CN112574959A - 一种防治水产动物气单胞菌病害的噬菌体及其应用 - Google Patents

一种防治水产动物气单胞菌病害的噬菌体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112574959A
CN112574959A CN202011287731.0A CN202011287731A CN112574959A CN 112574959 A CN112574959 A CN 112574959A CN 202011287731 A CN202011287731 A CN 202011287731A CN 112574959 A CN112574959 A CN 112574959A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aeromonas
phage
bacteriophage
veronii
liquid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011287731.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112574959B (zh
Inventor
姜宗然
靳婷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xiamen Changke Bioengineering Co ltd
Original Assignee
Xiamen Changke Bioengineering Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xiamen Changke Bioengineering Co ltd filed Critical Xiamen Changke Bioengineering Co ltd
Priority to CN202011287731.0A priority Critical patent/CN112574959B/zh
Publication of CN112574959A publication Critical patent/CN112574959A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112574959B publication Critical patent/CN112574959B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K61/00—Culture of aquatic animals
    • A01K61/10—Culture of aquatic animals of fish
    • A01K61/13—Prevention or treatment of fish diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00031—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提出了一种防治水产动物气单胞菌病害的噬菌体及其应用，所述噬菌体于2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020414。该噬菌体噬菌谱广，能裂解8种气单胞菌，能更有效的解决水产养殖中出现的细菌病害感染问题，可作为用于防治水产动物维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌等气单胞菌病害的微生态制剂。

Description

一种防治水产动物气单胞菌病害的噬菌体及其应用
技术领域
本发明涉及水产防治技术领域，具体涉及一种防治水产动物气单胞菌病害的噬菌体及其应用。
背景技术
维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)，又称凡隆气单胞菌、维罗纳气单胞菌，弧菌科，气单胞菌属(Aeromonas)。该菌普遍存在于土壤以及水体环境中，存活能力强。近年来，维氏气单胞菌对水产养殖业危害越来越大，主要感染鲫鱼、鲤鱼、鲈鱼、罗非鱼、鲑鱼、青鱼、草鱼等淡水鱼类，被感染的鱼类呈现出血性败血症以及局部溃烂等症状，导致鱼类大量死亡，其危害日趋严重。目前我国对维氏气单胞菌病害的防治主要依赖于抗生素和一些药物，但抗生素滥用的现象已经非常严重，也带来了环境污染和“超级细菌”产生的问题，随着人们环保意识的提高以及可持续农业发展战略的实施，寻找环保、安全、有效的生物防治措施越来越被人们重视。
水产噬菌体微生态制剂具有对环境友好、对非靶标生物安全以及对水产病害具有特异性杀菌效果等优点，不同于抗生素和化学制剂，其是完全源于自然的绿色环保产品，广泛应用于水产养殖领域和食品安全领域，在养殖业中替代抗生素用于防病抗病、克服过量使用抗生素带来的致病菌耐药性问题，已成为当前生物技术研究的热点。然而，噬菌体对宿主有高度专一性，因此噬菌谱窄的噬菌体一般不能解决在水产养殖过程中出现的多种细菌病害感染问题。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此本发明提供了一种防治水产动物气单胞菌病害的噬菌体，该噬菌体噬菌谱广，能裂解8种气单胞菌，能更有效的解决水产养殖中出现的细菌病害感染问题，具有良好的应用前景。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种防治水产动物气单胞菌病害的噬菌体，所述噬菌体于2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2020414，分类命名为：Aeromonas veronii phage 05A034，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。根据本发明分离筛选得到的噬菌体05A034具有较广的噬菌谱，其能裂解8种气单胞菌(维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、鳗鱼气单胞菌、简氏气单胞菌、点状气单胞菌、顶盖气单胞菌、舒伯特气单胞菌)，能更有效的解决水产养殖中出现的细菌病害感染问题，具有良好的应用前景。
可选地，所述噬菌体具有4个特异性基因片段，其核酸序列如SEQ ID NO.1-4所示。由此，通过这4个特异性基因片段可作为识别该噬菌体的典型特征。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种微生态制剂，其包括上述的防治水产动物气单胞菌病害的噬菌体。根据本发明的实施例，该微生态制剂可用于防治水产动物维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌等气单胞菌病害。
可选地，所述噬菌体的有效价为3.5×1011pfu/mL。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明实施例的噬菌体05A034的噬菌斑图；
图2为根据本发明实施例的噬菌体05A034的透射电镜图；
图3为根据本发明实施例的噬菌体05A034在NCBI上BLAST比对结果；
图4为根据本发明实施例的4个特异性基因的PCR扩增产物电泳图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1噬菌体05A034的筛选和纯化
1、鲫鱼大红鳃病原菌维氏气单胞菌的分离
剪取江苏地区患大红鳃病的鲫鱼的鳃丝于无菌培养皿，取50mL75％酒精将鳃丝表面冲洗干净，置于无菌培养皿中切碎再用接种环蘸取血液，在气单胞菌鉴定培养基RYAN平板上划线，30℃下培养24h，挑取菌落，在同样的选择培养基上划线纯化，反复纯化3次，将形态一致的菌株用接种环挑取单菌落接入LB液体培养基中，30℃培养12h，取500μL菌液和500μL 40％甘油混合后置于-80℃冰箱保存。
2、维氏气单胞菌的扩大培养
宿主菌的扩大培养，配置LB液体培养基1L，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，采用如下两种接种方法，第一种接种方法是单菌落接种，在无菌条件下挑取保种平板上的单菌落接种，发酵温度为30℃，转速为150rpm，发酵时间12h；第二种接种方法是液体接种，加入10％培养基体积的浓度为108cfu/mL的维氏气单胞菌菌液至LB液体培养基中进行发酵，发酵温度为30℃，转速为150rpm，发酵时间12h。
3、噬菌体05A034的筛选
从福建省漳州、泉州、南平、三明等地25个养殖池塘采集水样，采用菌液水样混合富集法，将上述步骤2培养好的维氏气单胞菌菌液和水样分别取1L混合到一起，再加入1L新鲜LB液体培养基富集培养过夜，提取富集过后的液体，先12000rpm离心10min，再用0.22μm过滤膜过滤两次，通过涂布点样法筛选得到噬菌体。本申请的噬菌体05A034是从福建省漳州市鲫鱼池塘的水样中筛选获得。
4、噬菌体05A034的纯化
挑选单个噬菌斑(噬菌体05A034的噬菌斑图如图1所示)，放入1mL的SM缓冲液(Scientific Phygene公司产品)培养过夜，然后12000rpm离心10min，再用0.22μm过滤膜过滤两次，进行梯度稀释，稀释至10-6，先做一个仅加入100μL浓度为5.2×108cfu/mL宿主菌的双层板进行对照，每个稀释梯度各取宿主菌和噬菌体各100μL进行双层板混板，30℃恒温培养过夜并观察噬菌斑生长状况，挑选单个噬菌斑继续纯化3次。
5、噬菌体05A034的耐高温性测定
取6个装有200mL含量为6.3×1010pfu/mL噬菌体液05A034的三角瓶，分别放置在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的水浴锅，放置12h后通过双层板混板计算处理后的噬菌体含量来测定噬菌体05A034的耐高温性。结果如下表1所示：噬菌体05A034在70℃处理12h后依然能够存活，且含量依然较高，而一般噬菌体在60℃处理下都会大量死亡甚至全部死亡，因此，噬菌体05A034具有较强的耐高温性。
表1：噬菌体05A034的耐高温性测定
Figure BDA0002782903020000041
6、噬菌体05A034的耐酸碱性测定
取7个装有200mL含量为6.5×1010pfu/mL噬菌体液的三角瓶，通过滴加浓硫酸溶液和氢氧化钠溶液将噬菌体菌液的pH值分别调为4、5、6、7、8、9、10，放置12h后通过双层板混板计算处理后的噬菌体含量来测定噬菌体05A034的耐酸碱性。结果如表2所示：噬菌体05A034在pH值为5和10的处理下依然能够存活，且含量依然较高，而一般噬菌体在pH值为5和8的处理下都会大量死亡甚至全部死亡，说明噬菌体05A034具有一定的耐酸性和较强的耐碱性。
表2：噬菌体05A034的耐酸碱性测定
Figure BDA0002782903020000042
7、噬菌体05A034的形态学特征
将上述步骤4纯化好的噬菌体05A034在透射电镜下观察，结果如图2所示，所筛选的噬菌体表面较为光滑，头部呈近圆形，有一个尾部，噬菌体大小范围在128～213nm之间，平均大小为170.2±0.4nm。
实施例2
1、噬菌体05A034对维氏气单胞菌的最佳感染复数(MOI)测定
取8个100mL的新鲜LB液体培养基，分别进行处理。处理1同时加入1mL含量为106cfu/mL维氏气单胞菌菌液和1mL含量为109pfu/mL噬菌体液，处理2同时加入1mL含量为107cfu/mL维氏气单胞菌菌液和1mL含量为109pfu/mL噬菌体液，处理3同时加入1mL含量为108cfu/mL维氏气单胞菌菌液和1mL含量为109pfu/mL噬菌体液，处理4同时加入1mL含量为108cfu/mL维氏气单胞菌菌液和1mL含量为108pfu/mL噬菌体液，处理5同时加入1mL含量为108cfu/mL维氏气单胞菌菌液和1mL含量为107pfu/mL噬菌体液，处理6同时加入1mL含量为108cfu/mL维氏气单胞菌菌液和1mL含量为106pfu/mL噬菌体液，处理7同时加入1mL含量为108cfu/mL维氏气单胞菌菌液和1mL含量为105pfu/mL噬菌体液，处理8同时加入1mL含量为108cfu/mL维氏气单胞菌菌液和1mL含量为104pfu/mL噬菌体液，在30℃、150rpm条件下培养12h后测噬菌体效价。结果如表3所示：最佳感染复数为0.01时，噬菌体效价最高。
表3：噬菌体05A034对维氏气单胞菌最佳感染复数(MOI)测定
Figure BDA0002782903020000051
2、噬菌体05A034的扩大培养
对分离出来的噬菌体进行扩培：配置LB液体培养基1L，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，同时加入1mL含量为109cfu/mL维氏气单胞菌菌液和1mL含量为107pfu/mL噬菌体液，放置在温度为30℃，转速为150rpm的摇床培养12h后8000rpm离心10min，使得宿主菌沉降于底部，取上层澄清部分，所得液体即为扩大培养的噬菌体05A034。
3、噬菌体05A034微生态制剂的制备
配置LB液体培养基1L，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，同时加入1mL含量为109cfu/mL维氏气单胞菌菌液和1mL含量为107pfu/mL噬菌体液，放置在温度为30℃，转速为150rpm的摇床培养12h做为种子液，先接种到50L的发酵罐中，在30℃，转速为150rpm的发酵条件下培养12h后再接种到500L的发酵罐中，在30℃，转速为150rpm的发酵条件下培养12h，将所得的发酵液于8000rpm离心10min，使得宿主菌沉降于底部，取上层澄清部分，然后上清液用500nm、200nm陶瓷膜分级过滤即得噬菌体微生态制剂。
4、噬菌体05A034的含量测定
将噬菌体进行梯度稀释，稀释至10-10，先做一个仅加入100μL浓度为4.9×108cfu/mL维氏气单胞菌的双层板进行对照，从10-10浓度开始，各个浓度各取100μL噬菌体稀释液和100μL维氏气单胞菌液制作双层板混板，30℃恒温培养过夜，通过观察噬菌斑个数计算噬菌体含量。结果表明噬菌体含量为3.5×1011pfu/mL，含量高且对维氏气单胞菌侵染能力强。
表4：噬菌体05A034的含量测定
Figure BDA0002782903020000052
Figure BDA0002782903020000061
实施例3噬菌体05A034的裂解能力和防治效果
1、噬菌体05A034对维氏气单胞菌的裂解能力测定
将噬菌体05A034进行计数，分别稀释至1×108、1×107、1×106、1×105、1×104pfu/mL 5个浓度，以无菌水作为空白对照，每个浓度做三个平行。取6管培养好的维氏气单胞菌菌液，处理前通过稀释平板涂布法计算维氏气单胞菌含量后，分别加入1mL 5个浓度噬菌体液和无菌水，然后在30℃，150r/min条件下培养12h后，通过稀释平板涂布法计算维氏气单胞菌处理后含量来测定噬菌体05A034对维氏气单胞菌的裂解能力。结果表明，噬菌体05A034对维氏气单胞菌有较好的杀菌效果，且浓度越高，效果越好。
表5：噬菌体05A034对维氏气单胞菌的裂解能力测定
Figure BDA0002782903020000062
2、噬菌体05A034的宿主谱测定
培养噬菌体宿主菌05A034及其他同属的气单胞菌，共82株，其中包括维氏气单胞菌41株，嗜水气单胞菌14株，豚鼠气单胞菌5株，鳗鱼气单胞菌5株，简氏气单胞菌4株，点状气单胞菌6株，顶盖气单胞菌4株，舒伯特气单胞菌3株。在30℃，150r/min条件下培养12h后，通过直接点样法，取100μL浓度为3.8×108cfu/mL宿主菌液在LB平板上均匀涂布，再取20μL浓度为3.2×1010pfu/mL噬菌体液在平板上滴4点，30℃培养过夜，观察平板是否有透明噬菌斑，测定噬菌体05A034对82株气单胞菌是否有裂解能力。
结果如下表所示：噬菌体05A034能裂解82株气单胞菌中的36株气单胞菌，其中能裂解维氏气单胞菌20株，嗜水气单胞菌5株，豚鼠气单胞菌2株，鳗鱼气单胞菌2株，简氏气单胞菌1株，点状气单胞菌3株，顶盖气单胞菌2株，舒伯特气单胞菌1株。且相对于其他噬菌体，噬菌体05A034裂解能力更强，宿主谱更广。杨吉霞的“霍乱弧菌SWBC-a为靶细菌筛选宽裂解弧菌噬菌体”中对26株弧菌(副溶血弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌)做了侵染实验，发现噬菌体SWBC-a-3只能裂解其中的3株弧菌，黄至澄的“不动杆菌属噬菌体分离及其裂解谱分析”对76株不动杆菌做了侵染实验，发现噬菌体AB54只能裂解其中的8株不动杆菌，付汉清的“一株宽谱裂解性溶藻弧菌噬菌体ФV170的分离鉴定及生物学特性”中ФV170只能裂解7株溶藻弧菌。由此可知，本申请的噬菌体05A034裂解能力强，宿主谱广。
表6:噬菌体05A034的宿主谱
Figure BDA0002782903020000071
3、宽谱噬菌体05A034与噬菌谱窄的噬菌体对气单胞菌的防治效果测定
培养维氏气单胞菌液、嗜水气单胞菌液、简氏气单胞菌液、点状气单胞菌液，分别取500mL浓度为4.3×108cfu/mL上清液。培养只能裂解维氏气单胞菌的噬菌体05A017和05A021，分别取500mL浓度为3.2×1010pfu/mL噬菌体液。
取平均体重(1120.5±153.2)g的鲫鱼150条，分为5个处理组，每组三个重复，每个重复10条鲫鱼，放在玻璃鱼缸中(容量为300L)，加入250L水。处理A组为无处理的空白对照，处理B组加入制备好的维氏气单胞菌上清液、嗜水气单胞菌上清液、简氏气单胞菌上清液、点状气单胞菌上清液各100mL，处理C组同时加入制备好的维氏气单胞菌上清液、嗜水气单胞菌上清液、简氏气单胞菌上清液、点状气单胞菌上清液各100mL和100mL 05A017噬菌体液，处理D组同时加入制备好的维氏气单胞菌上清液、嗜水气单胞菌上清液、简氏气单胞菌上清液、点状气单胞菌上清液各100mL和100mL 05A021噬菌体液，处理E组同时加入制备好的维氏气单胞菌上清液、嗜水气单胞菌上清液、简氏气单胞菌上清液、点状气单胞菌上清液各100mL和100mL实施例2中的噬菌体05A034制剂，每天观察鲫鱼生长情况并记录各处理组死亡鲫鱼数。
宽谱噬菌体05A034与噬菌谱窄的噬菌体05A017和05A021对气单胞菌的防治效果见表7，处理A组无鲫鱼死亡；处理B组3d时鲫鱼死亡14条，平均死亡率为46.67％，7d后鲫鱼死亡29条，平均死亡率高达96.67％；处理C组3d时鲫鱼死亡8，平均死亡率为26.67％，7d后鲫鱼死亡17条，死亡率为56.67％；处理D组3d时鲫鱼死亡10，平均死亡率为33.33％，7d后鲫鱼死亡16条，死亡率为53.33％；处理E组3d时鲫鱼死亡1条，平均死亡率为3.33％，7d后鲫鱼死亡4条，死亡率仅为13.33％。通过对比，发现处理E死亡率比处理A降低了83.34％，比处理C降低了43.34％，比处理D降低了40％。结果表明：在实际运用中宽谱噬菌体05A034微生态制剂相对于噬菌谱窄的噬菌体05A017和05A021具有明显的优势，能显著降低鲫鱼的死亡率，降低水产养殖中气单胞菌带来的危害，且治疗效果更明显。
表7宽谱噬菌体05A034与噬菌谱窄的噬菌体对气单胞菌的防治效果测定
Figure BDA0002782903020000081
4、噬菌体05A034微生态制剂对维氏气单胞菌的防治效果测定
取平均体重(1120.5±153.2)g的鲫鱼120条，分为4个处理组，每组三个重复，每个重复10条鲫鱼，放在玻璃鱼缸中(容量为300L)，加入250L水。处理A组为无处理的空白对照，处理B组加入100mL制备好的维氏气单胞菌上清液，处理C组同时加入100mL制备好的维氏气单胞菌上清液和100mL实施例2中的噬菌体05A034制剂，处理D组加入100mL噬菌体05A034制剂，每天观察鲫鱼生长情况并记录各处理组死亡鲫鱼数。
噬菌体05A034制剂对鲫鱼维氏气单胞菌病害防治效果见表8，处理A组和处理D组无鲫鱼死亡；处理B组3d时鲫鱼死亡13条，平均死亡率为43.33％，7d后鲫鱼死亡28条，平均死亡率高达93.33％；处理C组3d时未有鲫鱼死亡，7d后鲫鱼死亡2条，死亡率仅为6.67％，死亡率降低了86.66％。结果表明：噬菌体05A034微生态制剂对鲫鱼生长未有影响，且对鲫鱼维氏气单胞菌病害有明显的防治效果。
表8：噬菌体05A034微生态制剂对鲫鱼维氏气单胞菌病害防治效果
Figure BDA0002782903020000082
Figure BDA0002782903020000091
实施例4噬菌体05A034全基因组测定和分析
1、噬菌体05A034的纯化
将噬菌体2mL，8000rpm离心10min，取上清液用0.22μm过滤膜过滤两次后放置于4℃冰箱保存。
2、噬菌体05A034基因组DNA的提取
使用天根生化科技(北京)有限公司的噬菌体基因组DNA/RNA提取试剂盒将分离纯化的噬菌体进行噬菌体基因组DNA的提取，并送至美吉生物(上海)股份有限公司进行测序。
3、噬菌体05A034全基因组序列分析
经Pacbio平台的第三代基因组测序，所筛选的噬菌体05A034全基因组序列全长为61504bp，为环状双链DNA。基因组序列在NCBI官网进行BLAST比对，结果如图3所示，与最接近的气单胞菌噬菌体(GeneBank登录号：MK838113.1)基因组序列比对覆盖率为87％，同源性为88.92％；其次，与气单胞菌噬菌体(GeneBank登录号：MN317029.1)基因组序列的比对覆盖率为78％，同源性为79.11％。由此可见，所筛选的噬菌体是一种新的噬菌体。噬菌体05A034已于2020年8月10日保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2020414。
通过DNAMAN 7软件找出噬菌体05A034基因组与两个同源性最高的噬菌体基因组序列的差异性片段，获得特异性基因C1(SEQ ID NO.1)、C2(SEQ ID NO.2)、C3(SEQ IDNO.3)、C4(SEQ ID NO.4)；再通过Primer Premier6软件，设计特异性PCR扩增引物，并送至博尚生物技术(上海)有限公司合成引物，结果如图4所示。
其中，特异性PCR扩增引物为：
C1F:5’-CGCCTATTCGGTCCATTG-3’；
C1R:5’-GTCGCTTGTCAGTTCGTAT-3’；
C2F:5’-AGTAATCTGGCGGTCTCA-3’；
C2R:5’-TATCGTCTCTGGCGGTTA-3’；
C3F:5’-ACGACATAGAGACCTACATATC-3’；
C3R:5’-ACGCTGGAACATCTTAACC-3’；
C4F:5’-GAGATGGCGGTGAATGAC-3’；
C4R:5’-CGGAACGGCTTGGAATAG-3’。
综上，根据本发明的实施例，本发明从福建省漳州地区的鲫鱼池塘分离筛选出噬菌体05A034，其对维氏气单胞菌具有很高的杀菌活性，同时对其他气单胞菌也有较广的噬菌谱，其能裂解8种气单胞菌，能更有效的解决水产养殖中出现的细菌病害感染问题。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 厦门昶科生物工程有限公司
<120> 一种防治水产动物气单胞菌病害的噬菌体及其应用
<130> 无
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 374
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcctattcg gtccattggc ttttcggcct gggattgtcg tttgtgattg ccgccgctat 60
cggcgatcac tctaccggta aaaatgtgaa ggggttcaac catgcaaaac acaactgaga 120
tcaaaacctt ccgcgtgacc tggtcgatag acctggaagg caccagcgcc gagcaagtag 180
ccgccctggc cgcccgtgac tacttgcaag ccgggcacac tgccacggtg ttagacgtcg 240
cccagccctg gggggactct ggtttgtact ccccgccggt ttccgttgac gtcggacaac 300
tgcccatagc ccggcctgat aacgcgctcg atctgctagg ccaggacctg gaggaatacg 360
aactgacaag cgac 374
<210> 2
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtaatctgg cggtctcaat acggacaacg gggtaacatg gcatcgctag acgatgaatt 60
gcgggaacgg caactcgcag ccaaggcgaa caggatgcgg ccgaaacaag tggccgacct 120
attccgggta tccagggtga ctatctacag ctggctaatg acgataatgc tgggttcccc 180
aagccgaagc ggtataaccg gcgacacata ttctggtatg agtccgagct ccgagagtgg 240
gccgagcaaa agggatatga cttaacaccg cttcactaac cgccagagac gata 294
<210> 3
<211> 308
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgacataga gacctacata tcccggatgc accataacga cttgccgccg ctgctgagca 60
aggagttttg gaacgggaag aaggccaaac aggactacga gctgcgcgct ggggacctat 120
ggccgacgga gaaggtccag gagacggtat ccgcggcatt caaggacatt cgcatgtcca 180
tcctcctgtt ccgggacggc cttactcgcg atacggtgct gaccgacgag caggatgcca 240
agttgcaggc gatgatcgat ggcctactga acgatatggc gaataacctg gttaagatgt 300
tccagcgt 308
<210> 4
<211> 383
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagatggcgg tgaatgactt catcctggag gttatccgcc acatcgacgc cgtgcgctac 60
gaagacccgg agaccggcct ccaggagatc aagctgatcc gtccggacta tgacgtggcc 120
accttgccgg tgctgactcc gtcaaactgc cgcatcgagc agctgaccgc ccccacgctg 180
tatgacctgg tcaaccaggt gacggtcgag ttttggaaca gggacaccgg ggaggattca 240
gccgtcgcag tccaggacac ggcatctatc aacatgtccg ggaccatcaa caaccagacg 300
atgcagtatt ccggcatctg ctcgaccgaa gtcgcgctga tggtgggtca gcgggatctc 360
gcgcgctatt ccaagccgtt ccg 383

Claims (4)

1.一种防治水产动物气单胞菌病害的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体于2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020414。
2.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体具有4个特异性基因片段，其核酸序列如SEQ ID NO.1-4所示。
3.一种微生态制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的防治水产动物气单胞菌病害的噬菌体。
4.如权利要求3所述的微生态制剂，其特征在于，所述噬菌体的有效价为3.5×1011pfu/mL。
CN202011287731.0A 2020-11-17 2020-11-17 一种防治水产动物气单胞菌病害的噬菌体及微生态制剂 Active CN112574959B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011287731.0A CN112574959B (zh) 2020-11-17 2020-11-17 一种防治水产动物气单胞菌病害的噬菌体及微生态制剂

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011287731.0A CN112574959B (zh) 2020-11-17 2020-11-17 一种防治水产动物气单胞菌病害的噬菌体及微生态制剂

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112574959A true CN112574959A (zh) 2021-03-30
CN112574959B CN112574959B (zh) 2022-05-24

Family

ID=75122709

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011287731.0A Active CN112574959B (zh) 2020-11-17 2020-11-17 一种防治水产动物气单胞菌病害的噬菌体及微生态制剂

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112574959B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891754A (zh) * 2022-04-12 2022-08-12 集美大学 一株鱼类致病气单胞菌噬菌体φA008及其应用
CN118222518A (zh) * 2024-03-22 2024-06-21 武汉格瑞农生物科技有限公司 一株具备多价性及高发酵率的豚鼠气单胞菌噬菌体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9806799D0 (en) * 1998-03-31 1998-05-27 Smirthwaite Martin The production use and treatment using phage technology in aquacluture and like
CN108103031A (zh) * 2018-01-10 2018-06-01 浙江省淡水水产研究所 一种水产养殖用宽谱噬菌体制剂及其制备方法
CN109310721A (zh) * 2016-04-03 2019-02-05 蛋白制药公司 噬菌体菌株及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9806799D0 (en) * 1998-03-31 1998-05-27 Smirthwaite Martin The production use and treatment using phage technology in aquacluture and like
CN109310721A (zh) * 2016-04-03 2019-02-05 蛋白制药公司 噬菌体菌株及其应用
CN108103031A (zh) * 2018-01-10 2018-06-01 浙江省淡水水产研究所 一种水产养殖用宽谱噬菌体制剂及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
I.S. SUREKHAMOL 等: "Isolation and characterization of broad spectrum bacteriophages lytic to Vibrio harveyi from shrimp farms of Kerala, India", 《LETTERS IN APPLIED MICROBIOLOGY》 *
X LUO 等: "Characterization of bacteriophage HN48 and its protective effects in Nile tilapia Oreochromis niloticus against Streptococcus agalactiae infections", 《JOURNAL OF FISH DISEASES》 *
吕孙建 等: "宽谱噬菌体NTHP01的生理特征及噬菌作用", 《江苏农业科学》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891754A (zh) * 2022-04-12 2022-08-12 集美大学 一株鱼类致病气单胞菌噬菌体φA008及其应用
CN114891754B (zh) * 2022-04-12 2023-11-17 集美大学 一株鱼类致病气单胞菌噬菌体φA008及其应用
CN118222518A (zh) * 2024-03-22 2024-06-21 武汉格瑞农生物科技有限公司 一株具备多价性及高发酵率的豚鼠气单胞菌噬菌体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112574959B (zh) 2022-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107686832B (zh) 新的副溶血性弧菌噬菌体及其组合物、制备方法和应用
CN109825479A (zh) 一种宽谱沙门氏菌噬菌体lpstll及应用
CN108103031B (zh) 一种水产养殖用宽谱噬菌体制剂及其制备方法
CN115717128A (zh) 一种防治水产动物弧菌病害的霍乱弧菌噬菌体及其应用
CN115786277A (zh) 一种防治水产动物弧菌病害的新型噬菌体及其应用
CN112574959B (zh) 一种防治水产动物气单胞菌病害的噬菌体及微生态制剂
CN107805630B (zh) 副溶血弧菌噬菌体及包含该噬菌体的杀菌组合物
CN114561363B (zh) 一种具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体PC-Liy1、制备方法及应用
CN114717199B (zh) 一株不具转导耐药基因能力的沙门菌噬菌体ckt1及其应用
CN108699533B (zh) 副溶血弧菌噬菌体Vib-PAP-1及其用于抑制副溶血弧菌增殖的用途
CN107805629B (zh) 溶藻弧菌噬菌体及包含该噬菌体的杀菌组合物
CN114045268A (zh) 一种防治植保青枯雷尔氏菌、青枯假单胞菌病害的噬菌体及其应用
CN113293143B (zh) 一株可降低鸡白痢沙门氏菌垂直传播的沙门氏菌噬菌体及其应用
CN113583966B (zh) 一株烈性沙门氏菌噬菌体及其应用
CN118086224A (zh) 一种具有裂解谱多价性的副溶血弧菌噬菌体及其在海参养殖的应用
CN109666652B (zh) 一株宽宿主谱美人鱼发光杆菌噬菌体及其应用
CN110317793B (zh) 一种主效成分为噬菌体lpee17和lpek22的混合制剂及应用
CN117070472A (zh) 一株针对高致病性弧菌及耐药弧菌的副溶血弧菌噬菌体及应用
CN117070471A (zh) 一株可口服进入血液的多价沙门氏菌噬菌体及其应用
CN116042541A (zh) 一种溶藻弧菌噬菌体grnrz-p25及其应用
CN116676272A (zh) 一种噬菌体及其应用、引物序列和微生态制剂
CN107904211B (zh) 副溶血弧菌噬菌体及包含该噬菌体的杀菌组合物
CN116286520A (zh) 一株植物乳杆菌e2及其在防治大黄鱼内脏白点病中的应用
CN114703149A (zh) 一株高发酵率、抑菌持久的溶藻弧菌噬菌体gva-p21及其应用
CN114196637A (zh) 一种沙门氏菌噬菌体（salmonella sp.phage）JNwz02及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant