CN112587556A - 麻黄醇提取物、制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了麻黄醇提取物、制备方法及用途，该麻黄醇提取物为抑制冠状病毒Spike‑ACE2蛋白相互作用的活性部位，该活性部位不仅能够抑制冠状病毒Spike蛋白与ACE2蛋白的相互作用，IC50＜100μg/ml，同时能够促使Spike‑ACE2复合物的解离。在细胞水平上可以有效的抑制新型冠状病毒SARS‑CoV‑2假病毒入侵，IC50＜100μg/ml。表明该麻黄活性部位对于制备治疗和/或预防冠状病毒感染药物具有非常积极的作用。

Description

麻黄醇提取物、制备方法及用途
技术领域
本发明涉及药物技术，特别涉及麻黄醇提取物、制备方法及用途。
背景技术
SARS-CoV-2是一种新型冠状病毒，由SARS-CoV-2引起新型冠状病毒肺炎被WHO 命名为COVID-2019。到目前为止，还没有有效的方法来治疗这种传染病。因此，迫切需要生产疫苗或抗体药物来对抗这种疾病或筛选用于治疗这种极其危险的冠状病毒疾病的新药物。冠状病毒的刺突(Spike)蛋白有助于病毒识别并进入靶细胞。许多研究小组表明，SARS-CoV-2利用同源三聚体刺突(S)糖蛋白通过其受体结合结构域(RBD) 与血管紧张素转化酶2(ACE2)结合，进一步被人类蛋白酶进行蛋白水解激活，从而介导细胞感染。靶向SARS-CoV-2突刺蛋白和人类ACE2受体之间的相互作用目前被认为是一种关键的冠状病毒感染治疗策略。
麻黄属辛温解表药。味辛、微苦、性温；归肺，膀胱经。具有发汗散寒，宣肺平喘，利水消肿的功效，用于风寒感冒，胸闷喘咳，风水浮肿。蜜麻黄润肺止咳。多用于表症已解，气喘咳嗽。麻黄含生物碱、黄酮、有机酸、挥发油、多糖和鞣质等成分。目前尚未见麻黄能否抑制SARS-CoV-2入侵受体细胞的相关报道，其活性部位及作用机制也尚不清楚。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供麻黄醇提取物，该提取物为抑制冠状病毒Spike-ACE2 蛋白相互作用活性部位。
本发明另一目的是提供所述麻黄醇提取物的制备方法及用途。
技术方案：本发明提供一种麻黄醇提取物，为抑制冠状病毒Spike-ACE2蛋白相互作用活性部位。
一种麻黄醇提取物在抑制冠状病毒Spike-ACE2蛋白相互作用中的用途。
进一步地，所述麻黄醇提取物在抑制冠状病毒Spike-ACE2蛋白相互结合中的用途。
一种麻黄醇提取物在促使Spike-ACE2复合物的解离中的用途。
一种麻黄醇提取物在制备治疗和/或预防SARS-CoV-2病毒感染药物中的用途。
进一步地，所述治疗和/或预防SARS-CoV-2病毒感染药物剂型为口服给药剂型或非口服给药剂型。
一种麻黄抑制冠状病毒Spike-ACE2蛋白相互作用活性部位的制备方法，向麻黄中加入麻黄重量10～100倍的重量百分比浓度为70％～100％的乙醇，石油醚，二氯甲烷，乙腈，乙酸乙酯或丙酮，进行超声波辅助提取，提取温度为25～60℃，提取时间为0.5～ 2小时，超声频率为30～40KHz，过滤，浓缩，干燥的麻黄醇提取物。
进一步地，将浓缩或干燥的麻黄醇提取物溶解于蒸馏水中，用截留分子量为3K Da的超滤离心管5000×g/min离心0.5～2小时，取下层溶液，减压浓缩、回收溶剂。
进一步地，所述麻黄醇提取物阻断SARS-CoV-2RBD和ACE2重组蛋白的相互作用，半抑制浓度为95.01μg/ml。
由于冠状病毒刺突蛋白有助于病毒识别并进入靶细胞，是病毒入侵的关键蛋白。因此，靶向冠状病毒Spike蛋白和人类ACE2受体蛋白之间的相互作用是一种关键的冠状病毒感染治疗策略，Spike与ACE2之间蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂可应用于针对 Spike介导的冠状病毒感染的预防和/或治疗。本申请从中药麻黄中提取了一种可抑制 Spike-ACE2蛋白相互作用的活性部位，IC50＜100μg/ml，同时该活性部位能够促使 Spike-ACE2复合物的解离。在细胞水平上可以有效的抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2 假病毒入侵，IC50＜100μg/ml。该麻黄活性部位可作为有效的冠状病毒入侵抑制剂。
本发明的提取物还可以制成药物组合物，该组合物含有所述麻黄活性部位，以及药学上可接受的赋型剂。所述药学上可接受的赋形剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂或载体。本发明化合物可以与其他活性成分组合使用，只要它们不产生其他的不利作用。
有益效果：本发明的麻黄醇提取物即该活性部位不仅能够抑制冠状病毒Spike蛋白与ACE2蛋白的相互作用，IC50＜100μg/ml，同时能够促使Spike-ACE2复合物的解离。在细胞水平上可以有效的抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒入侵，IC50＜100μg/ml。表明该麻黄活性部位对于制备治疗和/或预防冠状病毒感染药物具有非常积极的作用。
附图说明
图1为本发明麻黄醇提取物(麻黄活性部位)抑制Spike与ACE2相互作用活性测定结果；
图2为仅加入新型冠状病毒S蛋白假病毒的模型对照组；
图3为加入新型冠状病毒S蛋白假病毒与180nMACE2重组蛋白混合物的阳性对照组；
图4为加入新型冠状病毒S蛋白假病毒与1 mg/ml麻黄活性部位混合物的实验组；
图5显示麻黄活性部位可以剂量依赖性抑制阻止新型冠状病毒S蛋白假病毒进入Calu-3细胞。
具体实施方式
实施例1麻黄醇提取物的制备方法
粉碎麻黄饮片获得麻黄药材粗粉；向麻黄中加入麻黄重量10～100倍的重量百分比浓度为70％～100％的乙醇，石油醚，二氯甲烷，乙腈，乙酸乙酯或丙酮，进行超声波辅助提取，提取温度为25～60℃，提取时间为0.5～2小时，超声频率为30～40KHz，过滤，浓缩，干燥的麻黄醇提取物。将浓缩或干燥的麻黄醇提取物溶解于蒸馏水中，用截留分子量为3K Da的超滤离心管5000×g/min离心0.5～2小时，取下层溶液，减压浓缩、回收溶剂。
实施例2性能测试
实施例1的产物抑制SARS-CoV-2新型冠状病毒Spike蛋白RBD区域与ACE2受体相互作用。
实验方法：竞争性结合抑制实验。向96孔微孔板中加入100μl 0.5μg/ml溶解于包被液(50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.6)的SARS-Cov-2 RBD重组蛋白，于4℃放置过夜。第二天，用300μl洗涤液(含0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液，pH 7.4)漂洗三次，去除未包被的蛋白。随后加入300μl封闭液(含2％牛血清白蛋白的洗涤液，pH 7.4)并在37℃条件下于封闭1小时。漂洗三次后，将50μl不同浓度麻黄活性部位与50μl的 0.12μg/ml生物素化的ACE2混合后加入96孔板，并在37℃孵育1小时。漂洗三次后，将100μl的链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶加入到每个孔中，并在37℃孵育1小时。漂洗三次后，将200μl显色液(含0.1mg/ml TMB以及0.004％过氧化氢的磷酸氢钠-柠檬酸缓冲液，pH5.5)添加到每个孔中，并在37℃避光孵育20分钟。加入50μl反应终止液(1M硫酸)后，使用酶标仪在450nm处读取吸光度。
实验结果：如图1所示，麻黄活性部位剂量依赖性阻断SARS-CoV-2RBD和ACE2 重组蛋白的相互作用，半抑制浓度为95.01 μg/ml。本发明所述麻黄活性部位能够高效抑制SARS-CoV-2新型冠状病毒Spike蛋白与ACE2受体相互作用。
实施例1的产物抑制SARS-CoV-2新型冠状病毒S蛋白假病毒入侵人肺腺上皮细胞(Calu-3)。
实验方法：新型冠状病毒S蛋白假病毒入侵细胞实验。SARS-CoV-2新型冠状病毒 S蛋白假病毒含有绿色荧光蛋白报告基因，当病毒入侵细胞后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达，反应了病毒入侵细胞的数量。将肺腺上皮细胞(Calu-3)均匀铺至孔板中，细胞培养使用含10％胎牛血清的MEM培养基，在37℃、5％CO2条件下培养，待细胞生长到50％开始进行实验。将相同浓度的SARS-CoV-2新型冠状病毒S蛋白假病毒与不同浓度麻黄活性部位混合后，在37℃孵育1小时，随后加入到每个孔中。正常培养24小时之后，用荧光显微镜拍照观察不同细胞中绿色荧光蛋白的表达情况，并用荧光酶标仪在激发波长为488nm发射波长为510nm定量检测绿色荧光蛋白的表达量，分析病毒入侵Calu-3细胞的数量。
实验结果：如图2-5为本发明麻黄醇提取物(麻黄活性部位)抑制SARS-CoV-2新型冠状病毒假病毒入侵人肺腺上皮细胞(Calu-3)活性测定结果，由图所示，麻黄活性部位可以阻止新型冠状病毒S蛋白假病毒进入Calu-3细胞，其中，图2为仅加入新型冠状病毒S蛋白假病毒的模型对照组。图3为加入新型冠状病毒S蛋白假病毒与180nM ACE2重组蛋白混合物的阳性对照组。图4为加入新型冠状病毒S蛋白假病毒与1mg/ml 麻黄活性部位混合物的实验组。可以在荧光显微镜下观察到，与模型对照组相比，加入阳性对照ACE2重组蛋白以及麻黄活性部位之后，绿色荧光蛋白表达明显减弱，二者均可以抑制病毒入侵细胞，起到保护作用。图5显示麻黄活性部位可以剂量依赖性抑制阻止新型冠状病毒S蛋白假病毒进入Calu-3细胞。这些结果均说明本发明所述麻黄活性部位抑制SARS-CoV-2新型冠状病毒S蛋白假病毒入侵人肺腺上皮细胞。

Claims (9)

1.一种麻黄醇提取物，其特征在于：为抑制冠状病毒Spike-ACE2蛋白相互作用的活性部位。
2.一种麻黄醇提取物在抑制冠状病毒Spike-ACE2蛋白相互作用中的用途。
3.根据权利要求2的用途，所述麻黄醇提取物在抑制冠状病毒Spike-ACE2蛋白相互结合中的用途。
4.一种麻黄醇提取物在促使Spike-ACE2复合物的解离中的用途。
5.一种麻黄醇提取物在制备治疗和/或预防SARS-CoV-2病毒感染药物中的用途。
6.根据权利要求5的用途，所述治疗和/或预防SARS-CoV-2病毒感染药物剂型为口服给药剂型或非口服给药剂型。
7.一种麻黄抑制冠状病毒Spike-ACE2蛋白相互作用活性部位的制备方法，其特征在于：向麻黄中加入麻黄重量10～100倍的重量百分比浓度为70％～100％的乙醇，石油醚，二氯甲烷，乙腈，乙酸乙酯或丙酮，进行超声波辅助提取，提取温度为25～60℃，提取时间为0.5～2小时，超声频率为30～40KHz，过滤，浓缩，干燥的麻黄醇提取物。
8.根据权利要求7所述的麻黄抑制冠状病毒Spike-ACE2蛋白相互作用活性部位的制备方法，其特征在于：将浓缩或干燥的麻黄醇提取物溶解于蒸馏水中，用截留分子量为3K Da的超滤离心管5000×g/min离心0.5～2小时，取下层溶液，减压浓缩、回收溶剂。
9.根据权利要求7所述的麻黄抑制冠状病毒Spike-ACE2蛋白相互作用活性部位的制备方法，其特征在于：所述麻黄醇提取物阻断SARS-CoV-2RBD和ACE2重组蛋白的相互作用，半抑制浓度为95.01μg/ml。
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