CN112557547B - 用于测定氨甲苯酸冻干制剂体内行为的方法 - Google Patents

用于测定氨甲苯酸冻干制剂体内行为的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112557547B
CN112557547B CN202011511239.7A CN202011511239A CN112557547B CN 112557547 B CN112557547 B CN 112557547B CN 202011511239 A CN202011511239 A CN 202011511239A CN 112557547 B CN112557547 B CN 112557547B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
aminomethylbenzoic acid
acid
internal standard
injection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011511239.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112557547A (zh
Inventor
满春兰
宋晓燕
李明慧
黄楠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANDONG PKU HIGH-TECH HUATAI PHARMACEUTICAL CO LTD
Original Assignee
SHANDONG PKU HIGH-TECH HUATAI PHARMACEUTICAL CO LTD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANDONG PKU HIGH-TECH HUATAI PHARMACEUTICAL CO LTD filed Critical SHANDONG PKU HIGH-TECH HUATAI PHARMACEUTICAL CO LTD
Priority to CN202011511239.7A priority Critical patent/CN112557547B/zh
Publication of CN112557547A publication Critical patent/CN112557547A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112557547B publication Critical patent/CN112557547B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/24—Automatic injection systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/045—Standards internal
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/047—Standards external

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Library & Information Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及用于测定氨甲苯酸冻干制剂体内行为的方法。具体涉及测定生物体人的生物样品尿液中的氨甲苯酸含量的方法，包括如下步骤：提供高效液相色谱系统；采集自被施用药剂前以及施用药剂后的生物体的空白生物样品和含药生物样品，并对所述含药生物样品进行处理制成用于液相色谱测定的供试液；在色谱系统中测定所述测试用溶液和供试液，并据此测定结果计算生物样品中的氨甲苯酸含量。所述药剂包含氨甲苯酸和冻干赋形剂；所述药剂是氨苯甲酸的冻干粉针剂；所述冻干赋形剂选自蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖、山梨醇、甘氨酸、右旋糖酐。本发明方法为评价氨甲苯酸制剂的体内行为提供了一种有效的工具，可用于考察制剂在受试者体内的药动学行为。

Description

用于测定氨甲苯酸冻干制剂体内行为的方法
技术领域
本发明属医药技术领域，涉及一种可用于因原发性纤维蛋白溶解过度所引起的出血，包括急性和慢性、局限性或全身性的高纤溶出血，后者常见于癌肿、白血病、妇产科意外、严重肝病出血等的冻干粉针剂药物组合物，特别是涉及一种包含氨甲苯酸的冻干粉针剂药物组合物，本发明还涉及一种可靠的方法用以测定生物体例如人或大鼠给予上述包含氨甲苯酸的冻干粉针剂药物组合物后生物样品例如血、尿等中的上述氨甲苯酸的含量，进而为评估氨甲苯酸的治疗效果或其体内行为提供依据。本发明的冻干粉针剂药物组合物以及它们的检测方法包括生物样品测定方法具有期望的良好性质，例如本发明测定生物样品中的氨甲苯酸的方法准确、可靠、稳定。
背景技术
氨甲苯酸(Aminomethylbenzoic Acid)，为对氨甲基苯甲酸一水合物，又名抗血纤溶芳酸、对羧基苄胺、4-(氨基甲基)苯甲酸、4-氨甲基苯甲酸、对氨甲基苯甲酸；4-(Aminometmyl)benzoic acid、4-(Aminomethyl)benzoic acid，CAS号56-91-7。适用于肺、肝、胰、前列腺、甲状腺、肾上腺等手术时的异常出血，妇产科和产后出血及肺结核咯血、痰中带血、血尿，前列腺肥大出血、上消化道出血等。氨甲苯酸的分子式为C8H9NO2·H2O，分子量为169.18，其化学结构式为：
Figure BDA0002846467590000011
氨甲苯酸为白色或类白色的鳞片状结晶或结晶性粉末；无臭，味微苦。氨甲苯酸在沸水中溶解，在水中略溶，在乙醇、氯仿、乙醚或苯中几乎不溶。
氨甲苯酸为氨甲苯酸类抗纤维蛋白溶解药。具有与6-氨基乙酸、氨甲环酸相同的作用机理。其立体构形与赖氨酸相似，能竞争性地抑制纤溶酶与纤维蛋白的吸附，保护纤维蛋白，使其不被纤溶酶降解，从而达到止血作用。其抗纤溶活性比6-氨基已酸强4-5倍。氨甲苯酸为促凝血药。血循环中存在各种纤溶酶(原)的天然拮抗物，如抗纤溶酶素等。正常情况下，血液中抗纤溶物质活性比纤溶物质活性高很多倍，所以不致发生纤溶性出血。但这些拮抗物不能阻滞已吸附在纤维蛋白网上的激活物(如尿激酶等)所激活而形成纤溶酶。纤溶酶是一种肽链内切酶，在中性环境中能裂解纤维蛋白(原)的精氨酸和赖氨酸肽链，形成纤维蛋白降解产物，并引起凝血块溶解出血。纤溶酶原通过其分子结构中的赖氨酸结合部位而特异性地吸附在纤维蛋白上，赖氨酸则可以竞争性地阻抑这种吸附作用，减少纤溶酶原的吸附率，从而减少纤溶酶原的激活程度，以减少出血。本品的立体构型与赖氨酸(1,5-二氨基己酸)相似，能竞争性阻抑纤溶酶原吸附在纤维蛋白网上，从而防止其激活，保护纤维蛋白不被纤溶酶降解而达到止血作用。
氨甲苯酸静注后有效血药浓度可维持3-5小时。服药24小时，36％±5％以原形随尿排出，静注则排出63％±17％，其余为乙酰化衍生物。氨甲苯酸口服后胃肠道吸收率为69％士2％。体内分布浓度依次为肾>肝>心>脾>肺>血液等。服药后3小时血药浓度即达峰值，口服按体重7.5mg/kg，峰值一般为4～5ug/ml。口服8小时血药浓度已降到很低水平；静注后有效血药浓度可维恃3～5小时。服药24小时，36％±5％以原形随尿排出，静注则排出63％±17％，其余为乙酰化衍生物。
本申请人的发明专利ZL201510150322.9公开了一种注射用氨甲苯酸冷冻干燥粉针剂药物组合物，包含氨甲苯酸、冻干赋形剂例如甘露醇、和任选的酸碱调节剂。尤其是该粉针剂中包含适量右旋糖酐是有利的。所述冻干赋形剂选自蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖、山梨醇、甘氨酸，氨甲苯酸与冻干赋形剂的重量比为100：50～500。该发明注射用氨甲苯酸冷冻干燥粉针剂可用于因原发性纤维蛋白溶解过度所引起的出血，包括急性和慢性、局限性或全身性的高纤溶出血，后者常见于癌肿、白血病、妇产科意外、严重肝病出血等，并且具有令人期待的良好性质。
药物施用到体内以后，对生物样品例如血液或尿液中的活性物质浓度变化进行监测，是本领域的一项重要工作。
因此，本领域技术人员仍然期待为临床提供具有良好性能的氨甲苯酸制剂例如其粉针剂例如包含右旋糖酐的注射用氨甲苯酸冷冻干燥粉针剂在施用到体内以后，对生物样品例如血液或尿液中的活性物质浓度变化进行监测的方法。或者本领域技术人员期待提供一种可靠的方法用以测定生物体例如人或大鼠给予上述包含氨甲苯酸的冻干粉针剂药物组合物后生物样品例如血、尿等中的上述氨甲苯酸的含量，进而为评估氨甲苯酸的治疗效果或其体内行为提供依据，例如期望这些测定生物样品中的氨甲苯酸的方法准确、可靠、稳定。
发明内容
本发明目的在于提供一种具有某些/某种良好性质的包含氨甲苯酸的冻干粉针剂，期待其具有一种或多种良好的药学性能。本发明人令人意外地发现，具有特定配方的包含氨甲苯酸的冻干粉针剂具有令人期望的良好特征。或者，本发明的另一方面的目的在于为临床提供具有良好性能的氨甲苯酸制剂例如其粉针剂例如包含右旋糖酐的注射用氨甲苯酸冷冻干燥粉针剂在施用到体内以后，对生物样品例如血液或尿液中的活性物质浓度变化进行监测的方法；或者本发明另一方面的目的在于提供一种可靠的方法用以测定生物体例如人或大鼠给予上述包含氨甲苯酸的冻干粉针剂药物组合物后生物样品例如血、尿等中的上述氨甲苯酸的含量，进而为评估氨甲苯酸的治疗效果或其体内行为提供依据。本发明人令人意外地发现，本发明测定生物样品中的活性物质浓度的方法呈现令人期望的效果，例如本发明测定生物样品中的氨甲苯酸的方法准确、可靠、稳定。本发明因此而得以完成。
在本发明中，在制备组合物时，对活性成分氨甲苯酸计量，均是以对氨甲基苯甲酸一水合物即C8H9NO2·H2O计。
因此，本发明第一方面提供了一种冻干粉针剂，其中包含氨甲苯酸和冻干赋形剂。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中所述冻干赋形剂选自蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖、山梨醇、甘氨酸。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中氨甲苯酸与冻干赋形剂的重量比为100：50～500。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中氨甲苯酸与冻干赋形剂的重量比为100：50～250。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中氨甲苯酸与冻干赋形剂的重量比为100：50～200。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中氨甲苯酸与冻干赋形剂的重量比为100：50～150。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中还包含酸碱调节剂。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中所述的酸碱调节剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、盐酸、磷酸、硝酸、硫酸、或其组合。在一个实施方案中，所述的酸碱调节剂是盐酸溶液或者氢氧化钠溶液，例如1M盐酸溶液或者1M氢氧化钠溶液。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中所述酸碱调节剂的用量是，使该冻干粉针剂用注射用水溶解成含氨甲苯酸以氨甲苯酸计浓度为10mg/ml的溶液时，该溶液的pH值在3.0～5.0范围内的量，例如该溶液的pH值在3.5～4.5范围内的量。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中还包含右旋糖酐。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中所述右旋糖酐选自右旋糖酐-20、右旋糖酐-40、右旋糖酐-70。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中氨甲苯酸与右旋糖酐的重量比为100：1～25。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中氨甲苯酸与右旋糖酐的重量比为200：2～20。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中氨甲苯酸与右旋糖酐的重量比为200：2～10。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中包含：氨甲苯酸100重量份、甘露醇50～200重量份、右旋糖酐2～10重量份、酸碱调节剂；所述右旋糖酐选自右旋糖酐-20、右旋糖酐-40、右旋糖酐-70；所述酸碱调节剂的用量是，使该冻干粉针剂用注射用水溶解成氨甲苯酸浓度为10mg/ml的溶液时，该溶液的pH值在3.0～5.0范围内的量；所述的酸碱调节剂是盐酸溶液或者氢氧化钠溶液。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中氨甲苯酸与甘露醇的重量比为100：50～150。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，所述酸碱调节剂是1M盐酸溶液或者1M氢氧化钠溶液。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，所述酸碱调节剂的用量是，使该冻干粉针剂用注射用水溶解成氨甲苯酸浓度为10mg/ml的溶液时，该溶液的pH值在3.5～4.5范围内的量。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其是按包括如下的步骤制备的：
(a)称取处方量的氨甲苯酸、甘露醇和右旋糖酐，加入适量注射用水，使溶解，再加入活性炭，搅拌，过滤脱炭；
(b)补加注射用水至其处方量，搅拌均匀，测定溶液pH值和任选的测定活性成分含量，根据药液pH值的偏离情况用酸碱调节剂调节至pH3.0～5.0；
(c)将药液除菌过滤，灌装于西林瓶中；
(d)冷冻干燥除去水分，压塞，即得，
其中，步骤(a)所述适量注射用水是注射用水处方量的70～90％，步骤(b)中“补加注射用水至其处方量”中的所述“处方量”的注射用水是氨甲苯酸重量的20-75倍。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中步骤(a)所述活性炭用量是溶液重量的0.02％～0.2％。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，步骤(b)中“补加注射用水至其处方量”中的所述“处方量”的注射用水是氨甲苯酸重量的30-60倍。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，步骤(c)所得经过滤的滤液，其中固形物含量为2～15％(w/v)。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，步骤(c)所得经过滤的滤液，其中固形物含量为2～10％(w/v)。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，步骤(d)中除去水分后所得冷冻干燥物料中水分含量低于5％。
已经如ZL201510150322.9中出人意料地发现的，当在粉针剂使用甘露醇并且添加微量的右旋糖酐时，可以显著地在配液过程中除去原料中夹带的未知的RRT1.7杂质。
众所周知，经低温冷冻-真空干燥而获得的冷冻干燥粉针剂(通常简称为冻干粉针剂或冻干粉针)，其是首先将各物料用溶剂溶解(通常而言是用水溶解)，配制成一溶液，然后使该溶液进行低温冷冻，再进行抽真空、升华、干燥而获得的一种基本无水(通常而言水含量低于5％，特别是通常低于3％)的粉末状物或块状物。因此，该固体冻干物的酸碱度通常通过配制过程调节溶液的pH值来控制；或者可以通过处方调整以使获得的固体冻干物在规定的溶解/稀释程度下控制该溶解/稀释液的pH值来控制(此称为控制固体冻干物的酸碱度)；后一方式通常更为普遍使用，例如药典中所载的诸多冻干粉针剂均以此方式控制制品的酸碱度，而这种方式控制产品的酸碱度通常可以不具体规定酸碱调节剂的处方量，而仅规定终产品的酸碱度即可。同样适用于本发明的是，根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中所述任选的酸碱调节剂的量是，使所制得的冻干粉针剂用注射用水溶解成含氨甲苯酸以氨甲苯酸计浓度为10mg/ml的溶液时，该溶液的pH值在3.0～5.0范围内的量，例如该溶液的pH值在3.5～4.5范围内的量。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其基本上是按包括如下的步骤制备的：
(a)称取处方量的氨甲苯酸和冻干赋形剂以及任选的右旋糖酐，加入适量注射用水，使溶解，再加入活性炭，搅拌，过滤脱炭；
(b)补加注射用水至其处方量，搅拌均匀，测定溶液pH值和任选的测定活性成分含量，根据药液pH值的偏离情况用酸碱调节剂调节至pH3.0～5.0，优选pH3.5～4.5；
(c)将药液除菌过滤，灌装于西林瓶中；
(d)冷冻干燥除去水分，压塞，即得。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中步骤(a)所述适量注射用水是注射用水处方量的约70～90％。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中步骤(a)所述活性炭用量是溶液重量的0.02％～0.5％(w/v)，优选0.02％～0.2％。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中步骤(b)中“补加注射用水至其处方量”中的所述“处方量”的注射用水是氨甲苯酸重量的10-100倍，例如20-75倍，例如约30-60倍。此注射用水的量可通过步骤(c)中所述固形物含量而容易地控制。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中步骤(b)中所述酸碱调节剂是选自下列的酸碱调节剂的水溶液：氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、盐酸、磷酸、硝酸、硫酸、或其组合。这些水溶液的浓度是本领域技术人员公知的，例如1～10％，例如2％～5％。在一个实施方案中，所述的酸碱调节剂是盐酸溶液或者氢氧化钠溶液，例如1M盐酸溶液或者1M氢氧化钠溶液。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中步骤(c)所得经过滤的滤液，其中固形物含量是为2～20％(w/v)，优选2～15％(w/v)，再更优选2～10％。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂，其中步骤(d)中除去水分后所得冷冻干燥物料中水分含量低于10％，优选低于8％，优选低于5％，更优选低于3％。
进一步地，本发明第二方面提供了制备本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂的方法，其基本上包括以下步骤：
(a)称取处方量的氨甲苯酸和冻干赋形剂以及任选的右旋糖酐，加入适量注射用水，使溶解，再加入活性炭，搅拌，过滤脱炭；
(b)补加注射用水至其处方量，搅拌均匀，测定溶液pH值和任选的测定活性成分含量，根据药液pH值的偏离情况用酸碱调节剂调节至pH3.0～5.0，优选pH3.5～4.5；
(c)将药液除菌过滤，灌装于西林瓶中；
(d)冷冻干燥除去水分，压塞，即得。
根据本发明第二方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(a)所述适量注射用水是注射用水处方量的约70～90％。
根据本发明第二方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(a)所述活性炭用量是溶液重量的0.02％～0.5％(w/v)，优选0.02％～0.2％。
根据本发明第二方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(b)中“补加注射用水至其处方量”中的所述“处方量”的注射用水是氨甲苯酸重量的10-100倍，例如20-75倍，例如约30-60倍。此注射用水的量可通过步骤(c)中所述固形物含量而容易地控制。
根据本发明第二方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(b)中所述酸碱调节剂是选自下列的酸碱调节剂的水溶液：氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、盐酸、磷酸、硝酸、硫酸、或其组合。这些水溶液的浓度是本领域技术人员公知的，例如1～10％，例如2％～5％。在一个实施方案中，所述的酸碱调节剂是盐酸溶液或者氢氧化钠溶液，例如1M盐酸溶液或者1M氢氧化钠溶液。
根据本发明第二方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(c)所得经过滤的滤液，其中固形物含量是为2～20％(w/v)，优选2～15％(w/v)，再更优选2～10％。
根据本发明第二方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(d)中除去水分后所得冷冻干燥物料中水分含量低于10％，优选低于8％，优选低于5％，更优选低于3％。
进一步的，本发明第三方面提供了测定生物体的生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，该方法包括如下步骤：
(i)提供测定用的高效液相色谱系统；
(ii)提供空白生物样品和含药(即氨苯甲酸)生物样品，所述生物样品采集自被施用药剂前以及施用药剂后的生物体；
(iii)制备测试用溶液，并对所述含药生物样品进行处理制成用于液相色谱测定的供试液；
(iv)在高效液相色谱系统中测定所述测试用溶液和供试液，并据此测定结果计算生物样品中的氨甲苯酸含量。
根据本发明第三方面的方法，其中所述生物体是人或大鼠。
根据本发明第三方面的方法，其中所述生物体是人。
根据本发明第三方面的方法，其中所述生物样品是血液或尿液。
根据本发明第三方面的方法，其中所述生物样品是血清。
根据本发明第三方面的方法，其中所述药剂是氨苯甲酸的冻干粉针剂。例如是本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(i)中，所述高效液相色谱系统包括：
液相色谱系统：Agilent 1200二元梯度泵和CTC自动进样器；
液相色谱分析柱为ProteColTM-P C18 HQ105柱(例如规格为5μm，250×4.6mmI.D.，例如为SGE Analytical Science的产品)；
流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液(20：80)，流速1ml/min；柱温40℃；检测波长为230nm；进样体积20μl；和/或
磷酸盐缓冲液的配制：取磷酸氢二钠12.0g，庚烷磺酸钠0.8g，加水900ml使溶解，用磷酸调节pH值至2.5，加水至1000ml，摇匀，作为磷酸盐缓冲液。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(ii)中，
所述空白生物样品是采集自被施用药剂前的生物体；
所述空白生物样品是采集自被施用药剂前的生物体并进一步处理以获得呈血清形式的空白生物样品；和/或
所述含药生物样品是采集自被施用药剂后的生物体并进一步处理以获得呈血清形式的含药生物样品。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(iii)之所述制备测试用溶液中：
制备内标储备液：精密称取内标对照品适量，用配液溶剂溶解制成内标储备液(例如其浓度可以为1～50μg/mL，例如为10～50μg/mL，例如为20μg/mL)；
制备对照品储备液：精密称取氨甲苯酸对照品适量，用配液溶剂溶解制成对照品储备液(例如其浓度可以为1～50μg/mL，例如为10～50μg/mL，例如为20μg/mL)；
制备对照液：精密量取空白血清0.5mL于2mL量瓶中，精密加入对照品储备液和内标储备液适量，加配液溶剂适量，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得对照液(其中的氨甲苯酸和内标物浓度各自独立地为0.1～20μg/mL，例如各自独立地为0.5～10μg/mL，例如各自独立地为0.5～5μg/mL，例如约为2μg/mL)；
制备质控液：精密量取空白血清0.5mL于2mL量瓶中，精密加入对照品储备液适量(例如10～500μL，例如10～200μL，例如10μL、50μL、或200μL)、内标储备液(例如50～500μL，例如100～400μL，例如200μL)和配液溶剂适量，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，得到质控液(其中的氨甲苯酸和内标物浓度各自独立地为0.1～20μg/mL，例如各自独立地为0.1～10μg/mL，例如各自独立地为0.1～5μg/mL，例如各自独立地为0.1～2μg/mL)；和/或
制备空白血清液：精密量取空白血清0.5mL于2mL量瓶中，加配液溶剂1.2mL，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得空白血清液。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(iii)之对所述含药生物样品进行处理制成用于液相色谱测定的供试液中：
制备供试液：精密量取待测的含药血清0.5mL于2mL量瓶中，精密加入内标储备液0.2mL和配液溶剂1.0mL，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得含药并添加内标的供试液。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(iii)中，所述内标为对甲基苯甲酸。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(iii)中，所述配液溶剂是包含0.25％甲酸和0.12％氯化镁的乙腈溶液。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(iv)中，测定所述测试用溶液时，任选地对方法的下述任一项或多项进行测定：专属性、线性、灵敏度、准确度、精密度、稳定性、色谱残留。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(iv)中，测定方法的专属性中，氨甲苯酸与内标的分离度大于5。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(iv)中，测定方法的线性中，所得标准曲线的相关系数r大于0.99。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(iv)中，测定方法的灵敏度中，检测限小于0.05μg/mL，定量限小于0.1μg/mL。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(iv)中，测定方法的准确度中，相对回收率和绝对回收率各自独立地大于90％，例如大于95％。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(iv)中，测定方法的精密度中，日内精密度和日间精密度各自独立地小于10％，例如小于5％。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(iv)中，测定方法的稳定性中，实测浓度相当于理论浓度的百分数即相对百分浓度大于90％，例如在90～110％范围。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(iv)中，测定方法的色谱残留中，空白血清液中待测物响应值低于质控液中待测物响应值的2％，例如低于1％。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(iv)中，从测定供试液所得色谱图中读取氨甲苯酸和内标的峰面积，依据标准曲线和含药生物样品稀释倍数，计算生物样品中的氨甲苯酸含量。
根据本发明第三方面的方法，其包括如下操作及条件：
液相色谱系统：Agilent 1200二元梯度泵和CTC自动进样器；
液相色谱分析柱为ProteColTM-P C18 HQ105柱(5μm，250×4.6mm I.D.，SGEAnalytical Science)；
注射用氨甲苯酸粉针剂、氨甲苯酸对照品、对甲基苯甲酸对照品；
空白生物样品和含药生物样品：采集自被施用注射用氨甲苯酸粉针剂前的健康志愿者血液并进一步处理所得血清作为空白生物样品，采集自被施用注射用氨甲苯酸粉针剂后的健康志愿者血液并进一步处理所得血清作为含药生物样品；
流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液(20：80)，流速1ml/min；柱温40℃；检测波长为230nm；进样体积20μl；
磷酸盐缓冲液的配制：取磷酸氢二钠12.0g，庚烷磺酸钠0.8g，加水900ml使溶解，用磷酸调节pH值至2.5，加水至1000ml，摇匀，作为磷酸盐缓冲液；
精密称取内标对照品10.04mg于100mL量瓶中，用配液溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2mL置10mL量瓶中，用配液溶剂稀释至刻度，摇匀，即得内标储备液(浓度为20.08μg/mL)；
精密称取氨甲苯酸对照品10.12mg于100mL量瓶中，用配液溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL置10mL量瓶中，用配液溶剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液(浓度为20.24μg/mL)；
精密量取空白血清0.5mL于2mL量瓶中，精密加入对照品储备液和内标储备液各0.2mL，配液溶剂1.0mL，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得对照液(氨甲苯酸和内标物浓度各约为2μg/mL)；
精密量取空白血清0.5mL于2mL量瓶中，精密加入对照品储备液10μL、50μL、或200μL或其它体积，内标储备液0.2mL和配液溶剂1.0mL，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，得到质控液(其中内标物浓度约为2μg/mL且氨甲苯酸浓度分别约为0.1μg/mL、0.5μg/mL、或2μg/mL或其它浓度)；
精密量取待测的含药血清0.5mL于2mL量瓶中，精密加入内标储备液0.2mL和配液溶剂1.0mL，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得含药并添加内标的供试液；
精密量取空白血清0.5mL于2mL量瓶中，加配液溶剂1.2mL，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得空白血清液
测定方法的专属性、线性、灵敏度、准确度、精密度、测试液稳定性、色谱残留；
在液相色谱仪中测定供试液，从测定供试液所得色谱图中读取氨甲苯酸和内标的峰面积，依据标准曲线和含药生物样品稀释倍数，计算生物样品中的氨甲苯酸含量。
进一步的，本发明第四方面提供了测定生物体的生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，该方法包括如下步骤：
(i)提供测定用的高效液相色谱系统；
(ii)提供空白生物样品和含药(即氨苯甲酸)生物样品，所述生物样品采集自被施用药剂前以及施用药剂后的生物体；
(iii)制备测试用溶液，并对所述含药生物样品进行处理制成用于液相色谱测定的供试液；
(iv)在高效液相色谱系统中测定所述测试用溶液和供试液，并据此测定结果计算生物样品中的氨甲苯酸含量。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中所述生物体是人或大鼠。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中所述生物体是人。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中所述生物样品是血液或尿液。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中所述生物样品是尿液。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中所述药剂是氨苯甲酸的冻干粉针剂。例如是本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中步骤(i)中，所述高效液相色谱系统包括：
液相色谱系统：Agilent 1200二元梯度泵和CTC自动进样器；
液相色谱分析柱为ProteColTM-P C18 HQ105柱(例如规格为5μm，250×4.6mmI.D.，例如为SGE Analytical Science的产品)；
流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液(20：80)，流速1ml/min；柱温40℃；检测波长为230nm；进样体积20μl；和/或
磷酸盐缓冲液的配制：取磷酸氢二钠12.0g，庚烷磺酸钠0.8g，加水900ml使溶解，用磷酸调节pH值至2.5，加水至1000ml，摇匀，作为磷酸盐缓冲液。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中步骤(ii)中，
所述空白生物样品是采集自被施用药剂前的生物体；
所述空白生物样品是采集自被施用药剂前的生物体的尿液即空白尿液；和/或
所述含药生物样品是采集自被施用药剂后的生物体的的尿液即含药尿液。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中步骤(iii)之所述制备测试用溶液中：
制备内标储备液：精密称取内标对照品适量，用配液溶剂溶解制成内标储备液(例如其浓度可以为1～50μg/mL，例如为10～50μg/mL，例如为20μg/mL)；
制备对照品储备液：精密称取氨甲苯酸对照品适量，用配液溶剂溶解制成对照品储备液(例如其浓度可以为1～50μg/mL，例如为10～50μg/mL，例如为20μg/mL)；
制备对照液：精密量取空白尿液2.5mL于10mL量瓶中，精密加入对照品储备液和内标储备液各1.0mL，配液溶剂适量，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得对照液(其中的氨甲苯酸和内标物浓度各自独立地为0.1～20μg/mL，例如各自独立地为0.5～10μg/mL，例如各自独立地为0.5～5μg/mL，例如约为2μg/mL)；
制备质控液：精密量取空白尿液2.5mL于10mL量瓶中，精密加入对照品储备液适量(例如10～500μL，例如10～200μL，例如10μL、50μL、或200μL)、内标储备液(例如50～500μL，例如100～400μL，例如200μL)和配液溶剂适量，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，得到质控液(其中的氨甲苯酸和内标物浓度各自独立地为0.1～20μg/mL，例如各自独立地为0.1～10μg/mL，例如各自独立地为0.1～5μg/mL，例如各自独立地为0.1～2μg/mL)；和/或
制备空白血清液：精密量取空白尿液2.5mL于10mL量瓶中，加配液溶剂6mL，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得空白血清液。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中步骤(iii)之对所述含药生物样品进行处理制成用于液相色谱测定的供试液中：
制备供试液：精密量取待测的含药尿液2.5mL于10mL量瓶中，精密加入内标储备液1.0mL和配液溶剂5.0mL，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得含药并添加内标的供试液。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中步骤(iii)中，所述内标为对甲基苯甲酸。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中步骤(iii)中，所述配液溶剂是包含0.2％甲酸和0.15％氯化镁的乙腈溶液。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中步骤(iv)中，测定所述测试用溶液时，任选地对方法的下述任一项或多项进行测定：专属性、线性、灵敏度、准确度、精密度、稳定性、色谱残留。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中步骤(iv)中，测定方法的专属性中，氨甲苯酸与内标的分离度大于5。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中步骤(iv)中，测定方法的线性中，所得标准曲线的相关系数r大于0.99。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中步骤(iv)中，测定方法的灵敏度中，检测限小于0.05μg/mL，定量限小于0.1μg/mL。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中步骤(iv)中，测定方法的准确度中，相对回收率和绝对回收率各自独立地大于90％，例如大于95％。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中步骤(iv)中，测定方法的精密度中，日内精密度和日间精密度各自独立地小于10％，例如小于5％。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中步骤(iv)中，测定方法的稳定性中，实测浓度相当于理论浓度的百分数即相对百分浓度大于90％，例如在90～110％范围。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中步骤(iv)中，测定方法的色谱残留中，空白血清液中待测物响应值低于质控液中待测物响应值的2％，例如低于1％。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其中步骤(iv)中，从测定供试液所得色谱图中读取氨甲苯酸和内标的峰面积，依据标准曲线和含药生物样品稀释倍数，计算生物样品中的氨甲苯酸含量。
根据本发明第四方面测定生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，其包括如下操作及条件：
液相色谱系统：Agilent 1200二元梯度泵和CTC自动进样器；
液相色谱分析柱为ProteColTM-P C18 HQ105柱(5μm，250×4.6mm I.D.，SGEAnalytical Science)；
注射用氨甲苯酸粉针剂、氨甲苯酸对照品、对甲基苯甲酸对照品；
空白生物样品和含药生物样品：采集自被施用注射用氨甲苯酸粉针剂前的健康志愿者尿液作为空白生物样品，采集自被施用注射用氨甲苯酸粉针剂后的健康志愿者尿液作为含药生物样品；
流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液(20：80)，流速1ml/min；柱温40℃；检测波长为230nm；进样体积20μl；
磷酸盐缓冲液的配制：取磷酸氢二钠12.0g，庚烷磺酸钠0.8g，加水900ml使溶解，用磷酸调节pH值至2.5，加水至1000ml，摇匀，作为磷酸盐缓冲液；
精密称取内标对照品10.06mg于100mL量瓶中，用配液溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2mL置10mL量瓶中，用配液溶剂稀释至刻度，摇匀，即得内标储备液(浓度为20.12μg/mL)；
精密称取氨甲苯酸对照品10.17mg于100mL量瓶中，用配液溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL置10mL量瓶中，用配液溶剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液(浓度为20.34μg/mL)。
精密量取空白尿液2.5mL于10mL量瓶中，精密加入对照品储备液和内标储备液各1.0mL，配液溶剂5.0mL，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得对照液(氨甲苯酸和内标物浓度各约为2μg/mL)；
精密量取空白尿液2.5mL于10mL量瓶中，精密加入对照品储备液50μL、250μL、或1000μL或其它体积，内标储备液1.0mL和配液溶剂5.0mL，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，得到质控液(其中内标物浓度约为2μg/mL且氨甲苯酸浓度分别约为0.1μg/mL、0.5μg/mL、或2μg/mL或其它浓度)；
精密量取待测的含药尿液2.5mL于10mL量瓶中，精密加入内标储备液1.0mL和配液溶剂5.0mL，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得含药并添加内标的供试液；
精密量取空白尿液2.5mL于10mL量瓶中，加配液溶剂6.0mL，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得空白尿液；
测定方法的专属性、线性、灵敏度、准确度、精密度、测试液稳定性、色谱残留；
在液相色谱仪中测定供试液，从测定供试液所得色谱图中读取氨甲苯酸和内标的峰面积，依据标准曲线和含药生物样品稀释倍数，计算生物样品中的氨甲苯酸含量。
在本发明上述制备方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。
下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
根据本发明的冻干粉针剂，其中的活性成分是具有下式结构的化合物：
Figure BDA0002846467590000131
根据本发明，术语“赋形剂”亦可称为辅料、填充剂等。
本文所用的“药学可接受的赋形剂”指的是可用于配制药物的赋形剂，其对生物体基本上没有不良影响，并且通常是生物体可耐受的。
在本发明中，优选的本发明冻干粉针剂在用水制成每1ml中含活性成分以氨甲苯酸计100mg的溶液后，再根据中国药典2010年版二部附录VI H项下的方法即pH值测定法测定。
虽然本领域技术人员理解，本发明的赋形剂可以是任一种可用于冷冻干燥的赋形剂，特别是甘露醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘氨酸及其组合，然而在本发明中，特别优选的赋形剂是甘露醇、乳糖等。
冷冻干燥粉针剂的制备过程是本领域技术人员公知的制药工艺，例如ZL201510150322.9所记载的冻干曲线A和冻干曲线B所示的两种示意性的冻干曲线。在下文制备冷冻干燥粉针剂中的具体实例中，如未另外特别说明，所用的冻干曲线是冻干曲线A。
冷冻干燥粉针剂中的水含量是一般在8％以下，优选低于5％，更优选低于3％。水分控制可通过适当调整冷冻干燥程序来控制。该冷冻干燥粉针剂中的水分含量可根据许多已知方法来测定，例如干燥失重法。
在本发明中，为了在必要时调节药液的pH值，可以向组合物中加入适当的pH调节剂(在本发明中亦称为酸碱调节剂)。尽管本发明人仅用不具缓冲能力的强酸或强碱溶液例如氢氧化钠水溶液和盐酸水溶液进行调节，然而，本领域技术人员理解，如果用这种不具缓冲能力的pH调节剂处理能满足体系的pH要求，则具有缓冲能力的pH调节剂将更加能够实现本发明目的，因此这些缓冲剂不但能够调节pH值，而且能稳定pH值。因此本发明所列任一pH调节剂或其组合均包括在本发明精神和范围内。
在制备本发明冻干粉针剂时，所配制的药液中，固形物含量是为2～20％(w/v)，优选2～15％(w/v)，再更优选2～10％。由于冻干粉针剂通常是在管状西林瓶中进行冷冻干燥得到，本领域技术人员理解这种产品在获得成品甚至在供医生使用之前，通常均呈现一个圆饼状，尽管该圆饼的体积理论上讲会比原有水溶液的体积少(稍有缩小)，然而通常这种缩小通常不会缩小到原水溶液体积50％，通常会在原水溶液体积的80-120％之间，更通常在原水溶液体积的90-100％之间，而从终产品西林瓶内可观察到原水溶液液面痕迹(主体饼状物因冻干缩小后残留在瓶壁上的液面痕迹，即便西林瓶中的冻干品因各种原因例如碰撞等原因而呈粉末状，通常仍然可以保留原有的液面痕迹)，据此痕迹亦可估计出该冷冻干燥组合物在冷冻干燥之前的水溶液体积。因此，虽然本发明提供的是一种基本无水的冷冻干燥粉针剂，然而根据该粉针剂仍然可以大致估计出其在配制时，至少在冷冻干燥开始之前的药液体积，根据该估计出的体积以及西林瓶中的干燥终产物的重量，亦可计算到在制备本发明冻干粉针剂时，所配制的药液中的固形物的含量。因此，根据本发明第一方面的冻干粉针剂，其在配制时的药液的固形物含量是为2～20％(w/v)，优选2～15％(w/v)，再更优选2～10％。
术语“固形物含量”是指固体物质(例如本发明活性化合物及所用的全部赋形剂，重量/克)加入到溶剂(例如注射用水)中，溶解后得到一个溶液，所述固体物质的重量除以终溶液体积的百分数(重量/体积百分数，例如g/100ml)。例如在本发明中，如果原料药物和全部固体辅料总计5g加适量注射用水溶液，配制成终体积为100ml的溶液，则该药液的固形物含量即为5％。
在本发明中，符号％，根据其所使用的语境，可以具有本领域技术人员容易理解的含义。例如在提及固形物含量时，该符号表示重量/体积的百分数(w/v，例如g/100ml)；又例如在提及冷冻干燥粉针剂中的“水含量”时，例如水含量在8％以下，此时该符号％表示重量/重量的百分数(w/w，g/100g)。一般而言，在固体分散在液体中时，％表示重量/体积百分数；在固体分散在固体中或者液体分散在固体中(例如粉针的含水量)时，％表示重量/重量百分数。在其它情况下，如无另外说明，符号％表示重量/重量百分数。
在配制本发明的药液时，本领域技术人员公知，可使用例如约0.45um的微孔滤膜进行粗滤过滤，在将药液灌装到西林瓶中之前，可以使用例如约0.22um的微孔滤膜进行精滤过滤以除菌，必要时可以过滤多次。
根据本发明的冻干粉针剂，其为冷冻干燥粉针剂。在一个实施方案中，该冷冻干燥粉针剂为单剂量制剂(例如西林瓶装的粉针剂)，每一单位剂量中活性化合物的量(其在本发明中如未另外说明，均折算成以氨甲苯酸计)可以例如但不限于约20mg、约50mg、约100mg、约150mg、约200mg。
根据本发明的冻干粉针剂，其用注射用水复溶，通常而言复溶时间在60秒内，优选在50秒内，更优选在40秒内。
根据本发明的冻干粉针剂，其在用水制成每1ml中含活性成分氨甲苯酸100mg的溶液后，该溶液的pH值为3.0～5.0。在一个实施方案中，pH值为3.5～4.5。
本发明提供的冻干粉针剂可以在在25℃以下干燥处保存至少24个月，可以满足一般的冷冻干燥粉针剂的贮藏要求。
本发明所得冻干粉针剂特别是冷冻干燥粉针剂通常为白色或类白色的冻干块状物或其碎块或其粉末，无臭、味苦，易溶于水。
氨甲苯酸粉针剂，主要用于因原发性纤维蛋白溶解过度所引起的出血，包括急性和慢性、局限性或全身性的高纤溶出血，后者常见于癌肿、白血病、妇产科意外、严重肝病出血等。通常而言氨甲苯酸冻干粉针剂每瓶中的活性成分含量为0.1g。氨甲苯酸冻干粉针剂通常通过静脉注射或滴注，一次0.1～0.3g(1支～3支)，一日不超过0.6g(6支)；或遵医嘱。在使用氨甲苯酸冻干粉针剂时，患者要监护血栓形成并发症的可能性。对于有血栓形成倾向者(如急性心肌梗死)宜慎用。氨甲苯酸冻干粉针剂一般不单独用于弥散性血管内凝血所致的继发性纤溶性出血，以防进一步血栓形成，影响脏器功能，特别是急性肾功能衰竭。如有必要，应在肝素化的基础上才应用本品。如与其他凝血因子(如因子Ⅸ)等合用，应警惕血栓形成。一般认为在凝血因子使用后8小时再用本品较为妥善。由于氨甲苯酸冻干粉针剂可导致继发肾盂和输尿管凝血块阻塞，血友病或肾盂实质病变发生大量血尿时要慎用。宫内死胎所致低纤维蛋白原血症出血，肝素治疗较本品为安全。慢性肾功能不全时用量酌减，给药后尿液浓度常较高。治疗前列腺手术出血时，用量也应减少。使用氨甲苯酸冻干粉针剂期间，如出现任何不良事件和/或不良反应，应咨询医生。
氨甲苯酸为氨甲苯酸类抗纤维蛋白溶解药。具有与6-氨基乙酸、氨甲环酸相同的作用机理。其立体构形与赖氨酸相似，能竞争性地抑制纤溶酶与纤维蛋白的吸附，保护纤维蛋白，使其不被纤溶酶降解，从而达到止血作用。其抗纤溶活性比6-氨基已酸强4-5倍。氨甲苯酸在临床上通常可用于因原发性纤维蛋白溶解过度所引起的出血，包括急性或慢性、局限性或全身性的高纤溶出血，后者常见于癌症、白血病、妇产科意外、严重肝病出血等。药代动力学方面，氨甲苯酸静注后有效血药浓度可维持3-5小时。服药24小时，36％±5％以原形随尿排出，静注则排出63％±17％，其余为乙酰化衍生物。
如前文述及的，为临床提供具有良好性能的氨甲苯酸制剂例如其粉针剂例如包含右旋糖酐的注射用氨甲苯酸冷冻干燥粉针剂在施用到体内以后，对生物样品例如血液或尿液中的活性物质浓度变化进行监测，这是本领域的一类重要工作，对于药物的质量评价以及指导临床用药具有重要意义。
通过建立本发明方法，为氨甲苯酸在给予动物(例如大鼠、人等)后体内生物样品(例如血液、尿液、唾液等)中这些物质的含量测定提供了可能。已经出人意料地发现，本发明提供的测定生物体例如人的生物样品中的氨甲苯酸的方法，呈现优异的方法学特征。
附图说明
图1为HPLC法式专属性试验色谱图，图中a为对照液、b为供试液、c为空白血清。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。在下面的例子中，使用的pH调节剂(在本发明中亦即酸碱调节剂)，如无另外说明，是1M氢氧化钠溶液或者1M盐酸溶液，其用量是使制备粉针剂时，使冷冻干燥前所配制的溶液的pH值调节至某一规定值或范围，该规定值或范围是使所制得的冻干粉针剂用注射用水溶解成含氨甲苯酸浓度为10mg/ml的溶液所测定的pH值的值或范围。下文制备步骤为了举例的目的，并基于各举例的可比较性而作了某些具体描述，本领域技术人员根据已有知识完全可以从中概括得到本发明制备冻干粉针剂的方法。在下面配液制备各种组合物中，如未另外说明，每批的总配液量为1000瓶的量，但是列明配方时，均以每瓶含氨甲苯酸100mg的量阐明。
以下各个制备粉针剂的实例中，如未特别说明，使用的是同一批市售原料药来制备制剂。这些原料药和粉针剂，如本申请人在先发明专利ZL201510150322.9所描述的，照周雪萍法检测能够有效地监测制剂的产品质量，例如能够有效地监测其中的RRT1.7杂质。
一、粉针剂制备例部分
制备例1、制备包含氨甲苯酸的粉针剂
配方：
氨甲苯酸 100mg，
甘露醇 95mg，
右旋糖酐-20 5mg，
pH调节剂 至pH4.0，
注射用水 适量，加至4ml。
制备方法：
(1)称取处方量的主药和辅料，置于不锈钢桶中，加入处方量约80％的注射用水，使各组分溶解，再按溶液体积加入0.1％(w/v)的活性炭，搅拌30分钟，过滤脱炭，补加注射用水至接近处方全量。
(2)滤液取样，测定pH值，必要时用pH调节剂调节至规定值(该规定值是冷冻干燥所得干粉用注射用水稀释成含活性成分10mg/ml的溶液所测定的pH值的值，下同)，再补加注射用水至处方全量。
(3)药液先用0.45um微孔滤膜过滤，再用0.22um微孔滤膜过滤2次。
(4)以每瓶灌装含活性成分100mg的药液于适宜大小的西林瓶中(药液约占西林瓶满口体积的约1/3～1/4)，半加胶塞。
(5)按照本文所述冻干曲线A进行冷冻干燥，至水分低于3％；冻干结束后，进行液压加塞；扎铝盖，即得。在本发明中制备例1的样品可简称为Ex1；其它制备例的样品亦可类似表示。
制备例2、制备包含氨甲苯酸的粉针剂
配方：
氨甲苯酸 100mg，
甘露醇 50mg，
右旋糖酐-20 10mg，
pH调节剂 至pH4.5，
注射用水 适量，加至6ml。
制备方法：
(1)称取处方量的主药和辅料，置于不锈钢桶中，加入处方量约80％的注射用水，使各组分溶解，再按溶液体积加入0.1％(w/v)的活性炭，搅拌30分钟，过滤脱炭，补加注射用水至接近处方全量。
(2)滤液取样，测定pH值，必要时用pH调节剂调节至规定值(该规定值是冷冻干燥所得干粉用注射用水稀释成含活性成分10mg/ml的溶液所测定的pH值的值，下同)，再补加注射用水至处方全量。
(3)药液先用0.45um微孔滤膜过滤，再用0.22um微孔滤膜过滤2次。
(4)以每瓶灌装含活性成分100mg的药液于适宜大小的西林瓶中(药液约占西林瓶满口体积的约1/3～1/4)，半加胶塞。
(5)按照本文所述冻干曲线A进行冷冻干燥，至水分低于3％；冻干结束后，进行液压加塞；扎铝盖，即得。在本发明中制备例1的样品可简称为Ex2；其它制备例的样品亦可类似表示。
制备例3、制备包含氨甲苯酸的粉针剂
配方：
氨甲苯酸 100mg，
甘露醇 150mg，
右旋糖酐-40 2mg，
pH调节剂 至pH3.5，
注射用水 适量，加至5ml。
制备方法：
(1)称取处方量的主药和辅料，置于不锈钢桶中，加入处方量约80％的注射用水，使各组分溶解，再按溶液体积加入0.1％(w/v)的活性炭，搅拌30分钟，过滤脱炭，补加注射用水至接近处方全量。
(2)滤液取样，测定pH值，必要时用pH调节剂调节至规定值(该规定值是冷冻干燥所得干粉用注射用水稀释成含活性成分10mg/ml的溶液所测定的pH值的值，下同)，再补加注射用水至处方全量。
(3)药液先用0.45um微孔滤膜过滤，再用0.22um微孔滤膜过滤2次。
(4)以每瓶灌装含活性成分100mg的药液于适宜大小的西林瓶中(药液约占西林瓶满口体积的约1/3～1/4)，半加胶塞。
(5)按照本文所述冻干曲线A进行冷冻干燥，至水分低于3％；冻干结束后，进行液压加塞；扎铝盖，即得。在本发明中制备例1的样品可简称为Ex3；其它制备例的样品亦可类似表示。
制备例4、制备包含氨甲苯酸的粉针剂
配方：
氨甲苯酸 100mg，
甘露醇 200mg，
右旋糖酐-70 5mg，
pH调节剂 至pH3.0，
注射用水 适量，加至3ml。
制备方法：
(1)称取处方量的主药和辅料，置于不锈钢桶中，加入处方量约70％的注射用水，使各组分溶解，再按溶液体积加入0.02％(w/v)的活性炭，搅拌30分钟，过滤脱炭，补加注射用水至接近处方全量。
(2)滤液取样，测定pH值，必要时用pH调节剂调节至规定值(该规定值是冷冻干燥所得干粉用注射用水稀释成含活性成分10mg/ml的溶液所测定的pH值的值，下同)，再补加注射用水至处方全量。
(3)药液先用0.45um微孔滤膜过滤，再用0.22um微孔滤膜过滤2次。
(4)以每瓶灌装含活性成分100mg的药液于适宜大小的西林瓶中(药液约占西林瓶满口体积的约1/3～1/4)，半加胶塞。
(5)按照本文所述冻干曲线A进行冷冻干燥，至水分低于3％；冻干结束后，进行液压加塞；扎铝盖，即得。在本发明中制备例1的样品可简称为Ex4；其它制备例的样品亦可类似表示。
制备例5、制备包含氨甲苯酸的粉针剂
配方：
氨甲苯酸 100mg，
甘露醇 75mg，
右旋糖酐-20 5mg，
pH调节剂 至pH5.0，
注射用水 适量，加至9ml。
制备方法：
(1)称取处方量的主药和辅料，置于不锈钢桶中，加入处方量约90％的注射用水，使各组分溶解，再按溶液体积加入0.2％(w/v)的活性炭，搅拌30分钟，过滤脱炭，补加注射用水至接近处方全量。
(2)滤液取样，测定pH值，必要时用pH调节剂调节至规定值(该规定值是冷冻干燥所得干粉用注射用水稀释成含活性成分10mg/ml的溶液所测定的pH值的值，下同)，再补加注射用水至处方全量。
(3)药液先用0.45um微孔滤膜过滤，再用0.22um微孔滤膜过滤2次。
(4)以每瓶灌装含活性成分100mg的药液于适宜大小的西林瓶中(药液约占西林瓶满口体积的约1/3～1/4)，半加胶塞。
(5)按照本文所述冻干曲线B进行冷冻干燥，至水分低于3％；冻干结束后，进行液压加塞；扎铝盖，即得。在本发明中制备例1的样品可简称为Ex5；其它制备例的样品亦可类似表示。
如ZL201510150322.9所记载的，上述制备例1至制备例5制备粉针剂活性成分含量、RRT1.7杂质控制和检测等均取得良好结果。
补充试验A：分别参照上述制备例1至制备例5的配方和制法，不同的仅是不添加右旋糖酐，制得五批粉针剂分别称为制备例1a至制备例5a，或分别简称为Ex1a至Ex5a。
二、粉针剂理化性能考察试验例部分
1、性能考察试验例：
本试验例考察粉针剂的外观和溶解性。已经发现，上文制备例1至制备例5所得全部七批粉针剂的外观均呈结实、完整的圆饼状、无裂块、无喷瓶等异常情况。
分别取制备例1至制备例5所得全部批次的粉针剂，揭开瓶盖塑料顶，用注射器从瓶塞穿刺注入注射用水(用量约为相应样品冷冻干燥前溶液体积的2倍)，用秒表记录复溶时间，每批样品测试5次，取平均值。结果，全部七批粉针剂试样的复溶时间均在15～43秒的范围内，例如Ex1的复溶时间为24秒，表明这些试样具有较快的临床上可接受的复溶性能。
2、粉针剂质量检测例：
针对上文制备例1至制备例5所得各批粉针剂以及市售品注射用氨甲苯酸(H20050339，北大高科华泰产，每瓶含氨甲苯酸0.1g)，照以下方法检测它们的酸度、溶液的澄清度与颜色、有关物质、干燥失重、无菌、热原、可见异物、不溶性微粒、含量等质量/性质指标：
酸度：取供试品1瓶，加水10ml使溶解，依法测定(中国药典2010年版二部附录VIH)，本领域通常要求pH值应为3.5～4.5。
溶液的澄清度与颜色：取供试品5瓶，分别加水5ml使溶解，依法检查(中国药典2010年版二部附录ⅨB及ⅨA)，本领域通常要求溶液应澄清无色。
有关物质：取装量差异项下的内容物，精密称取适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含0.16mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，加流动相稀释并制成每1ml中含1.6μg的溶液，作为对照溶液；照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰高为记录仪满量程的10％～15％，再取上述两种溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍；供试品溶液色谱图如显杂质峰(辅料峰除外)，量取各杂质峰面积之和，本领域通常要求不得大于对照溶液主峰面积的0.8倍(0.8％)。
干燥失重：取供试品适量，在105℃干燥至恒重(中国药典2010年版二部附录ⅧL)，，本领域通常要求减失重量不得过3.5％。
热原：取供试品适量，加0.9％氯化钠溶液溶解并制成每1ml中含10mg的溶液，依法检查(中国药典2010年版二部附录ⅪD)，剂量按家兔体重每1kg注射5ml，本领域通常要求应符合规定。
无菌：取供试品加0.9％无菌氯化钠溶液使溶解，依法检查(中国药典2010年版二部附录ⅪH)，本领域通常要求应符合规定。
可见异物：取供试品，依法检查(中国药典2010年版二部附录ⅨH)，本领域通常要求应符合规定。
不溶性微粒：取供试品，依法检查(中国药典2010年版二部附录ⅨC)，本领域通常要求应符合规定。
含量测定：照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录ⅤD)测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1mol/L的醋酸铵-冰醋酸(100∶1)为流动相；流速为1.0ml/min；检测波长为230nm；理论板数按氨甲苯酸峰计算应不低于3000；
测定法：取供试品装量差异项下的内容物，精密称取适量(约相当于氨甲苯酸32mg)置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为供试品溶液；另准确称取氨甲苯酸对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含32μg的溶液，作为对照品溶液，分别取上述两种溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得；本领域通常要求按平均装量计算，含氨甲苯酸(C8H9NO2·H2O)应为标示量(理论投料量)的95.0％～105.0％。
待测各粉针剂照上述方法检测，各项指标均在上述各指标所通常规定的范围内。
3、长期稳定性试验例：
针对上文制备例1至制备例5所得五批粉针剂以及市售品注射用氨甲苯酸(H20050339，北大高科华泰产，每瓶含氨甲苯酸0.1g)，使这些样品在40±2℃的室温条件下放置6月，参考上文“2、粉针剂质量检测例”的方法，考察这些粉针剂在0月时以及在6月时的各指标。结果显示全部六批粉针剂在经40℃放置6月后，各项检测指标仍然在上述各指标所通常规定的范围内。表明本发明粉针剂具有优异的稳定性。
4、安全性试验例：
本试验例对本发明组合物粉针进行安全性试验考察
本发明所得试样Ex1粉针、Ex2粉针、Ex3粉针，以及市售粉针(注射用氨甲苯酸，H20050339，北大高科华泰产)，照现行的药品注册法规要求(《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则课题》研究组；化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则，药物研究技术指导原则，北京：中国医药科技出版社，2006：124)，进行血管刺激性实验、溶血实验、过敏性实验，结果显示这些试样均符合血管刺激性实验、溶血实验、过敏性实验的规定。显示本发明组合物具有良好的安全性。例如，在刺激性方面，全部检测的粉针剂样品注射部位皮肤、静脉均呈现相似的变化，未见充血、水肿、硬结及坏死等异常现象。
三、测定人血清中的氨甲苯酸
本试验的目的是提供一种测定人血清中氨甲苯酸浓度的方法，为评价氨甲苯酸制剂的体内行为提供了一种有效的工具，例如用于考察制剂在受试者体内的药动学行为。本试验通过使用液相色谱分析方法测定人血清中的氨甲苯酸，为达上述目的成为可能。
1、仪器和试药
液相色谱系统：Agilent 1200二元梯度泵和CTC自动进样器；
液相色谱分析柱为ProteColTM-P C18 HQ105柱(5μm，250×4.6mm I.D.，SGEAnalytical Science)；
BT224S型精密电子分析天平(Sartorius)；DMT-2500型多管漩涡混合器(杭州米欧)；BF-2000型氮气吹干仪(北京八方世纪)；
高速离心机(Abbott)；超纯水器(2150型，18.2ΩM，MilliQ)；
注射用氨甲苯酸粉针剂(Ex1，北大高科华泰)、氨甲苯酸对照品(批号100921-201702，中检院)、对甲基苯甲酸对照品(内标，货号T36803，含量＞99.0％，Sigma-Aldrich)；
色谱溶剂为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
6名男性健康志愿者(19～34岁)于给药前(0h)用血清管抽取静脉血4～5mL，接着在静脉注射给予注射用氨甲苯酸(0.3g)后分别于0.5h、1h、2h、4h、6h、10h时同法采集静脉血，分取各血样的血清，置2～4℃冰箱冷藏保存，共收集到6份空白血清和36份含药血清。
2、试验条件和试药配制
本试验条件和试药配制过程中，所使用的乙腈P液是用乙腈(色谱纯)配制且包含0.25％甲酸和0.12％氯化镁，即该乙腈P液是包含0.25％甲酸和0.12％氯化镁的乙腈溶液，其亦可称为配液溶剂。在本发明中，如未特别说明，％均是重量/体积百分数。
2.1、色谱条件
色谱柱：如上文所述；
流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液(20：80)，流速1ml/min；柱温40℃；检测波长为230nm；进样体积20μl；
磷酸盐缓冲液的配制：取磷酸氢二钠12.0g，庚烷磺酸钠0.8g，加水900ml使溶解，用磷酸调节pH值至2.5，加水至1000ml，摇匀，作为磷酸盐缓冲液。
2.2、储备液的制备
精密称取内标对照品10.04mg于100mL量瓶中，用乙腈P液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2mL置10mL量瓶中，用乙腈P液稀释至刻度，摇匀，即得内标储备液(浓度为20.08μg/mL)。
精密称取氨甲苯酸对照品10.12mg于100mL量瓶中，用乙腈P液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL置10mL量瓶中，用乙腈P液稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液(浓度为20.24μg/mL)。
2.3、对照液和质控液的制备
精密量取空白血清0.5mL于2mL量瓶中，精密加入对照品储备液和内标储备液各0.2mL，乙腈P液1.0mL，混匀，补加乙腈P液至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得对照液(氨甲苯酸和内标物浓度各约为2μg/mL)。
精密量取空白血清0.5mL于2mL量瓶中，精密加入对照品储备液10μL、50μL、或200μL或其它体积，内标储备液0.2mL和乙腈P液1.0mL，混匀，补加乙腈P液至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，得到质控液(其中内标物浓度约为2μg/mL且氨甲苯酸浓度分别约为0.1μg/mL、0.5μg/mL、或2μg/mL或其它浓度)。
[另外，当需要对照液或质控液中的氨甲苯酸或内标物浓度增加或者减小时，可以增加或减小内标储备液和对照品储备液的添加体积，亦可通过增加或者减小内标储备液和对照品储备液的浓度，从而可以使得本节“2.3、对照液和质控液的制备”中各物料的添加体积不变，或者使得各添加物总体积不会超过2mL，使方法具有可操作性。]
2.4、供试液的制备
精密量取待测的含药血清0.5mL于2mL量瓶中，精密加入内标储备液0.2mL和乙腈P液1.0mL，混匀，补加乙腈P液至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得含药并添加内标的供试液。
2.5、空白血清液的制备
精密量取空白血清0.5mL于2mL量瓶中，加乙腈P液1.2mL，混匀，补加乙腈P液至刻度，涡旋1min，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得空白血清液。
3、试验方法和试验结果
3.1、专属性
选取6份不同个体的血清样本，分别制备空白血清液、对照液和供试液，进样分析，典型的色谱图如图1所示，氨甲苯酸(API)的保留时间大约在9.5min左右，内标物对甲基苯甲酸(IS)的保留时间大约在12min左右，二者的分离度大于5，空白血清中的内源性物质均在7min之内出峰，不干扰测定。说明本方法具有较好的专属性。15min能够全部出峰，为保证洗脱干净，每次进样洗脱45min。图1为HPLC法式专属性试验色谱图，为直观起见，仅截取记录至22.5min的色谱图，图中a为对照液、b为供试液、c为空白血清。
3.2、线性和灵敏度
参照“2.3、对照液和质控液的制备”项下方法制备内标物浓度约为2.0μg/mL且氨甲苯酸浓度约为0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、或6.0μg/mL的对照液，每个浓度制备5份(n＝5)，进样分析后，以氨甲苯酸峰面积平均值与内标峰面积平均值的比值Y作为纵坐标，以氨甲苯酸浓度X作为横坐标绘制标准曲线。在0.05～6.0μg/mL范围内的线性回归方程为：
Y＝1.642X-0.0231，r＝0.9997
以信噪比(S/N)约为3.0时的血药浓度为检测限(LOD)，信噪比(S/N)约为10.0时的血药浓度为定量限(LOQ)，测得氨甲苯酸的LOD为0.02μg/mL，LOQ为0.05μg/mL，完全能够满足全浓度范围内的测定要求。
3.3、准确度和精密度
按照“2.3、对照液和质控液的制备”项下质控液的制备方法，分别制备3个浓度的质控液(内标物浓度约为2μg/mL且氨甲苯酸浓度分别约为0.1μg/mL、0.5μg/mL、2.0μg/mL)，每个浓度制备6份，连续制备5天(d1～d5)，d1测得浓度和实际加入浓度的比值作为相对回收率，RSD作为日内精密度(n＝6)，d1～d5测得浓度的RSD作为日间精密度(n＝5)。在d1同时用0.5mL纯化水代替0.5mL空白血清制备同浓度无血清质控液，以质控液峰面积平均值与无血清质控液峰面积平均值的比值作为绝对回收率。氨甲苯酸的准确度和精密度的考察结果见下表。
Figure BDA0002846467590000231
3.4、稳定性
参照“2.3、对照液和质控液的制备”中的方法，制备包含内标物浓度约为2μg/mL且氨甲苯酸浓度约为2μg/mL的质控液，制备12份，其中：3份在室温放置24h后测定；3份在-20℃冰箱中反复冻融3次后测定；3份在2～4℃冰箱中放置3个月后测定；3份即刻同法制备溶液后在自动进样器中放置24h后测定。计算各稳定性实验条件下实测浓度相当于理论浓度的百分数(n＝3)，即相对百分浓度，结果：室温24h的相对百分浓度为98.1％、-20℃冻融3次的相对百分浓度为101.4％、2～4℃放置3月的相对百分浓度为99.7％、自动进样器24h的相对百分浓度为97.7％，这些结果表明本发明方法的稳定性良好。
3.5、色谱残留考察
取“3.2、线性和灵敏度”项下的内标物浓度2.0μg/mL且氨甲苯酸浓度6.0μg/mL的质控液，以及“2.5、空白血清液的制备”项下的空白血清液，先将质控液注入液相色谱仪进行分析，接着将空白血清液注入色谱仪进行分析。比较空白血清液与质控液的色谱图，在生物样品分析领域，空白血清液中待测物响应值通常不应超过质控液中待测物响应值的10％。结果显示，空白血清液中氨甲苯酸及内标的信号响应强度分别为质控液中相应物质信号响应强度的0.127％和0.023％，表明每次色谱分析后的质控液样品无残留，对空白血清液样品无干扰。
3.6、血样测定
运用新建方法对36份含药血样进行测定，测得氨甲苯酸的血药浓度范围在0.05～16.36μg/mL之间，例如6名志愿者给药后1h的血药浓度范围在11.74～16.36μg/mL之间，例如一名王姓志愿者给药后1h的血药浓度为14.72μg/mL。
本“三、测定人血清中的氨甲苯酸”的试验采用HPLC法测定人血清样品中氨甲苯酸的浓度，方法准确、选择性强，并且符合CFDA颁布的“化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则”有关规范要求，适用于氨甲苯酸在人血清中药物动力学研究。
4、方法改型
参考本“三、测定人血清中的氨甲苯酸”试验之“1、仪器和试药”、“2、试验条件和试药配制”、和“3、试验方法和试验结果”，不同的仅是所用配液溶剂即乙腈P液中未添加氯化镁，结果对方法的专属性、线性、灵敏度、准确度、精密度、色谱残留均无影响，这些参数或结果基本与上述“3、试验方法和试验结果”基本一致，例如“3.3、准确度和精密度”的低、中、高三种浓度时的绝对回收率分别为98.9％、99.7％、99.2％；但是明显地，对“3.4、稳定性”之稳定性结果有明显影响，具体结果如下：室温24h的相对百分浓度为82.6％、-20℃冻融3次的相对百分浓度为86.1％、2～4℃放置3月的相对百分浓度为88.7％、自动进样器24h的相对百分浓度为78.9％，表明当所用配液溶剂中不添加氯化镁时测试溶液的稳定性明显不理想。
参考本“三、测定人血清中的氨甲苯酸”试验之“1、仪器和试药”、“2、试验条件和试药配制”、和“3、试验方法和试验结果”，不同的仅是所用配液溶剂即乙腈P液中未添加甲酸，结果对方法的专属性、线性、灵敏度、准确度、精密度、色谱残留均无影响，这些参数或结果基本与上述“3、试验方法和试验结果”基本一致，例如“3.3、准确度和精密度”的低、中、高三种浓度时的绝对回收率分别为99.3％、100.6％、98.6％；但是明显地，对“3.4、稳定性”之稳定性结果有明显影响，具体结果如下：室温24h的相对百分浓度为85.3％、-20℃冻融3次的相对百分浓度为89.6％、2～4℃放置3月的相对百分浓度为91.1％、自动进样器24h的相对百分浓度为81.4％，表明当所用配液溶剂中不添加甲酸时测试溶液的稳定性明显不理想。
参考本“三、测定人血清中的氨甲苯酸”试验之“1、仪器和试药”、“2、试验条件和试药配制”、和“3、试验方法和试验结果”，不同的仅是所用配液溶剂即乙腈P液中未添加氯化镁且未添加甲酸，结果对方法的专属性、线性、灵敏度、准确度、精密度、色谱残留均无影响，这些参数或结果基本与上述“3、试验方法和试验结果”基本一致，例如“3.3、准确度和精密度”的低、中、高三种浓度时的绝对回收率分别为99.6％、98.8％、99.2％；但是明显地，对“3.4、稳定性”之稳定性结果有明显影响，具体结果如下：室温24h的相对百分浓度为81.3％、-20℃冻融3次的相对百分浓度为84.7％、2～4℃放置3月的相对百分浓度为85.4％、自动进样器24h的相对百分浓度为75.7％，表明当所用配液溶剂中不添加氯化镁且不添加甲酸时测试溶液的稳定性明显不理想。
通过本方法改型的试验，出人意料地发现，在本发明测定血清药物浓度的方法中，所用配液溶剂中同时添加氯化镁和甲酸二者后可以显著提高方法稳定性。
四、测定人尿液中的氨甲苯酸
本试验的目的是提供一种测定人尿液中氨甲苯酸浓度的方法，为评价氨甲苯酸制剂的体内行为提供了一种有效的工具，例如用于考察制剂在受试者体内的药动学行为。本试验通过使用液相色谱分析方法测定人尿液中的氨甲苯酸，为达上述目的成为可能。
1、仪器和试药
液相色谱系统：Agilent 1200二元梯度泵和CTC自动进样器；
液相色谱分析柱为ProteColTM-P C18 HQ105柱(5μm，250×4.6mm I.D.，SGEAnalytical Science)；
BT224S型精密电子分析天平(Sartorius)；DMT-2500型多管漩涡混合器(杭州米欧)；BF-2000型氮气吹干仪(北京八方世纪)；
高速离心机(Abbott)；超纯水器(2150型，18.2ΩM，MilliQ)；
注射用氨甲苯酸粉针剂(Ex1，北大高科华泰)、氨甲苯酸对照品(批号100921-201702，中检院)、对甲基苯甲酸对照品(内标，货号T36803，含量＞99.0％，Sigma-Aldrich)；
色谱溶剂为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
6名男性健康志愿者(21～33岁)于给药前一天收集24h尿液(0h)，接着在静脉注射给予注射用氨甲苯酸(0.3g)后分别于1h、2h、4h、6h、8h、12h时收集尿液，取各尿样20ml置添加有0.1ml冰醋酸试管内，摇匀，置2～4℃冰箱冷藏保存，共收集到6份空白尿液和36份含药尿液。
2、试验条件和试药配制
本试验条件和试药配制过程中，所使用的乙腈Q液是用乙腈(色谱纯)配制且包含0.25％甲酸和0.12％氯化镁，即该乙腈Q液是包含0.2％甲酸和0.15％氯化镁的乙腈溶液，其在本“四、测定人尿液中的氨甲苯酸”中亦可称为配液溶剂。在本发明中，如未特别说明，％均是重量/体积百分数。
2.1、色谱条件
色谱柱：如上文所述；
流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液(20：80)，流速1ml/min；柱温40℃；检测波长为230nm；进样体积20μl；
磷酸盐缓冲液的配制：取磷酸氢二钠12.0g，庚烷磺酸钠0.8g，加水900ml使溶解，用磷酸调节pH值至2.5，加水至1000ml，摇匀，作为磷酸盐缓冲液。
2.2、储备液的制备
精密称取内标对照品10.06mg于100mL量瓶中，用乙腈Q液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2mL置10mL量瓶中，用乙腈Q液稀释至刻度，摇匀，即得内标储备液(浓度为20.12μg/mL)。
精密称取氨甲苯酸对照品10.17mg于100mL量瓶中，用乙腈Q液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL置10mL量瓶中，用乙腈Q液稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液(浓度为20.34μg/mL)。
2.3、对照液和质控液的制备
精密量取空白尿液2.5mL于10mL量瓶中，精密加入对照品储备液和内标储备液各1.0mL，乙腈Q液5.0mL，混匀，补加乙腈Q液至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得对照液(氨甲苯酸和内标物浓度各约为2μg/mL)。
精密量取空白尿液2.5mL于10mL量瓶中，精密加入对照品储备液50μL、250μL、或1000μL或其它体积，内标储备液1.0mL和乙腈Q液5.0mL，混匀，补加乙腈Q液至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，得到质控液(其中内标物浓度约为2μg/mL且氨甲苯酸浓度分别约为0.1μg/mL、0.5μg/mL、或2μg/mL或其它浓度)。
[另外，当需要对照液或质控液中的氨甲苯酸或内标物浓度增加或者减小时，可以增加或减小内标储备液和对照品储备液的添加体积，亦可通过增加或者减小内标储备液和对照品储备液的浓度，从而可以使得本节“2.3、对照液和质控液的制备”中各物料的添加体积不变，或者使得各添加物总体积不会超过10mL，使方法具有可操作性。]
2.4、供试液的制备
精密量取待测的含药尿液2.5mL于10mL量瓶中，精密加入内标储备液1.0mL和乙腈Q液5.0mL，混匀，补加乙腈Q液至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得含药并添加内标的供试液。
2.5、空白尿液的制备
精密量取空白尿液2.5mL于10mL量瓶中，加乙腈Q液6.0mL，混匀，补加乙腈Q液至刻度，涡旋1min，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得空白尿液。
3、试验方法和试验结果
3.1、专属性
选取6份不同个体的尿液样本，分别制备空白尿液、对照液和供试液，进样分析，典型的色谱图与图1所示血清样本基本相同，氨甲苯酸(API)的保留时间大约在9.6min左右，内标物对甲基苯甲酸(IS)的保留时间大约在12.3min左右，二者的分离度大于5，空白尿液中的内源性物质均在7min之内出峰，不干扰测定。说明本方法具有较好的专属性。15min能够全部出峰，为保证洗脱干净，每次进样洗脱45min。
3.2、线性和灵敏度
参照本“四、测定人尿液中的氨甲苯酸”的“2.3、对照液和质控液的制备”项下方法制备内标物浓度约为2.0μg/mL且氨甲苯酸浓度约为0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、或6.0μg/mL的对照液，每个浓度制备5份(n＝5)，进样分析后，以氨甲苯酸峰面积平均值与内标峰面积平均值的比值Y作为纵坐标，以氨甲苯酸浓度X作为横坐标绘制标准曲线。在0.05～6.0μg/mL范围内的线性回归方程为：
Y＝1.674X-0.0216，r＝0.9998
以信噪比(S/N)约为3.0时的尿药浓度为检测限(LOD)，信噪比(S/N)约为10.0时的尿药浓度为定量限(LOQ)，测得氨甲苯酸的LOD为0.02μg/mL，LOQ为0.05μg/mL，完全能够满足全浓度范围内的测定要求。
3.3、准确度和精密度
按照本“四、测定人尿液中的氨甲苯酸”的“2.3、对照液和质控液的制备”项下质控液的制备方法，分别制备3个浓度的质控液(内标物浓度约为2μg/mL且氨甲苯酸浓度分别约为0.1μg/mL、0.5μg/mL、2.0μg/mL)，每个浓度制备6份，连续制备5天(d1～d5)，d1测得浓度和实际加入浓度的比值作为相对回收率，RSD作为日内精密度(n＝6)，d1～d5测得浓度的RSD作为日间精密度(n＝5)。在d1同时用2.5mL纯化水代替2.5mL空白尿液制备同浓度无尿液质控液，以质控液峰面积平均值与无尿液质控液峰面积平均值的比值作为绝对回收率。氨甲苯酸的准确度和精密度的考察结果见下表。
Figure BDA0002846467590000271
3.4、稳定性
参照本“四、测定人尿液中的氨甲苯酸”的“2.3、对照液和质控液的制备”中的方法，制备包含内标物浓度约为2μg/mL且氨甲苯酸浓度约为2μg/mL的质控液，制备12份，其中：3份在室温放置24h后测定；3份在-20℃冰箱中反复冻融3次后测定；3份在2～4℃冰箱中放置3个月后测定；3份即刻同法制备溶液后在自动进样器中放置24h后测定。计算各稳定性实验条件下实测浓度相当于理论浓度的百分数(n＝3)，即相对百分浓度，结果：室温24h的相对百分浓度为99.3％、-20℃冻融3次的相对百分浓度为98.7％、2～4℃放置3月的相对百分浓度为100.3％、自动进样器24h的相对百分浓度为98.4％，这些结果表明本发明方法的稳定性良好。
3.5、色谱残留考察
取本“四、测定人尿液中的氨甲苯酸”的“3.2、线性和灵敏度”项下的内标物浓度2.0μg/mL且氨甲苯酸浓度6.0μg/mL的质控液，以及“2.5、空白尿液的制备”项下的空白尿液，先将质控液注入液相色谱仪进行分析，接着将空白尿液注入色谱仪进行分析。比较空白尿液与质控液的色谱图，在生物样品分析领域，空白尿液中待测物响应值通常不应超过质控液中待测物响应值的10％。结果显示，空白尿液中氨甲苯酸及内标的信号响应强度分别为质控液中相应物质信号响应强度的0.083％和0.009％，表明每次色谱分析后的质控液样品无残留，对空白尿液样品无干扰。
3.6、尿样测定
本“四、测定人尿液中的氨甲苯酸”运用新建方法对36份含药尿样进行测定，测得氨甲苯酸的尿药浓度范围在0.05～13.72μg/mL之间，例如6名志愿者给药后2h的尿药浓度范围在9.26～13.72μg/mL之间，例如一名李姓志愿者给药后2h的尿药浓度为10.27μg/mL。
本“四、测定人尿液中的氨甲苯酸”的试验采用HPLC法测定人尿液样品中氨甲苯酸的浓度，方法准确、选择性强，并且符合CFDA颁布的“化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则”有关规范要求，适用于氨甲苯酸在人尿液中药物动力学研究。
4、方法改型
参考本“四、测定人尿液中的氨甲苯酸”试验之“1、仪器和试药”、“2、试验条件和试药配制”、和“3、试验方法和试验结果”，不同的仅是所用配液溶剂即乙腈Q液中未添加氯化镁，结果对方法的专属性、线性、灵敏度、准确度、精密度、色谱残留均无影响，这些参数或结果基本与上述“3、试验方法和试验结果”基本一致，例如“3.3、准确度和精密度”的低、中、高三种浓度时的绝对回收率分别为99.2％、98.4％、99.6％；但是明显地，对“3.4、稳定性”之稳定性结果有明显影响，具体结果如下：室温24h的相对百分浓度为84.3％、-20℃冻融3次的相对百分浓度为87.7％、2～4℃放置3月的相对百分浓度为89.4％、自动进样器24h的相对百分浓度为77.4％，表明当所用配液溶剂中不添加氯化镁时测试溶液的稳定性明显不理想。
参考本“四、测定人尿液中的氨甲苯酸”试验之“1、仪器和试药”、“2、试验条件和试药配制”、和“3、试验方法和试验结果”，不同的仅是所用配液溶剂即乙腈Q液中未添加甲酸，结果对方法的专属性、线性、灵敏度、准确度、精密度、色谱残留均无影响，这些参数或结果基本与上述“3、试验方法和试验结果”基本一致，例如“3.3、准确度和精密度”的低、中、高三种浓度时的绝对回收率分别为97.4％、99.2％、100.3％；但是明显地，对“3.4、稳定性”之稳定性结果有明显影响，具体结果如下：室温24h的相对百分浓度为83.7％、-20℃冻融3次的相对百分浓度为87.3％、2～4℃放置3月的相对百分浓度为90.4％、自动进样器24h的相对百分浓度为82.7％，表明当所用配液溶剂中不添加甲酸时测试溶液的稳定性明显不理想。
参考本“四、测定人尿液中的氨甲苯酸”试验之“1、仪器和试药”、“2、试验条件和试药配制”、和“3、试验方法和试验结果”，不同的仅是所用配液溶剂即乙腈Q液中未添加氯化镁且未添加甲酸，结果对方法的专属性、线性、灵敏度、准确度、精密度、色谱残留均无影响，这些参数或结果基本与上述“3、试验方法和试验结果”基本一致，例如“3.3、准确度和精密度”的低、中、高三种浓度时的绝对回收率分别为97.8％、99.4％、98.6％；但是明显地，对“3.4、稳定性”之稳定性结果有明显影响，具体结果如下：室温24h的相对百分浓度为80.6％、-20℃冻融3次的相对百分浓度为86.3％、2～4℃放置3月的相对百分浓度为84.2％、自动进样器24h的相对百分浓度为77.3％，表明当所用配液溶剂中不添加氯化镁且不添加甲酸时测试溶液的稳定性明显不理想。
通过本方法改型的试验，出人意料地发现，在本发明测定尿液药物浓度的方法中，所用配液溶剂中同时添加氯化镁和甲酸二者后可以显著提高方法稳定性。
以上所述实施例仅是为充分说明本申请而所举的较佳的实施例，本申请的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本申请基础上所作的等同替代或变换，均在本申请的保护范围之内。本申请的保护范围以权利要求书为准。

Claims (11)

1.测定生物体的生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，该方法包括如下步骤：
(i)提供测定用的高效液相色谱系统，包括：
液相色谱系统：Agilent 1200二元梯度泵和CTC自动进样器；
液相色谱分析柱为ProteCol™-P C18 HQ105柱；
流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液体积比20：80的混合液，流速1ml/min；柱温40℃；检测波长为230nm；进样体积20μl；
磷酸盐缓冲液的配制：取磷酸氢二钠12.0g，庚烷磺酸钠0.8g，加水900ml使溶解，用磷酸调节pH值至2.5，加水至1000ml，摇匀，作为磷酸盐缓冲液；
(ii)提供空白生物样品和含药生物样品，所述生物样品采集自被施用药剂前以及施用药剂后的生物体；
(iii)制备测试用溶液，并对所述含药生物样品进行处理制成用于液相色谱测定的供试液，包括如下操作：
制备内标储备液：精密称取内标对照品适量，用配液溶剂溶解制成内标储备液，其浓度为1~50μg/mL；所述内标为对甲基苯甲酸；
制备对照品储备液：精密称取氨甲苯酸对照品适量，用配液溶剂溶解制成对照品储备液，其浓度为1~50μg/mL；
制备对照液：精密量取空白尿液2.5mL于10mL量瓶中，精密加入对照品储备液和内标储备液各1.0mL，配液溶剂适量，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得对照液，其中的氨甲苯酸和内标物浓度各自独立地为0.1~20μg/mL；
制备质控液：精密量取空白尿液2.5mL于10mL量瓶中，精密加入对照品储备液10~500μL、内标储备液50~500μL和配液溶剂适量，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，得到质控液，其中的氨甲苯酸和内标物浓度各自独立地为0.1~20μg/mL；
制备空白尿 液：精密量取空白尿液2.5mL于10mL量瓶中，加配液溶剂6mL，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得空白尿液；
制备供试液：精密量取待测的含药尿液2.5mL于10mL量瓶中，精密加入内标储备液1.0mL和配液溶剂5.0mL，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得含药并添加内标的供试液；
(iv)在高效液相色谱系统中测定所述测试用溶液和供试液，并据此测定结果计算生物样品中的氨甲苯酸含量，
其中，
所述生物体是人；
所述生物样品是尿液；
所述药剂包含氨甲苯酸和冻干赋形剂；
所述药剂是氨苯甲酸的冻干粉针剂；
所述冻干赋形剂选自蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖、山梨醇、甘氨酸、右旋糖酐；
所述氨甲苯酸与冻干赋形剂的重量比为100：50~500；
所述配液溶剂是包含0.2%甲酸和0.15%氯化镁的乙腈溶液。
2.根据权利要求1的方法，其中液相色谱分析柱为ProteCol™-P C18 HQ105柱，其规格为5μm，250×4.6mm I.D.。
3.根据权利要求1的方法，其中步骤(iv)中，测定所述测试用溶液时，还对方法的下述任一项或多项进行测定：专属性、线性、灵敏度、准确度、精密度、稳定性、色谱残留。
4.根据权利要求1的方法，步骤(iv)中，测定方法的专属性中，氨甲苯酸与内标的分离度大于5。
5.根据权利要求1的方法，步骤(iv)中，测定方法的线性中，所得标准曲线的相关系数r大于0.99。
6.根据权利要求1的方法，步骤(iv)中，测定方法的灵敏度中，检测限小于0.05μg/mL，定量限小于0.1μg/mL。
7.根据权利要求1的方法，步骤(iv)中，测定方法的准确度中，相对回收率和绝对回收率各自独立地大于90%。
8.根据权利要求1的方法，步骤(iv)中，测定方法的精密度中，日内精密度和日间精密度各自独立地小于10%。
9.根据权利要求1的方法，步骤(iv)中，测定方法的稳定性中，实测浓度相当于理论浓度的百分数即相对百分浓度大于90%。
10.根据权利要求1的方法，其中步骤(iv)中，测定方法的色谱残留中，空白尿 液中待测物响应值低于质控液中待测物响应值的2%。
11.根据权利要求1的方法，其中步骤(iv)中，从测定供试液所得色谱图中读取氨甲苯酸和内标的峰面积，依据标准曲线和含药生物样品稀释倍数，计算生物样品中的氨甲苯酸含量。
CN202011511239.7A 2020-12-18 2020-12-18 用于测定氨甲苯酸冻干制剂体内行为的方法 Active CN112557547B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011511239.7A CN112557547B (zh) 2020-12-18 2020-12-18 用于测定氨甲苯酸冻干制剂体内行为的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011511239.7A CN112557547B (zh) 2020-12-18 2020-12-18 用于测定氨甲苯酸冻干制剂体内行为的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112557547A CN112557547A (zh) 2021-03-26
CN112557547B true CN112557547B (zh) 2022-08-02

Family

ID=75030373

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011511239.7A Active CN112557547B (zh) 2020-12-18 2020-12-18 用于测定氨甲苯酸冻干制剂体内行为的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112557547B (zh)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104198610B (zh) * 2014-09-16 2015-06-24 德州博诚制药有限公司 氨甲苯酸样品杂质检测装置

Also Published As

Publication number Publication date
CN112557547A (zh) 2021-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Seikaly et al. Endogenous angiotensin concentrations in specific intrarenal fluid compartments of the rat.
Mandema et al. Familial chronic idiopathic jaundice (Dubin-Sprinz disease), with a note on bromsulphalein metabolism in this disease
US8460939B2 (en) Method for producing purified hematinic iron-saccharidic complex and product produced
Jian-Hua et al. Direct analysis of salicylic acid, salicyl acyl glucuronide, salicyluric acid and gentisic acid in human plasma and urine by high-performance liquid chromatography
US20100087392A1 (en) Complexes of ibuprofen, cyclodextrins and ternary agents and the use thereof in pharmaceutics
CN101317852B (zh) 一种复方甘草酸苷类粉针注射剂及其制备方法
CN108659104B (zh) 一种特利加压素的制备方法及其药物组合物
KR20130076892A (ko) 생약 유래 성분의 고감도 정량 방법
Elfström Plasma protein binding of Phenytoin after cholecystectomy and neurosurgical operations
CN112557547B (zh) 用于测定氨甲苯酸冻干制剂体内行为的方法
CN112595795B (zh) 氨甲苯酸冻干制剂
CN103860483A (zh) 复方甘草酸苷类冻干粉针注射剂及其制备方法
CN101744777B (zh) 奥美拉唑钠冻干粉针剂及制备方法和检测方法
CN107028897B (zh) 免疫调节剂胸腺五肽粉针剂药物组合物和质控方法
Kestell et al. Measurement of plasma 5-hydroxyindoleacetic acid as a possible clinical surrogate marker for the action of antivascular agents
CN105929098B (zh) 氨甲苯酸和注射液组合物及其质控方法
CN112516093B (zh) 注射用氨甲苯酸冷冻干燥粉针剂
CN111983064A (zh) 一种氨基己酸及其制剂中聚合体的检测方法
Plock et al. Successful management of discovered pH dependence in vancomycin recovery studies: novel HPLC method for microdialysis and plasma samples
Raghow et al. High-performance liquid chromatographic assay of tolbutamide and carboxytolbutamide in human plasma
CN109959736A (zh) 使用氨基酸分析仪测定氨甲环酸含量的方法
CN104721153B (zh) 注射用氨甲苯酸冷冻干燥粉针剂药物组合物
Xia et al. An improved high‐performance liquid chromatographic method with a solid‐phase extraction for the determination of piperacillin and tazobactam: application to pharmacokinetic study of different dosage in Chinese healthy volunteers
CN103565747B (zh) 一种埃索美拉唑药物组合物及其制备方法
CN111257453A (zh) 测定生物样品中的阿司匹林的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant