CN112575026A - 一种组合敲除水稻感病基因在创制广谱抗病材料上的应用 - Google Patents

一种组合敲除水稻感病基因在创制广谱抗病材料上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种组合敲除水稻感病基因在创制广谱抗病材料上的应用，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术组合敲除水稻的感病基因，从而提高水稻抗稻瘟病和白叶枯病的能力。本发明公开了水稻3个感病相关基因组合敲除突变体材料，证实了bxp三敲突变体材料不仅提高了水稻对稻瘟病菌的抗性，还提高了对白叶枯病的抗性，而且相比单突变，三突变体的抗病性水平存在叠加效应。在实现广谱抗病的同时，bxp三敲突变体与对照相比农艺性状无明显变化。

Description

一种组合敲除水稻感病基因在创制广谱抗病材料上的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种组合敲除水稻感病基因在创制广谱抗病材料上的应用。
背景技术
植物病害严重影响全球农作物的产量和品质。在农业生产过程中，作物在同一个成长季节往往相继或者同时受到两种或两种以上病原菌的侵染，因此提高作物的广谱抗病性对作物的高产和稳产具有重要意义。水稻是世界三大粮食作物之一，也是我国最重要的粮食作物，水稻生产对我国粮食安全具有基石的作用。白叶枯病(Bacterialeafblight)和稻瘟病(Riceblast)分别被认为是水稻最严重的细菌性病害和最具破坏性的真菌病害之一，严重威胁着水稻的产量和品质，在田间往往相继发生。培育同时提高对稻瘟病和白叶枯病抗病性的水稻品种是育种家的重要目标。
与抗病基因(R gene)赋予小种特异的抗性不同，感病基因(S gene)被认为是病原菌成功侵染病原体所需的关键因素。随着病原菌的不断进化，抗病基因往往会失去功效。因此，破坏感病基因的表达成为改善寄主抗性的一个方向。自从2002年在拟南芥中鉴定出pmr6(白粉病抗性)后，一种基于基因功能丧失而形成的新型抗病性概念就此产生，在此基础上提出了感病基因这一概念。同时，随着基因编辑技术的发展，使植物感病基因的编辑变得更加高效易行，提高植物抗性的需求使S基因编辑成为当前研究的热点。作为一个典型的代表，70年前，感病基因Mlo的功能丧失被证明对大麦具有抗白粉病的能力，而且这种突变体至今仍然被使用，具体表现为对田间所有的白粉菌小种都具有抗性。最近，TALEN和CRISPR-Cas9技术同时编辑的六倍体面包小麦的三个MLO等位基因赋予了小麦对白粉病的广谱抗性。有研究表明，利用CRISPR/Cas9技术在拟南芥eIF(iso)4E位点引入序列特异性点突变，赋予了拟南芥对芜菁花叶病毒(TuMV)的完全抗性。同样的技术被用于编辑黄瓜(Cucumis sativus L.)的eIF4E基因，达到对抗病毒的效果。除了病毒和真菌病原体外，感病基因也被用来激发对重要细菌病原体的免疫。CRISPR/Cas9介导的CsLOB1启动子编辑赋予了Wanjincheng orange对柑桔溃疡病的高度抗性，另一研究组利用CRISPR/Cas9技术对邓肯柚溃疡病易感基因CsLOB1也进行了编辑，编辑后的植株表现出很好的抗溃疡病的效果。在水稻中，CRISPR基因组编辑工具最初是对SWEET11和SWEET14进行编辑，基因编辑的植株表现出对白叶枯的持久抗性。以上研究表明，通过基因编辑技术改造寄主的感病基因是创制抗病种质的一条快捷可行的策略。
当前已经鉴定了不同病原菌在作物中一系列的感病基因，通过基因编辑技术已经创制了不少抗相应病原菌的作物新种质。但是聚合编辑这些感病基因是否可以同时增强对不同病原菌的抗病性？聚合这些感病基因对同一种病原菌的抗病水平是否有叠加的效应？聚合这些抗病基因是否会影响作物的正常生长？这些问题是在作物中应用感病基因迫切需要解决的问题。
基于现有报道，已经鉴定到了稻瘟菌和白叶枯菌在水稻中的一系列感病基因。如稻瘟菌感病基因Bsrd1和Pi21的敲除突变体材料都部分提高了水稻对稻瘟菌的抗病性，白叶枯菌的感病基因Xa5的突变体材料部分提高了对白叶枯菌的抗病性，但是这三个感病基因的抗病水平尚不足以单独用于抗病材料的创制。此外，Pi21和Xa5通常以单个数量性状的形式与其他基因聚合用于抗病分子育种，但这种方式所耗费的年限较长。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何利用基因编辑技术，快速创制水稻广谱抗病新材料，减少稻瘟病和白叶枯病危害。为培育水稻广谱抗病新品种和开发新的病害防治策略提供保障。
本发明的技术方案为：一种组合敲除水稻感病基因在创制广谱抗病材料上的应用，通过基因编辑技术组合敲除水稻的感病基因Bsrd1、Xa5和Pi21，从而提高水稻抗稻瘟病和白叶枯病的能力。
进一步地，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9。
进一步地，CRISPR/Cas9基因编辑技术组合敲除所使用的引物如下：引物对Bsrd1-F/Bsrd1-R，引物对Xa5-F/Xa5-R，引物对Pi21-F/Pi21-R；Bsrd1-F核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，Bsrd1-R核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，Xa5-F核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，Xa5-R核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，Pi21-F核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，Pi21-R核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
进一步地，具体步骤为：
(1)sgRNA引物设计
根据CRISPR/Cas9靶位点设计原则，针对水稻的感病基因Bsrd1、Xa5和Pi21选择靶位点序列，设计出三个基因的引物，并在Bsrd1正向和反向引物的5’端加上内切酶BsaI,Xa5正向和反向引物的5’端加上内切酶BtgZI的接头,Pi21正向和反向引物的5’端分别加上内切酶BsaI和BtgZI，引物序列如下表：
Figure BDA0002846670990000021
Figure BDA0002846670990000031
(2)将引物退火；
(3)消化载体
①先用BsaI酶切pENTR4-gRNA4，采用T4连接酶与Bsrd1引物连接后再用BtgZI酶切pENTR4-gRNA5与Xa5引物连接；
②用BsaI和BtgZI双酶切pENTR4-gRNA5，与Pi21连接；
③HindIII酶切①和②的载体，将三个靶序列都连接至pENTR4-gRNA5；
④Gateway反应，将pENTR4-gRNA5的片段转移至pBY02-OsCas9-ccdB载体；
(4)转化感受态细胞，转化农杆菌后接种水稻。
本发明为使用基因编辑技术组合敲除感病基因创制广谱抗病材料带来启示。一方面，敲除或沉默单个感病基因对抗性水平的影响往往有限，随着病原菌的不断进化将雇佣新的感病基因，使寄主抗性丧失；另一方面，单个基因的抗谱相对较窄，像Xa5敲除材料只对白叶枯表现部分抗性，Bsrd1和Pi21敲除材料只对稻瘟病有部分抗性。我们通过组合敲除上述三个感病基因得到抗性水平更高，抗谱更广的材料。更有趣的是，我们的三敲除体材料并未对关键农艺性状产生影响，使得这个材料拥有潜在的应用价值。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明公开了水稻3个感病相关基因Bsrd1,Xa5和Pi21组合敲除突变体材料，证实了bxp三敲突变体材料不仅提高了水稻对稻瘟病菌的抗性，还提高了对白叶枯病的抗性，而且相比单突变，三突变体的抗病性水平存在协同效应。在实现广谱抗病的同时，bxp三敲突变体与对照相比农艺性状无明显变化。
2、本发明揭示CRISPR技术组合编辑水稻感病基因达到广谱抗病存在可行性，对如何开发利用CRISPR创制水稻广谱抗病材料具有指导意义。
3、本发明为敲除植物感病基因应用于其它作物带来启示，组合编辑作物上的多个感病基因从而达到多重病原菌抗性的效果。
附图说明
图1为对照与Pi21和Bsrd1单敲除体接种稻瘟菌和对照与Xa5接种白叶枯菌的对比图；图中NPB为对照，A和D为病斑图片，B和E为病斑面积对比图，C和F为真菌生物量对比图，G为病斑图片，H为病斑长度对比图；
图2为对照与bxp三敲除接种稻瘟菌的对比图；图中NPB为对照，3-2和4-1为bxp三敲除株系，A为病斑图片，B为病斑面积对比图，C为真菌生物量对比图；
图3为对照与bxp三敲除接种白叶枯菌的对比图；图中NPB为对照，3-2和4-1为bxp三敲除株系，A为病斑图片，B为病斑长度对比图；
图4为对照与bxp三敲除农艺性状对比图，图中NPB为对照，3-2和4-1为bxp三敲除株系，A为结实率对比图，B为千粒重对比图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
1、实验方法
CRISPR载体使用中国农科院植物保护研究所周焕斌老师实验室的pENTR4:gRNA4/gRNA5与pBY02-OsCas9-ccdB系列载体(Zhou et al.,2014a)与构建体系，由于pENTR4:gRNA4/gRNA5与pBY02-OsCas9-ccdB都是卡那霉素抗性(Kan+)载体，为了方便与pBY02-OsCas9-ccdB载体做Gateway反应，作为改进，我们将pENTR4:gRNA4/gRNA5中的Kan+基因替换为氨苄霉素抗性(Amp+)基因，新载体命名为pENTR4:AgRNA4/gRNA5。具体操作如下所示：
(1)sgRNA引物的设计
主要针对sgRNA中的crRNA的靶标序列设计引物。靶标位点设计使用华南农业大学刘耀光实验室开发的CRISPR引物在线设计软件，网址为http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/#，该网站可以分析整个基因中所有可能的靶位点并进行评估。靶标序列选好后，作为正向引物，其反向互补引物作为反向引物，保证第一个碱基为G，(因为gRNA的启动子为U6启动子)。分别在bsrd1正向和反向引物的5’端加上内切酶BsaI,Xa5正向和反向引物的5’端加上内切酶BtgZI的接头,Pi21正向和反向引物的5’端分别加上内切酶BsaI和BtgZI。引物：
基因 引物F 引物R
Bsrd1 GTGTGCGGAGCTCCTCAGGCGCCG AAACCGGCGCCTGAGGAGCTCCGC
Xa5 TGTTGTAGAGCTCGAAGGTGGCCA AAACTGGCCACCTTCGAGCTCTAC
Pi21 GTGTGCCTGATCTTGGCATCGCAG AAACCTGCGATGCCAAGATCAGGC
(2)正反互补引物退火
Figure BDA0002846670990000041
70℃加反应5min，冰上冷却。
(3)消化载体
①先用BsaI(Takara公司)酶切2μg pENTR4-gRNA4，采用T4连接酶(Thermo公司)与Bsrd1连接后再用BtgZI酶切2μg pENTR4-gRNA5与Xa5连接。酶切体系和连接体系如下：
酶切体系(40μL)
Figure BDA0002846670990000051
37℃反应1h。
连接体系(20μL)：
Figure BDA0002846670990000052
22℃反应2h.
②用BsaI和BtgZI双酶切pENTR4-gRNA5，与Pi21连接。
③HindIII酶切①和②的载体，将三个靶序列都连接至pENTR4-gRNA5。
④Gateway反应：Gateway重组酶使用Invitrogen公司的Gateway LR Clonase II(货号：11791020)。重组反应体系如下：
pBY02-OsCas9-ccdB载体1μL
回收片段或pENTR4:AgRNA4/gRNA5 2μL(片段)或1μL(载体)
LR重组酶0.5μL
ddH2O补充至5μL
室温或25℃条件过夜，如果效率低可以延长反应时间。
(4)转化感受态细胞
热激转化DH5α菌株。
(5)鉴定转化子
提取质粒，使用U6P-F1引物与反向引物做PCR扩增，扩增出目的条带的转化子送公司测序进一步确定。
(6)转化农杆菌
取0.2μL步骤5)获得的载体质粒，加入50μL EHA105感受态，电击转化。
(7)鉴定转化子
PCR扩增检测，使用U6P-F1引物与反向引物做PCR扩增，扩增出目条带的转化子，摇菌送公司做转化。
(8)敲除突变体植株的鉴定
将幼苗栽种，并提取植物体DNA，检测其靶标基因是否编辑及编辑类型。选不同编辑类型的植株进行抗病性评价。
(9)三敲除体植株抗病性评价
按单株分别收敲除材料种子。经干燥后，播种野生型日本晴和bxp三敲除体株系，待长到5～8周大时，进行叶片稻瘟病和白叶枯病抗性鉴定。将水稻放在植物生长箱中，挑选水稻倒二叶进行稻瘟菌打孔接种，接种时设定温度28℃，湿度≥80％，12小时光照，12小时黑暗。10～14天观察病斑扩展情况，调查病情，统计病斑面积和生物量，白叶枯病在室外接菌，挑选水稻剑叶进行剪叶法接种，14天观察病斑扩展情况，评价突变体株系与野生型材料间的抗性差异。
2、实验结果分析
(a)bxp三敲除体植株编辑类型鉴定：
将幼苗栽种，并提取植物体DNA，检测其靶标基因是否编辑及编辑类型，结果如下：
Figure BDA0002846670990000061
上表看出，bxp三敲除株系bxp-3-2和bxp-4-1在三个基因相应位置存在插入或缺失。
(b)单敲除体稻瘟病及白叶枯病鉴定
稻瘟菌打孔接种发现，与NPB相比，Pi21和Bsrd1单敲除体植株都增强了对稻瘟菌生理小种RB22的抗病性，病斑减小(图1中A和D)。发病面积分别为对照的75％和65％左右(图1中B和E)。同时，通过提取发病区域的DNA，利用定量PCR检测发病区域的真菌生物量，结果显示与野生型相比，Pi21和Bsrd1单除体植株上真菌生物量下降为对照的50％和60％左右(图1中C和F)。
白叶枯菌剪叶法接种发现，与NPB相比，Xa5单敲除体植株增强了对白叶枯病小种PXO99A的抗病性，病斑长度减短(图1中G)。统计长度结果显示与NPB相比，Xa5单敲除体植株发病长度为对照的50％左右(图1中H)。
(c)bxp三敲除体植株抗稻瘟病鉴定
稻瘟菌打孔接种发现，与NPB相比，bxp三敲除体植株增强了对稻瘟菌生理小种RB22的抗病性，病斑明显减小(图2中A)。发病面积仅为对照的50％左右(图2中B)。同时，通过提取发病区域的DNA，利用定量PCR检测发病区域的真菌生物量。结果显示与野生型相比，bxp三敲除体植株上真菌生物量下降为对照的25％左右(图2中C)。
表1 不同株系发病叶片的相对病斑面积
Figure BDA0002846670990000071
表2 不同株系发病叶片的稻瘟病的相对生物量
Figure BDA0002846670990000072
(d)bxp三敲除体植株抗白叶枯病鉴定
白叶枯菌剪叶法接种发现，与NPB相比，bxp三敲除体植株增强了对白叶枯病小种PXO99A的抗病性，病斑长度明显减短(图3中A)。统计长度结果显示与NPB相比，bxp三敲除体植株发病长度仅为对照的30％左右(图3中B)。
(e)bxp三敲除体田间农艺性状的鉴定
NPB和bxp三敲除体植株在田间各种植100株左右，随机取样调查农艺性状。与NPB相比，bxp三敲除体植株的结实率(图4中A)和千粒重(图4中B)无明显差异，表明bxp三敲除体植株在实现广谱抗病的同时对其农艺性状无显著影响。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 一种组合敲除水稻感病基因在创制广谱抗病材料上的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgtgcggag ctcctcaggc gccg 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaccggcgc ctgaggagct ccgc 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgttgtagag ctcgaaggtg gcca 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaactggcca ccttcgagct ctac 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgtgcctga tcttggcatc gcag 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaacctgcga tgccaagatc aggc 24

Claims (4)

1.一种组合敲除水稻感病基因在创制广谱抗病材料上的应用，其特征在于，通过基因编辑技术组合敲除水稻的感病基因Bsrd1、Xa5和Pi21，从而提高水稻抗稻瘟病和白叶枯病的能力。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，CRISPR/Cas9基因编辑技术组合敲除所使用的引物如下：引物对Bsrd1-F/Bsrd1-R，引物对Xa5-F/Xa5-R，引物对Pi21-F/Pi21-R；Bsrd1-F核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，Bsrd1-R核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，Xa5-F核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，Xa5-R核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，Pi21-F核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，Pi21-R核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体步骤为：
(1)sgRNA引物设计
根据CRISPR/Cas9靶位点设计原则，针对水稻的感病基因Bsrd1、Xa5和Pi21选择靶位点序列，设计出三个基因的引物，并在Bsrd1正向和反向引物的5’端加上内切酶BsaI,Xa5正向和反向引物的5’端加上内切酶BtgZI的接头,Pi21正向和反向引物的5’端分别加上内切酶BsaI和BtgZI，引物序列如下表：
基因 引物F 引物R Bsrd1 GTGTGCGGAGCTCCTCAGGCGCCG AAACCGGCGCCTGAGGAGCTCCGC Xa5 TGTTGTAGAGCTCGAAGGTGGCCA AAACTGGCCACCTTCGAGCTCTAC Pi21 GTGTGCCTGATCTTGGCATCGCAG AAACCTGCGATGCCAAGATCAGGC
(2)将引物退火；
(3)消化载体
①先用BsaI酶切pENTR4-gRNA4，采用T4连接酶与Bsrd1引物连接后再用BtgZI酶切pENTR4-gRNA5与Xa5引物连接；
②用BsaI和BtgZI双酶切pENTR4-gRNA5，与Pi21连接；
③HindIII酶切①和②的载体，将三个靶序列都连接至pENTR4-gRNA5；
④Gateway反应，将pENTR4-gRNA5的片段转移至pBY02-OsCas9-ccdB载体；
(4)转化感受态细胞，转化农杆菌后接种水稻。
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