CN112546033A

CN112546033A - 大黄素及其三甲氧基衍生物在制备抗糖脂代谢紊乱药物中的应用

Info

Publication number: CN112546033A
Application number: CN202011395400.9A
Authority: CN
Inventors: 吴延丽; 许鹏飞; 宋辉; 孙学斌
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Engineering University; Harbin Medical University
Priority date: 2020-12-03
Filing date: 2020-12-03
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2040-12-03
Also published as: CN112546033B

Abstract

本发明公开了大黄素及其三甲氧基衍生物在制备抗糖脂代谢紊乱药物中的应用。本发明合成得到了结构稳定、纯度较高的三甲氧基大黄素，通过非酶糖基化实验检测二者的降糖效果；通过油酸诱导的HepG2细胞高脂模型检测降脂效果；以参与糖尿病发生、发展的主要因素之一晚期糖基化终末产物AGE_S诱导HepG2细胞构建高脂模型，并通过该模型检测降脂效果。结果表明，大黄素及三甲氧基大黄素均对AGE_S的生成具有较强的抑制作用，并显著抑制由油酸和AGE_S诱导HepG2细胞的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量的升高以及高密度脂蛋白含量的降低，且三甲氧基大黄素表现出更好的药理作用，接近甚至超过洛伐他汀。因此，大黄素和三甲氧基大黄素可作为治疗糖脂代谢紊乱的潜在药物。

Description

大黄素及其三甲氧基衍生物在制备抗糖脂代谢紊乱药物中的应用

技术领域

本发明涉及大黄素及其三甲氧基衍生物在抗糖脂代谢紊乱中的应用。本发明属于医药技术领域。

背景技术

中药大黄源于蓼科植物虎杖和掌叶大黄干燥的根部和根茎，大黄素作为其中的一种活性成分，具有多种功效，如抗肿瘤、解痉、止咳、泻下、利尿、免疫抑制等多种生理药理活性，被广泛运用到现代医学中，但由于其活性有限，因而探究大黄素的结构改造，对增加其生物活性有着重大的意义，也为未来的科学研究提供了方向。

研究表明对大黄素的结构位点进行酰基化、糖基化等改构，会提高其生物活性。但在具体操作中，存在着副反应多、反应条件复杂、靶向性差等缺点，因而需要探索一种高效、绿色的合成方法，并运用该合成方法对大黄素的结构位点进行改构，对提高其降脂活性，提供了研究的方向。

糖代谢紊乱是指调节葡萄糖、果糖、半乳糖等代谢的激素或酶的结构、功能、浓度异常，或组织、器官的病理生理变化，而脂代谢紊乱指先天性或获得性因素造成的血液及其他组织器官中脂质及其代谢产物质和量的异常。经研究发现，40％Ⅱ型糖尿病患者合并脂代谢紊乱，且所有糖尿病患者至少有一种类型的血脂异常，而其他患者常常伴有其高密度脂蛋白(HDL)水平的降低和低密度脂蛋白的升高(LDL)和甘油三酯(TG)水平的升高，表明糖尿病的发生与发展与血脂水平的异常有着密不可分的关系。而脂代谢紊乱又可诱发加重胰岛素抵抗，进一步可导致β细胞功能衰竭，从而加重糖代谢紊乱。脂肪堆积，导致脂肪分解活跃，大量游离脂肪酸(FFA)进入血液，产生高FFA血症，FFA可引起高胰岛素血症，并促进糖异生，因而随着肥胖在世界范围的流行，糖脂代谢紊乱作为代谢性疾病的重要特征，正悄无声息地威胁着人类的健康。糖脂代谢紊乱是冠心病、脑卒中、脂肪肝及胰腺炎等慢性并发症等疾病的病理基础和主要危险因子。与糖脂代谢紊乱相关的疾病主要有糖尿病(DM)、糖耐量减低(IGI)、空腹血糖减损(IFG)、高脂血症、脂肪肝(肥胖型、糖尿病型)。临床上糖尿病、高脂血症等代谢紊乱疾病的发病率呈日益增加的趋势，针对这一迫在眉睫的现状，进行防治糖脂代谢紊乱相关研究已迫在眉睫。

目前国内外临床上对糖脂代谢紊乱的治疗中，在降糖发面主要有胰岛素、磺酰脲类药物、二甲双胍类药物等，降脂发面主要有他汀类药物、贝特类药物、烟酸类药物、胆酸螯合剂等。这些常用药物作用机理清楚，起效迅速，但也有许多缺点，如只能作用于单种疾病、肝肾损害、停药后易反跳等。此外，这些药物只能在降脂或降糖方面的药理作用进行单独考察，没有将糖脂代谢关联到一起。如他汀类药物中的洛伐他汀，作为治疗高胆固醇血症的主要药物之一，具有良好的降脂效果，却无降糖作用，此外，随着长期使用会出现头痛、倦怠、胃肠道反应、白细胞、血小板减少、肝功能异常等诸多不良反应。

本发明研究发现通过下述方法合成得到的三甲氧基大黄素结构稳定，纯度较高，晚期糖基化终末产物(AGE_S)可诱导HepG2细胞产生高脂，且大黄素和三甲氧基大黄素能够显著抑制由AGE_S诱导的TC、TG和LDL含量的升高以及HDL含量的降低。显示其能通过糖脂代谢相关联的通路起到很好的降脂作用，可作为治疗糖脂代谢紊乱的潜在药物，且无细胞毒性。

发明内容

本发明的目的在于提供大黄素及其三甲氧基衍生物在制备抗糖脂代谢紊乱药物中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

首先，本发明制备了结构稳定、纯度较高的三甲氧基大黄素并对其结构进行了表征。然后本发明对大黄素及三甲氧基大黄素的细胞毒性进行了检测，结果表明，与大黄素(EMO)组相比，同等浓度三甲氧基大黄素(TRO-EMO)作用下的HepG2细胞的细胞存活率显著提高，这表明大黄素在经三甲氧基化学修饰生成三甲氧基大黄素后细胞毒性明显降低。接着，本发明对大黄素及三甲氧基大黄素进行了非酶糖基化实验，结果发现，在EMO和TRO-EMO处理后，AGEs的荧光强度随孵育时间的延长而显著下降。尤其是TRO-EMO，在100μM浓度下抑制率接近为63.18％，接近氨基胍组，强于EMO组。最后，本发明还评估了大黄素及三甲氧基大黄素对油酸以及AGEs诱导的HepG2细胞高脂模型脂质含量的影响，结果表明，大黄素和三甲氧基大黄素能够显著抑制由OA或AGEs诱导HepG2细胞高脂模型中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL)含量的升高以及高密度脂蛋白(HDL)含量的降低，三甲氧基大黄素较大黄素表现出更好的降脂活性，接近甚至超过阳性对照药洛伐他汀，且无细胞毒性。

因此，在上述研究的基础上，本发明提出了大黄素及其三甲氧基衍生物在制备抗糖脂代谢紊乱药物中的应用。

其中，优选的，所述的三甲氧基衍生物为三甲氧基大黄素。

其中，优选的，三甲氧基大黄素通过以下方法制备得到：称取大黄素0.1g，无水碳酸钾1.5g，丙酮10.5mL，一起放置于三颈瓶中，在不断搅拌的条件下，慢慢滴加1.5mL的硫酸二甲酯，混合物加热回流8h后，冷却至室温，并且在丙酮蒸发至原体积的一半之后，加入7mL的纯化水，用布氏漏斗收集其中黄色固体，残留母液蒸去一大半丙酮后得到黄色固体，合并粗产物；将粗产物放置于烧杯中，加入氯仿和水的混合物，再放进蒸馏水超声波仪器中辅助溶解20min，分离下层黄色液体，放入冰水浴冷却2h；将分离出来的黄色液体，在3000r/min的条件下，离心10min，将上清液放入冷冻干燥器中干燥24h，得到纯净的三甲氧基大黄素。

其中，优选的，大黄素或其三甲氧基衍生物能够显著抑制总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL)含量的升高以及高密度脂蛋白(HDL)含量的降低。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明合成得到了结构稳定、纯度较高的三甲氧基大黄素，通过非酶糖基化实验检测二者的降糖效果；通过油酸诱导的HepG2细胞高脂模型检测降脂效果；以参与糖尿病发生、发展的主要因素之一晚期糖基化终末产物AGEs诱导HepG2细胞构建高脂模型，并通过该模型检测降脂效果。结果表明，大黄素及其三甲氧基衍生物三甲氧基大黄素均对晚期糖基化终末产物(AGEs)的生成具有较强的抑制作用，表现出很好的降糖活性。大黄素和三甲氧基大黄素能够显著抑制由OA或AGE_S诱导HepG2细胞高脂模型中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL)含量的升高以及高密度脂蛋白(HDL)含量的降低，三甲氧基大黄素较大黄素表现出更好的降脂活性，接近甚至超过阳性对照药洛伐他汀，且无细胞毒性。因此，大黄素和三甲氧基大黄素均能通过糖脂代谢相关联的通路起到很好的抗糖脂代谢紊乱作用，可作为治疗抗糖脂代谢紊乱的潜在药物。

附图说明

图1是三甲氧基大黄素的¹H-NMR谱(600MHz，CDCl₃)；

图2是大黄素和三甲氧基大黄素对HepG2细胞活力的影响，^*代表与模型组相比(^***P<0.001)；

图3是大黄素和三甲氧基大黄素对晚期糖基化终产物形成的抑制作用(AG是氨基胍的缩写；GLY是糖化的缩写；EMO是大黄素的缩写；TRO-EMO是三甲氧基大黄素的缩写)；

图4是大黄素和三甲氧基大黄素对OA诱导的HepG2细胞高脂模型脂质含量的影响，OA是油酸的缩写，LOV是洛伐他汀的缩写，EMO是大黄素的缩写；TRO-EMO是三甲氧基大黄素的缩写；^#代表与对照组相比，^*代表与模型组相比(^##P<0.01，^###P<0.001；^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001)；

图5是1.0mg/mLAGE_S诱导HepG2细胞的高脂模型。其中BSA是牛血清白蛋白的缩写，BSA和AGEs均来自非酶糖基化实验；^#代表与对照组相比(^###P<0.001)；

图6是大黄素和三甲氧基大黄素对AGE_S诱导的HepG2细胞高脂模型脂质含量的影响，其中BSA是牛血清白蛋白的缩写，BSA和AGEs均来自非酶糖基化实验；^#代表与对照组相比，^*代表与模型组相比(^###P<0.001；^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1、三甲氧基大黄素的制备及其结构表征

称取大黄素0.1g，无水碳酸钾1.5g，丙酮10.5mL，一起放置于三颈瓶中，在不断搅拌的条件下，慢慢滴加1.5mL的硫酸二甲酯，混合物加热回流8h后，冷却至室温，并且在丙酮蒸发至原体积的一半之后，加入7mL的纯化水，用布氏漏斗收集其中黄色固体，残留母液蒸去一大半丙酮后得到黄色固体，合并粗产物。将粗产物放置于烧杯中，加入氯仿和水的混合物，再放进蒸馏水超声波仪器中辅助溶解20min，分离下层黄色液体，放入冰水浴冷却2h。将分离出来的黄色液体，在3000r/min的条件下，离心10min，将上清液放入冷冻干燥器中干燥24h，得到三甲氧基大黄素。取制备好的三甲氧基大黄素样品10mg溶于CDCl₃中，采用核磁共振仪测定。

结果表明(图1、表1)：¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)中δ7.64(s，1H，4-H)，7.32(d，J＝2.44Hz，1H，2-H)，7.09(s，1H，5-H)，6.76(d，J＝2.42Hz，1H，7-H)，3.98(s，3H，8-OCH₃)，3.96(s，3H，1-OCH₃)，3.95(s，3H，3-OCH₃)，2.47(s，3H，-CH₃)。分析得出1-OH，3-OH和8-OH均被甲氧基取代成功，且纯度较高。

表1三甲氧基大黄素的¹H-NMR数据

实施例2、大黄素及三甲氧基大黄素细胞毒性检测

将HepG2细胞接种在96孔板上。用大黄素和三甲氧基大黄素(10，25，50，100μM)处理细胞。48h后，向每个孔中加入10μL CCK-8，并在37℃下孵育4h。使用酶标仪测量波长450nm处的吸光度。结果表明(图2)：与大黄素(EMO)组相比，同等浓度三甲氧基大黄素(TRO-EMO)作用下的HepG2细胞的细胞存活率显著提高，这表明大黄素在经三甲氧基化学修饰生成三甲氧基大黄素后细胞毒性明显降低。

实施例3、大黄素及三甲氧基大黄素非酶糖基化实验

将BSA(20mg/mL，10mL)、葡萄糖(500mM、5mL)和0.02％叠氮化钠与磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.4)混合。将样品大黄素和三甲氧基大黄素(10，25，50，100μM)以及阳性对照药氨基胍加入到反应混合物中，然后在37℃下将混合物在37℃下孵育31d。在孵育期间，按照需要于第1、4、7、13、19、25、31d天用蒸馏水将非酶糖基化反应体系(0.5ml)稀释至10毫升，用RF-5301荧光分析仪在370nm激发波长和440nm发射波长处测量了材料的荧光，评估大黄素(EMO)和三甲氧基大黄素(TRO-EMO)对AGEs形成的影响。如图3所示，在EMO和TRO-EMO处理后，AGEs的荧光强度随孵育时间的延长而显著下降。尤其是TRO-EMO，在100μM浓度下抑制率接近为63.18％，接近氨基胍组，强于EMO组(表2)。

表2EMO和TRO-EMO对AGE_S形成的影响

^*是与氨基胍组相比，^***P<0.01

实施例4、大黄素及三甲氧基大黄素对油酸诱导的HepG2细胞高脂模型脂质含量的影响

将HepG2细胞接种于24孔板中，分为空白组、模型组、洛伐他汀阳性对照药组及各浓度给药组，每孔500μL。孵育12h至细胞密度达80％～90％，空白组不处理，模型组加入油酸造模液500μL，给药组加入500μL大黄素和三甲氧基大黄素(10，25，50，100μM)，500μL20μM洛伐他汀作为阳性对照，培养箱中继续孵育48h。按试剂盒所示方法测定每孔样品上清中TC、TG、HDL、LDL的含量，以及沉淀中蛋白含量。结果表明(图4)，油酸可显著提高HepG2细胞的TC、TG和LDL含量，而HDL则显著降低。在给药大黄素和三甲氧基大黄素后，TC、TG、HDL、LDL的含量较模型组表现出显著的改善，表现出良好的降脂效果，且其降脂活性呈剂量依赖关系。EMO和TRO-EMO在100μM时均表现出较强的抑制作用，在浓度为100μM时，TRO-EMO较EMO在抑制TC、TG和LDL方面分别显著提高21.22％、24.58％和18.04％，对HDL的促进效果提高了20.23％(表3)。这表明大黄素在经三甲氧基化学修饰生成三甲氧基大黄素后降脂活性明显提高。

表3EMO和TRO-EMO对油酸诱导HepG2细胞高脂模型脂质含量的影响

实施例5、大黄素及三甲氧基大黄素对AGE_S诱导的HepG2高脂模型中脂质含量的影响

1、晚期糖基化终末产物AGEs的制备

将20mg/mLBSA溶液10mL、500mM葡萄糖溶液5mL、0.02％w/v叠氮化钠溶液与pH 7.4的200mM磷酸盐缓冲液混合，在培养箱中孵育60d后，在蒸馏水中使用分子量为Mw 8000-14000Da的透析袋进行透析，冷冻干燥即得AGEs粉末(其中含有BSA粉末)。

2、AGE_S诱导HepG2细胞构建高脂模型的建立

将HepG2细胞接种在24孔板中，每孔500μL，然后孵育12h直至细胞密度达到80％～90％。然后用含有10％v/v胎牛血清DMEM培养基稀释的1.0mg/mL AGEs溶液500μL诱导HepG2细胞形成高脂模型组(AGEs+BSA)，以1.0mg/mL的BSA溶液作为阴性对照(制备AGEs粉末中同时含有BSA粉末，为证明实际起到诱导高脂作用的为AGEs，故以BSA为阴性对照)，含有10％v/v胎牛血清DMEM培养基代替AGEs处理作为空白组。

按试剂盒所示方法测定每孔样品上清中TC、TG、HDL、LDL的含量，以及沉淀中蛋白含量。结果表明：与空白组相比，BSA组TC、TG、HDL和LDL的含量均无异常，表明加入同等条件孵育的BSA后脂质水平并未出现异常。加入AGEs+BSA后，在HepG2细胞中发现了脂质代谢紊乱，TC，TG和LDL的含量分别显著升高，HDL含量明显降低，表明AGE_S能够诱导HepG2细胞形成高脂模型。通过图4与图5可以看出，由AGEs诱导HepG2细胞构建的高脂模型与经典的油酸诱导的HepG2细胞高脂模型相比，模型中脂质各指标的含量变化更大，说明用糖代谢的终产物诱导高脂造模非常成功，并将糖代谢与脂代谢关联起来，符合糖脂代谢相互影响相辅相成的理论。

3、大黄素及三甲氧基大黄素对AGE_S诱导的HepG2高脂模型中脂质含量的影响

给药组根据筛选结果加入大黄素和三甲氧基大黄素(100μM)500μL对细胞进行处理。加入500μL 20μM洛伐他汀作为阳性对照组，加入1.0mg/mL的BSA溶液作为阴性对照组。

在孵育48h后，通过试剂盒所示方法测量细胞中TC、TG、LDL、HDL和蛋白的含量。结果表明(图6)：经AGE_S诱导后，在HepG2细胞中产生了脂质代谢紊乱，TC、TG和LDL的含量均显著升高，HDL含量明显降低。在给药500μL100μM大黄素和三甲氧基大黄素后，TC、TG和LDL的含量均显著下降，HDL的含量明显升高，表现出良好的降脂效果。与大黄素相比，三甲氧基大黄素对TC、TG和LDL的抑制效果分别提高了22.73％，20.01％和21.94％，对HDL的促进效果提高了18.67％(表4)。

表4EMO和TRO-EMO对AGE_S诱导的HepG2高脂模型中脂质含量的影响

综上所述，大黄素和三甲氧基大黄素均能良好的抑制AGE_S的形成、油酸诱导的HepG2高脂模型中的脂质含量及由晚期糖基化终末产物AGE_S诱导的HepG2高脂模型中的脂质含量。大黄素在经过三甲氧基化学修饰生成三甲氧基大黄素后，不仅细胞毒性显著下降，在抑制AGE_S的形成和抑制由油酸或AGE_S诱导的高脂模型中的脂质含量的作用均得到明显的提高，其药理作用接近甚至超过阳性对照药洛伐他汀，且无细胞毒性。大黄素和三甲氧基大黄素可作为良好的抗糖脂代谢紊乱药物。

Claims

1.大黄素或其三甲氧基衍生物在制备抗糖脂代谢紊乱药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的三甲氧基衍生物为三甲氧基大黄素。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，三甲氧基大黄素通过以下方法制备得到：称取大黄素0.1g，无水碳酸钾1.5g，丙酮10.5mL，一起放置于三颈瓶中，在不断搅拌的条件下，慢慢滴加1.5mL的硫酸二甲酯，混合物加热回流8h后，冷却至室温，并且在丙酮蒸发至原体积的一半之后，加入7mL的纯化水，用布氏漏斗收集其中黄色固体，残留母液蒸去一大半丙酮后得到黄色固体，合并粗产物；将粗产物放置于烧杯中，加入氯仿和水的混合物，再放进蒸馏水超声波仪器中辅助溶解20min，分离下层黄色液体，放入冰水浴冷却2h；将分离出来的黄色液体，在3000r/min的条件下，离心10min，将上清液放入冷冻干燥器中干燥24h，得到纯净的三甲氧基大黄素。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，大黄素或其三甲氧基衍生物能够显著抑制总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL)含量的升高以及高密度脂蛋白(HDL)含量的降低。