提取液分别处理24h后南方根结线虫校正死亡率超过90％，处理48h后，线虫校正死亡率均超过98％。
通过表3比较茎叶及根的提取液不同浓度处理24h和48h后对南方根结线虫LC50值发现，茎叶提取液毒性随时间略有上升，而根提取液毒性随时间有所下降。差异显著性分析结果表明：非洲角瓜无水乙醇提取物的茎叶及根的提取物对南方根结线虫的杀虫活性基本都存在显著差异。
表1：非洲角瓜不同部位无水乙醇提取物对南方根结线虫的杀虫效果
注：1)“-”表示无活性，校正死亡率≤10％；“+”表示弱活性，校正死亡率为10％～30％；“++”表示中等活性，校正死亡率为30％～50％；“+++”表示较强活性，校正死亡率为50％～80％；“++++”表示强活性，校正死亡率＞80％；2)表内数据为3次重复平均值,同列数据后标有相同字母者表示在5％水平差异不显著(Duncan法)。；3)同列中不同的小写字母表示差异显著(P＝0.05)不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
②非洲角瓜无水乙醇提取液用乙酸乙酯萃取得到的水相化合物对南方根结线虫的毒杀活性评价
非洲角瓜无水乙醇提取液用乙酸乙酯萃取得到的水相化合物抑杀南方根线虫的毒力测定结果见表2，部分测定效果见图3和图4。结果表明，线虫的校正死亡率随着提取液浓度上升而上升。用浓度为1mg/mL茎叶提取物的水相化合物处理24h，南方根结线虫校正死亡率达到100％。用浓度为1mg/mL根提取物的水相化合物处理24h，南方根结线虫校正死亡率达到100％。非洲角瓜茎叶和根提取物的乙酸乙酯萃取水相化合物较低浓度就可以达到非洲角瓜茎叶和根提取物较高浓度对南方根结线虫校正死亡率，说明萃取后的水相化合物南方根结线虫触杀活性远高于粗提取物。
表2：非洲角瓜不同部位乙酸乙酯萃取液水相化合物对南方根结线虫J2的杀虫效果
注：1)“-”表示无活性，校正死亡率≤10％；“+”表示弱活性，校正死亡率为10％～30％；“++”表示中等活性，校正死亡率为30％～50％；“+++”表示较强活性，校正死亡率为50％～80％；“++++”表示强活性，校正死亡率＞80％；2)表内数据为3次重复平均值，同列数据后标有相同字母者表示在5％水平差异不显著(Duncan法)；3)同列中不同的小写字母表示差异显著(P＝0.05)不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。
表3：非洲角瓜不同部位提取液对南方根结线虫的杀虫校对死亡率LC50(mg/mL)
| 不同部位 | 线性方程 | 半致死浓度 | 相关系数 |
| 茎叶乙醇提取物 | y＝5.798+5.2187X | 0.7032 | 0.9669 |
| 茎叶水相化合物 | Y＝7.4283+6.2286X | 0.4075 | 0.9299 |
| 根乙醇提取物 | y＝6.615+5.2653X | 0.4935 | 0.9217 |
| 根水相化合物 | Y＝7.5133+5.1158X | 0.3226 | 0.9256 |
非洲角瓜提取物对南方根结线虫的抑制活性见表2。茎叶和根提取物处理24h，对南方根结线虫的半致死浓度LD50分别为0.7032mg/ml和0.4935mg/ml。茎叶和根提取物的萃取水相化合物处理24h，对南方根结线虫的半致死浓度LD50分别为0.4075mg/ml和0.3226mg/ml。乙酸乙酯萃取后获得的水相化合物对南方根结线虫的半致死浓度LD50明显小于粗提取物。
可见本发明所提供的一种用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂及其制备方法与应用，该菌剂对南方根结线虫有较好的杀灭作用。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (3)
1.用于防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂，其特征在于，所述的防治南方根结线虫制剂包含非洲角瓜的茎叶及根的萃取分离物；
所述的用于防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂采用如下步骤制备获得：
(1)将供试新鲜的非洲角瓜的茎叶及根，去除杂质，分别用铡刀轧成小段；
(2)将步骤(1)中制备获得的样品分别按照样品及溶液质量体积比1：30加入乙醇冷浸7天，过滤得滤液1；
(3)将步骤(2)过滤剩余的样品再加入等量乙醇微波超声4小时再过滤得滤液2；
(4)将步骤(2)中制备获得的滤液1和步骤(3)中制备获得的滤液2合并50℃减压浓缩为浸膏，即为非洲角瓜的茎叶及根的乙醇提取物；
(5)将步骤(4)中制备获得的非洲角瓜的茎叶及根浸膏加入水和乙酸乙酯进行萃取，反复多次得到水相化合物和乙酸乙酯相化合物；
(6)将步骤(5)中制备获得的水相化合物减压浓缩得水相化合物浸膏；
(7)将步骤(6)中制备获得的浸膏与无菌水混合均匀即制得用于制备防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂。
2.如权利要求1所述的用于防治南方根结线虫的非洲角瓜提取物制剂，其特征在于，所述的用于制备防治南方根结线虫制剂包含0.5-2mg/mL的非洲角瓜的茎叶及根的萃取分离物。
3.如权利要求1至权利要求2任意一项所述的的非洲角瓜提取物制剂在防治南方根结线虫中的应用。
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