CN112592950B - 一种合成大豆基高f值寡肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种合成大豆基高F值寡肽的方法，属于生物技术领域。本发明在无细胞体系中，利用重组菌无细胞提取物酶解大豆蛋白，获得高F值大豆蛋白肽。与添加商品酶不同，该体系利用分子手段，提高微生物的产酶量，极大的降低了制备高F值蛋白肽的成本，并且可以做到定向水解有效提高蛋白肽的F值。并且，与常规的全细胞催化方式不同，该物细胞体系不需额外添加辅酶或其他的醇脱氢酶和羰基还原酶，是一种具有广泛使用性的经济的、方便的、有效的生物催化系统。

Description

一种合成大豆基高F值寡肽的方法
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，具体设计一种以大豆蛋白为原料通过无细胞体系制备高F值寡肽的方法。
背景技术
无细胞生物催化系统，又称无细胞代谢工程，是在体外设计组装一系列酶及辅酶或细胞提取物，构建生化代谢网络获得目标产物的过程。其核心思想是基于合成生物学和代谢工程，来设计许多化合物的更高效的合成路线及人工生物合成体系，被称为下一代生物制造平台。
高F值寡肽（F值＞20）是由2-9个氨基酸残基组成的低聚肽混合物，F值是低聚肽混合物中支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸简称BCAA）与芳香氨基酸（苯丙氨酸和酪氨酸简称AAA）的物质的量比值。支链氨基酸在高F值寡肽内占比极高，此独特的氨基酸组成可以赋予高F值寡肽独特的生理功能，如保肝、护肝、辅助治疗肝性脑病；治疗苯丙酮尿症；抗疲劳；抗氧化、抗衰老；解醉酒等。制备寡肽的方法大体分为分离提取法、化学合成法、和蛋白酶解法，其中酶解法因其反应条件温和且稳定性较好等优点而广泛应用。但是，酶解法所用的酶通常为商品酶，商品酶活性高但价格昂贵成本高昂，并且无法定向水解其中芳香族氨基酸导致无法有效去除芳香族氨基酸进而制备的大豆蛋白肽F值不高。目前，尚没有利用重组菌无细胞提取物水解蛋白制备高F值寡肽的报道。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提出了一种利用无细胞提取物催化大豆蛋白制备大豆高F值寡肽的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种高效合成大豆基高F值寡肽的无细胞体系，主要成分分别为枯草杆菌蛋白酶E、枯草杆菌蛋白酶C以及羧肽酶，利用重组菌无细胞提取物酶解大豆分离蛋白粉、脱芳、离心过滤即得。
所述大豆分离蛋白粉的制备方法为：将大豆脱脂、提取蛋白质。
所述的脱脂方法为，将大豆去皮后粉碎，过60-100目筛，按大豆粉与石油醚以1：（5-10）（v/v）置于密闭玻璃容器中，常温下在磁力搅拌器上搅拌5-10h，除去上清液（石油醚和脂肪），至少再重复一次以上操作，将沉淀部分风干得到脱脂大豆粉。
所述提取蛋白质的方法为：在脱脂大豆粉中按固液比1：（5-10）（m/V）加入去离子水，常温下在磁力搅拌器上搅拌混合5-15min。用1mol/L的NaOH溶液调节大豆粉乳液pH值为8.0-1.0，以4000-6000r/min离心15-30min去除其中不溶性物质。取上清液用2mol/L的HCl溶液调pH值为3-5，再6000-8000r/min离心5-10min，使蛋白质处于等电点状态而凝聚沉淀下来。取离心沉淀物加5-10倍去离子水，水洗离心（3000-5000r/min，2-10min）两次以上，弃去上清液，将沉淀物冷冻干燥得到大豆分离蛋白粉。
重组菌无细胞提取物的制备方法如下；
（1）重组菌的构建：提取基因组的菌种为枯草芽孢杆菌168；
以枯草芽孢杆菌168基因组DNA作为PCR扩增模板，利用含有NheI限制性酶切位点的引物1和含有MluI限制性酶切位点的引物2通过PCR反应扩增aprE基因片段，利用含有NheI限制性酶切位点的引物3和含有MluI限制性酶切位点的引物通过PCR反应扩增ypwA基因片段，利用含有NheI限制性酶切位点的引物5和含有MluI限制性酶切位点的引物6通过PCR反应扩增apr基因片段：
引物1：CGGCTAGCGTGAGAAGCAAAAAATTGTGG
引物2：CGACGCGTTTATTGTGCAGCTGCTTGTACG
引物3：CGGCTAGCATGGAGATACATACAT
引物4：CGACGCGTTTATAACAGATAGAGATTTG
引物5：CGGCTAGCATGATGAGGAAAAAGAGTTTTTGGCTTGG
引物6：CGACGCGTTTATTGAGCGGCAGCTTCGACATT
PCR反应体系1：ddH2O：22μL；2×phanta max master mix：25μL；Bacillus subtilis168基因组1μL；引物1：1μL；引物2：1μL 。
PCR反应体系2： ddH2O：22μL；2×phanta max master mix：25μL；Bacillus subtilis168基因组1μL；引物3：1μL；引物4：1μL 。
PCR反应体系3：ddH2O：22μL；2×phanta max master mix：25μL；Bacillus subtilis168基因组1μL；引物5：1μL；引物6：1μL 。
PCR反应过程：95℃预变性3min，95℃变性30s，55.4℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min，以上三个PCR反应体系均可采用此PCR过程。
利用限制性内切酶NheI和MluI对扩增得到的aprE基因与载体pMA5进行双酶切处理，处理后DNA片段插入载体pMA5的NheI和MluI位点获得带有目的基因片段的重组质粒，重组质粒转入大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞中进行质粒扩增，扩增后通过含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选目的重组菌株；提取重组菌株中的重组质粒转入枯草芽包杆菌168中。若成功转入，带有重组质粒的枯草芽孢杆菌168将在含有20μg/mL卡那霉素的平板上长出单菌落。
利用限制性内切酶NheI和MluI对扩增得到的apr基因与载体pMA5进行双酶切处理，处理后DNA片段插入载体pMA5的NheI和MluI位点获得带有目的基因片段的重组质粒，重组质粒转入大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞中进行质粒扩增，扩增后通过含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选目的重组菌株；提取重组菌株中的重组质粒转入枯草芽包杆菌168中。若成功转入，带有重组质粒的枯草芽孢杆菌168将在含有20μg/mL卡那霉素的平板上长出单菌落
利用限制性内切酶NheI和MluI对扩增得到的ypwA基因与载体pMA5进行双酶切处理，处理后DNA片段插入载体pMA5的NheI和MluI位点获得带有目的基因片段的重组质粒，重组质粒转入大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞中进行质粒扩增，扩增后通过含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选目的重组菌株；提取重组菌株中的重组质粒转入枯草芽包杆菌168中，若成功转入，带有重组质粒的枯草芽孢杆菌168将在含有20μg/mL卡那霉素的平板上长出单菌落。
（2）重组菌无细胞提取物制备
LB培养基，以g/L计：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，氨苄青霉素0.05，固体培养基添加琼脂粉20。
TB培养基，以g/L计：蛋白胨12，酵母粉24，甘油4，D-山梨醇50，磷酸二氢钾0.272，磷酸氢二钾16.416，固体培养基添加琼脂粉20；需要时添加20μg/mL卡那霉素。
挑取含有20μg/mL卡那霉素的平板中枯草芽孢杆菌168单菌落接种于5mL/50mL摇管（含20-50μg/mL卡那霉素）的LB液体培养基中，于37℃，200rpm震荡培养8-12h；取1mL培养好的菌液转接于50mLTB培养基中（含20-50μg/mL卡那霉素），置于37℃摇床中，200rpm震荡培养8-12h。培养后的枯草芽孢杆菌细胞6000-10000rpm离心10-20min，所得上清液即为无细胞提取物用于酶解大豆分离蛋白粉。
所述无细胞提取物的制备方法为：
枯草杆菌蛋白酶E无细胞提取物：将所得含有aprE基因片段的重组菌发酵培养后8000r/min离心10min，收集上清液即为枯草杆菌蛋白酶E无细胞提取物。
枯草杆菌蛋白酶C无细胞提取物：将所得含有apr基因片段的重组菌发酵培养后8000r/min离心10min，收集上清液即为枯草杆菌蛋白酶E无细胞提取物。
羧肽酶无细胞提取物：将所得含有ypwA基因片段的重组菌发酵培养后8000r/min离心10min，收集上清液即为枯草杆菌蛋白酶E无细胞提取物。
无细胞提取物催化大豆蛋白的方法为：将枯草杆菌蛋白酶E无细胞提取液预热，将大豆蛋白加入到无细胞提取物中，调节pH进行第一阶段水解。第一阶段水解完成后，加入枯草杆菌蛋白酶C和羧肽酶无细胞提取物进行第二阶段水解，灭酶后得到酶解液。
所述主要成分为枯草杆菌蛋白酶 E的无细胞提取物的加入量为500~10000U/g，所述第一次调节pH为8-10，第一阶段酶解温度为40-60℃，第一阶段酶解时间为8-10小时。
所述第二阶段枯草杆菌蛋白酶C、羧肽酶无细胞提取物加入量为500~10000U/g，两者比例为1：（1-3），所述第二阶段调节pH为5-7，第二阶段酶解温度为40-60℃，第二阶段的酶解时间为6-8小时。
本领域技术人员能够理解，酶的加入量与反应底物之间用量关系，可以根据实际需要控制的反应时间和效果来决定。通常酶用量越多，反应时间会相应缩短，转化率越高，因此，本发明给出的酶用量并非对本发明方案的限制。
所述脱芳为使用活性炭脱除酶解液中芳香族氨基酸的工序；
优选地，脱芳的方法为：调节酶解液pH至1-5，然后按料液比1：（1-10）向酶解液中加入活性炭，温度为40-60℃，时间为1-5h，即得。
经过上述工艺制备得到的大豆蛋白肽具有较高的F值。F值超过35，更高的可以超过38，进一步超过40或者42。
本发明构建重组菌株的基因aprE、apr、ypwA菌来自枯草芽孢杆菌，分别编码枯草杆菌蛋白酶 E(Subtilisin E)、枯草杆菌蛋白酶C(Subtilisin Carlsberg)、羧肽酶(Carboxypeptidase)。其中枯草杆菌蛋白酶E酶切位点广泛、特异性不强，可破坏蛋白质的空间结构，将其水解为较短小的肽链，枯草杆菌蛋白酶C可定向水解肽链中芳香族氨基酸，酶解后可使芳香族氨基酸位于新肽链的端部，羧肽酶是外切酶可水解肽链羧基端氨基酸，经羧肽酶水解后可使其中芳香族氨基酸充分游离，进而利用活性炭吸附提高F值。本发明在通过制备三种蛋白酶的无细胞提取物水解大豆大蛋白，并利用活性炭吸附芳香族氨基酸，可精准有效去除其中芳香族氨基酸，提高所得大豆蛋白肽的F值。
有益效果：
本发明利用无细胞体系水解大豆蛋白制备高F值寡肽，解决了现有方法中利用商品化蛋白酶酶解大豆蛋白无法定向水解其中芳香族氨基酸的缺陷，利用本发明中无细胞体系酶解大豆蛋白，可使肽链中芳香族氨基酸充分游离后通过活性炭吸附去除，本发明中制备的大豆寡肽F值达40.58。
本发明中利用无细胞体系制备大豆高F值寡肽，可有效缩短酶解时间。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通科技人员通常理解的相同含义。
需要说明的是，下列实施例中，所述水解度使用pH-stat法进行测量，所示F值通过高效液相法测定支链氨基酸与游离氨基酸含量得比值
枯草芽孢杆菌168是现有商品化的菌株，可以从商业途径购买得到，以下实施例中所用的枯草芽孢杆菌168 购买于淼灵生物科技有限公司。
实施例1
（1）重组菌的构建
从B.subtilis 168中提取基因组作为模板。
枯草芽孢杆菌168（购买于淼灵生物科技有限公司）培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。
将枯草芽孢杆菌菌种接种于培养基装液量为10%的500mL摇瓶中于37℃、200rpm震荡培养12h。培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞利用基因组DNA提取试剂盒（VIOGENE公司）提取基因组。
以枯草芽孢杆菌基因组DNA作为PCR扩增反应模板，利用含有NheI和含有MluI限制性酶切位点的引物扩增aprE、epr、pywA基因片段
aprE-F-NheI：CGGCTAGCGTGAGAAGCAAAAAATTGTGG
aprE-R-MluI：CGACGCGTTTATTGTGCAGCTGCTTGTACG
apr-F-NheI：CGGCTAGCATGATGAGGAAAAAGAGTTTTTGGCTTGG
apr-R-MluI：CGACGCGTTTATTGAGCGGCAGCTTCGACATT
ypwA-F-NheI：CGGCTAGCATGGAGATACATACAT
ypwA-R-Mlu I：CGACGCGTTTATAACAGATAGAGATTTG
反应程序为95℃预变性3min，95℃变性30s，55.4℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min，反应结束后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增果，并做胶回收纯化，PCR反应体系如表1。
表1：PCR反应体系
反应物 体积（μL）
上游引物 1
下游引物 1
2×phanta max master mix 25
Bacillus subtilis168基因组 1
无菌水 Up to 50
PCR产物利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit（上海申能博彩生物科技有限公司）纯化DNA片段。
利用限制内切酶NheI和MluI对扩增得到的aprE、apr、ypwA基因片段进行双酶切处理，处理后的DNA片段插入质粒载体pMA5的NheI和MluI位点分别获得带有目的基因片段aprE、apr、ypwA的三种重组质粒。将重组质粒分别转入大肠杆菌感受态DH5α感受态细胞中，通过含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选目的重组菌株DH5α（pMAAPRE）DH5α（pMAAPR）DH5α（pMAYPWA）。
将目的基因PCR产物DNA 片段和质粒pMA5进行双酶切。反应体系为10×QuickCutGreen Buffer 5μL，DNA 5μL，NheI 2μL，MluI 2μL，ddH2O 36μL，震荡使液体充分混匀，37℃水浴1.5h，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并且胶回收目的片段，浓缩。
将目的基因DNA片段于质粒pMA5连接，反应体系组成如下：质粒pMA5 10μL，插入目的片段4μL，10×Ligase2μL，T4 DNA连接酶2μL，ddH2O 2μL，混合连接液将其置于16℃培养箱中连接16h。
连接反应产物转化入大肠杆菌感受态中，在100μLE.coli DH5α感受态细胞悬浊液中加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入 42℃水浴中，热击90秒。快速转移至冰浴中，冷却2min。每管中加入900μLLB液体培养基，37℃，180rpm摇床中温浴90min。培养后菌液3000rpm离心2分钟，弃去800μL上清液，剩余菌液混匀后涂布到含有100μg/mL，氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置过夜培养。
培养后的单菌落经测序鉴定后获得含有蛋白酶基因aprE、apr、ypwA的重组大肠杆菌DH5α（pMAAPRE）DH5α（pMAAPR）DH5α（pMAYPWA）。
利用质粒小提试剂盒提取重组大肠杆菌中的重组质粒，并将重组质粒转入枯草芽孢杆菌168中。转化方法如下：取出实验室保藏的枯草芽孢杆菌感受态细胞，水浴3min，加入1μgDNA，37℃培养90min后取100μL涂布于含有20μg/mL的卡那霉素LB固体平板中。
实施例2
重组菌无细胞提取物的制备：
LB培养基组成：蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%。需要时使用前加入卡那霉素（20μg/mL）；固体培养基添加2%琼脂粉。
TB培养基，以g/L计：蛋白胨12，酵母粉24，甘油4，D-山梨醇50，磷酸二氢钾0.272，磷酸氢二钾16.416。需要时使用前加入卡那霉素（20μg/mL）。
挑取实施例1中含卡那霉素的LB固体平板上含有目的基因aprE单菌落接种于5mL/50mL摇管（含20μg/mL卡那霉素）的LB液体培养基中，于37℃，200rpm震荡培养8h；取1mL培养好的菌液转接于50mLTB培养基中（含20μg/mL卡那霉素），置于37℃摇床中，200rpm震荡培养8h。培养后的枯草芽孢杆菌细胞6000rpm离心10min，所得上清液即为枯草杆菌蛋白酶E无细胞提取物用于酶解大豆蛋白。本实施例中无细胞提取物种酶活测定参照国标GBT23527-2009中福林法，测定结果为：枯草杆菌蛋白酶E的酶活为503.8U/mL。
实施例3
重组菌无细胞提取物的制备：
LB培养基组成为蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%。需要时使用前加入卡那霉素（20μg/mL）；固体培养基添加2%琼脂粉。
TB培养基，以g/L计：蛋白胨12，酵母粉24，甘油4，D-山梨醇50，磷酸二氢钾0.272，磷酸氢二钾16.416。需要时使用前加入卡那霉素（20μg/mL）。
挑取实施例1中LB含卡那霉素LB固体平板上含有目的基因apr的单菌落接种于5mL/50mL摇管（含35μg/mL卡那霉素）的LB液体培养基中，于37℃，200rpm震荡培养10h；取2mL培养好的菌液转接于50mLTB培养基中（含35μg/mL卡那霉素），置于37℃摇床中，200rpm震荡培养10h。培养后的枯草芽孢杆菌细胞8000rpm离心15min，所得上清液即为枯草杆菌蛋白酶C无细胞提取物用于酶解大豆蛋白。本实施例中无细胞提取物种酶活测定参照国标GBT23527-2009中福林法，测定结果为：枯草杆菌蛋白酶C的酶活为793.5U/mL。
实施例4
重组菌无细胞提取物的制备：
LB培养基组成为蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%。需要时使用前加入卡那霉素（20μg/mL）；固体培养基添加2%琼脂粉。
TB培养基，以g/L计：蛋白胨12，酵母粉24，甘油4，D-山梨醇50，磷酸二氢钾0.272，磷酸氢二钾16.416。需要时使用前加入卡那霉素（20μg/mL）。
挑取实施例1中含卡那霉素LB固体平板上含有目的基因ypwA的单菌落接种于5mL/50mL摇管（含50μg/mL卡那霉素）的LB液体培养基中，于37℃，200rpm震荡培养12h；取3mL培养好的菌液转接于50mLTB培养基中（含50μg/mL卡那霉素），置于37℃摇床中，200rpm震荡培养12h。培养后的枯草芽孢杆菌细胞10000rpm离心20min，所得上清液即为羧肽酶无细胞提取物用于酶解大豆蛋白。本实施例中无细胞提取物种酶活测定参照国标GBT23527-2009中福林法，测定结果为：羧肽酶的酶活为741.3U/mL。
实施例5
大豆蛋白脱脂方法为，将大豆去皮后粉碎，过100目筛，按大豆粉与石油醚以1：8（v/v）置于密闭玻璃容器中，常温下在磁力搅拌器上搅拌8h，除去上清液（石油醚和脂肪），至少再重复一次以上操作，将沉淀部分风干得到脱脂大豆粉。
在脱脂大豆粉中加入去离子水，浓度为5g/L，常温下在磁力搅拌器上搅拌混合10min。用1mol/L的NaOH溶液调节大豆粉乳液pH值为8.0，以6000r/min离心30min去除其中不溶性物质。取上清液用2mol/L的HCl溶液调pH值为3，再8000r/min离心10min，使蛋白质处于等电点状态而凝聚沉淀下来。取离心沉淀物加10倍去离子水，水洗离心（5000r/min，10min）两次以上，弃去上清液，将沉淀物冷冻干燥得到大豆分离蛋白粉。
实施例6
无细胞提取物催化大豆蛋白制备高F值大豆肽：
将 4mL枯草杆菌蛋白酶E的无细胞提取物置于40℃水浴锅中预热10min，将制备所得的1g大豆分离蛋白粉加入到无细胞提取物中，枯草杆菌蛋白酶E的无细胞产物与底物的加入比为2015.2U/g，调节体系内pH为8，40℃保温催化1h后加入1mL枯草杆菌蛋白酶C、1mL羧肽酶的无细胞提取物进行定向酶解其中芳香族氨基酸，加酶量为1534.8U/g，两者体积比为1：1；调节pH为5，40℃保温催化2h。
向上述所得酶解液中加入活性碳去除芳香族氨基酸：调节酶解液pH至5，然后向酶解液中加入5g活性炭，温度为40℃，时间为1h，即得大豆肽。
所得大豆肽的F值测定：利用氨基酸自动分析仪测定无细胞体系酶解大豆蛋白后质量氨基酸与芳香氨基酸含量，结果见表1。
表1
氨基酸 含量/mg·mL-1
缬氨酸 5.11
亮氨酸 11.24
异亮氨酸 1.07
支链氨基酸 17.42
苯丙氨酸 0.41
色氨酸 0.09
酪氨酸 0.06
质量氨基酸 0.56
由上表可知支链氨基酸总含量为17.42mg·mL-1，芳香族氨基酸总含量为0.576mg·mL-1，查表可知，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸的相对分子质量分别为117.75、131.11、131.11；苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的相对分子质量分别为165.068、181.20、204.11。根据F值定义：F值为支链氨基酸与芳香氨基酸的摩尔比。计算F=
Figure DEST_PATH_IMAGE002
=42.43（F>20）。
实施例7
无细胞提取物催化大豆蛋白制备高F值大豆肽：
将 10mL枯草杆菌蛋白酶E的无细胞提取物置于50℃水浴锅中预热10min，将制备所得的4g大豆分离蛋白粉加入到无细胞提取物中，枯草杆菌蛋白酶E的无细胞产物与底物的加入比为1259.5U/g，调节体系内pH为8，50℃保温催化2h后加入2mL枯草杆菌蛋白酶C、4mL羧肽酶的无细胞提取物进行定向酶解其中芳香族氨基酸，加酶量为1138.05U/g，两者体积比为1：2；调节pH为5，50℃保温催化3h。
向上述所得酶解液中加入活性碳去除芳香族氨基酸：调节酶解液pH至3，然后向酶解液中加入10g活性炭，温度为50℃，时间为3h，即得大豆肽。
无细胞提取物制备所得大豆肽的F值测定：利用氨基酸自动分析仪测定无细胞体系酶解大豆蛋白后质量氨基酸与芳香氨基酸含量，结果见表2。
表2
氨基酸 含量/mg·mL-1
缬氨酸 4.85
亮氨酸 11.27
异亮氨酸 2.09
支链氨基酸 18.21
苯丙氨酸 0.54
色氨酸 0.02
酪氨酸 0.07
质量氨基酸 0.63
由上表可知支链氨基酸总含量18.21mg·mL-1，芳香族氨基酸总含量为0.63mg·mL-1，查表可知，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸的相对分子质量分别为117.75、131.11、131.11；苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的相对分子质量分别为165.068、181.20、204.11。根据F值定义：F值为支链氨基酸与芳香氨基酸的摩尔比。计算F=
Figure 620290DEST_PATH_IMAGE002
=38.47（F>20）。
实施例8
无细胞提取物催化大豆蛋白制备高F值大豆肽：
将15mL枯草杆菌蛋白酶E无细胞提取物置于60℃水浴锅中预热10min，将8g制备所得的大豆分离蛋白粉加入到无细胞提取物中，无细胞产物与底物的加入比为944.625U/g，调节体系内pH为10，60℃保温催化3h后加入2mL枯草杆菌蛋白酶 C、6mL羧肽酶的无细胞提取物进行定向酶解其中芳香族氨基酸，加入量为754.35U/g，两者比例为1： 3，60℃保温催化4h。
向上述所得酶解液中加入活性碳去除芳香族氨基酸：调节酶解液pH至1，然后向酶解液中加入15g活性炭，温度为60℃，时间为5h，即得大豆肽。
制备所得大豆肽的F值测定：利用氨基酸自动分析仪测定无细胞体系酶解大豆蛋白后质量氨基酸与芳香氨基酸含量，结果见表3。
表3
氨基酸 含量/mg·mL-1
缬氨酸 4.69
亮氨酸 10.95
异亮氨酸 1.87
支链氨基酸 17.51
苯丙氨酸 0.49
色氨酸 0.03
酪氨酸 0.05
质量氨基酸 0.57
由上表可知支链氨基酸总含量为17.51mg·mL-1，芳香族氨基酸总含量为0.57mg·mL-1，查表可知，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸的相对分子质量分别为117.75、131.11、131.11；苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的相对分子质量分别为165.068、181.20、204.11。根据F值定义：F值为支链氨基酸与芳香氨基酸的摩尔比。计算F=
Figure 562969DEST_PATH_IMAGE002
=40.58（F>20）。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种合成大豆基高F值寡肽的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
cggctagcgt gagaagcaaa aaattgtgg 29
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
cgacgcgttt attgtgcagc tgcttgtacg 30
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
cggctagcat ggagatacat acat 24
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
cgacgcgttt ataacagata gagatttg 28
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
cggctagcat gatgaggaaa aagagttttt ggcttgg 37
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
cgacgcgttt attgagcggc agcttcgaca tt 32

Claims (9)

1.一种合成大豆基高F值寡肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)、将枯草芽孢杆菌168中的 aprE基因片段进行扩增，导入到载体中得到重组质粒，再转入枯草芽包杆菌168中，将枯草芽包杆菌168进行培养后，离心，所得上清液为枯草杆菌蛋白酶E无细胞体系；
2）、将枯草芽孢杆菌168中的apr基因片段进行扩增，导入到载体中得到重组质粒，再转入枯草芽包杆菌168中，将枯草芽包杆菌168进行培养后，离心，所得上清液为枯草杆菌蛋白酶C无细胞体系；
3）、将枯草芽孢杆菌168中的ypwA基因片段进行扩增，导入到载体中得到重组质粒，再转入枯草芽包杆菌168中，将枯草芽包杆菌168进行培养后，离心，所得上清液为羧肽酶无细胞体系；
4）、将步骤1）得到的枯草杆菌蛋白酶E无细胞体系预热，将大豆分离蛋白粉加入到无细胞提取物中，调节pH进行第一阶段水解；
5）、步骤4）第一阶段水解完成后，加入枯草杆菌蛋白酶C无细胞体系和羧肽酶无细胞体系进行第二阶段水解，灭酶后得到酶解液；
6）、使用活性炭脱除酶解液中芳香族氨基酸、离心过滤得大豆基高F值寡肽。
2.根据权利要求1所述的合成大豆基高F值寡肽的方法，其特征在于，枯草杆菌蛋白酶E无细胞体系的加入量为500~10000U/g。
3.根据权利要求1所述的合成大豆基高F值寡肽的方法，其特征在于，第一阶段水解pH为8-10，酶解温度为40-60℃，酶解时间为8-10小时。
4.根据权利要求1所述的合成大豆基高F值寡肽的方法，其特征在于，第二阶段枯草杆菌蛋白酶C、羧肽酶无细胞提取物加入量为500~10000U/g，两者比例为1：（1-3）。
5.根据权利要求1所述的合成大豆基高F值寡肽的方法，其特征在于，第二阶段调节pH为5-7，酶解温度为40-60℃，酶解时间为6-8小时。
6.根据权利要求1所述的合成大豆基高F值寡肽的方法，其特征在于，步骤6）中调节酶解液pH至1-5，然后按料液比1：（1-10）向酶解液中加入活性炭，温度为40-60℃，时间为1-5h。
7.根据权利要求1所述的合成大豆基高F值寡肽的方法，其特征在于，步骤4）中大豆分离蛋白粉是大豆蛋白经过脱脂和蛋白质提取分离所得。
8.根据权利要求1所述的合成大豆基高F值寡肽的方法，其特征在于，枯草芽包杆菌168进行培养是将单菌落接种于含20-50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm震荡培养8-12h；取1mL培养好的菌液转接于含20-50μg/mL卡那霉素的TB培养基中，置于37℃摇床中，200rpm震荡培养8-12h。
9.根据权利要求1所述的合成大豆基高F值寡肽的方法，其特征在于，制备得到的大豆肽F值超过35。
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