CN112540166A - 一种利用碳氮分析仪快速测定森林土壤中微生物生物量氮的方法 - Google Patents

一种利用碳氮分析仪快速测定森林土壤中微生物生物量氮的方法 Download PDF

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Abstract

一种利用碳氮分析仪快速测定森林土壤中微生物生物量氮的方法，涉及一种快速测定生物量氮的方法。目的是解决现有的土壤中微生物生物量氮的测定方法及测定工序复杂、测定效率低和易产生实验误差的问题。方法：土壤取样并进行除杂和培养，采用氯仿熏蒸，然后震荡提取得到提取液，测定标准曲线，最后将提取液过滤和酸化，注入碳氮分析仪进样口进行氮含量测定。本发明测定方法能够提高测定结果可信度和精准度；无需进行氧化消解过程和配置氧化剂，提高了测定效率和精确度。本发明适用于森林土壤中微生物生物量氮的测定。

Description

一种利用碳氮分析仪快速测定森林土壤中微生物生物量氮的 方法
技术领域
本发明涉及一种快速测定生物量氮的方法。
背景技术
土壤中微生物生物量氮是指土壤中所有活微生物体内所含有的氮的总量，尽管仅占土壤有机氮总量的1％-5％，但是土壤中最活跃的有机氮组分，其周转速率快，能敏感且及时反映或预示土壤变化，可在早期预测土壤有机质的长期变化趋势。目前，在土壤微生物生物量氮的测定中，主要分两个过程，即前处理和测定。前处理主要采用熏蒸-硫酸钾浸提法，通过这一过程得到含有土壤微生物生物量氮的浸提液，然后进行测定过程。对浸提液的测定法方目前主要过硫酸钾氧化法、硫酸铜-浓硫酸消化后的半微量定氮法、茚三酮比色法等。其中，过硫酸钾氧化法在测定浸提液氮含量的过程中，氧化剂配置的组分与比例、消解温度及时间的差异均会在不同程度上影响测定结果的准确性；硫酸铜-浓硫酸消化后的半微量定氮法在测定浸提液氮含量的过程中消化时间长、测定速度慢，产生测定误差因素较多；茚三酮比色法测定浸提液氮含量的过程中，如果控制不好反应时间与茚三酮的量，则样品间NH4 +-N(氨态氮)不能与茚三酮反应完全，影响反映结果的重现性。
发明内容
本发明为了解决现有的土壤中微生物生物量氮的测定方法及测定工序复杂、测定效率低和易产生实验误差的问题，提出一种利用碳氮分析仪快速测定森林土壤微生物生物量氮的方法。
本发明利用碳氮分析仪快速测定森林土壤中微生物生物量氮的方法按照以下步骤进行：
一、取样：采集土壤样品并置于0～4℃条件下保存；
二、土壤前处理：
除去土壤样品中大于2mm的植物残体和土壤动物，然后过2mm土壤筛，调整土壤样品的湿度为田间持水量的40％；然后将土壤样品置于密封容器内进行培养；
其中，在培养过程中，在密封容器内放置有盛有氢氧化钠溶液的敞口容器用以吸收培养期间释放的CO2；
三、熏蒸：
取步骤二所得土样置于敞口容器内，将敞口容器放在真空干燥器中，同时将另一个盛有氯仿的敞口容器和盛有氢氧化钠溶液的敞口容器放置在真空干燥器中，控制真空干燥器内空气相对湿度为100％，然后对真空干燥器进行抽真空至真空度为-0.07Mpa以下，此时氯仿沸腾，4～6分钟后停止抽真空，将真空干燥器密封并置于25℃的暗室中放置24小时，然后取出盛有氯仿和氢氧化钠溶液的敞口容器，然后再重复对真空干燥器抽真空至土样内氯仿完全除去，得到测试土样；
取步骤二所得土样并置于空气湿度为100％的真空干燥器中，密封后置于温度为25℃的暗室中放置24小时，得到对照土样；
四、提取：将测试土样和对照土样分别进行震荡提取，并分别过滤，得到测试土样提取液和对照土样提取液；
五、标准曲线测定：首先配置标准曲线待测液，利用碳氮分析仪对标准曲线待测液进行测定，得到标准曲线；
六、样品测定：
开机前向碳氮分析仪燃烧管内放入铂催化剂，碳氮分析仪预热后，取步骤四所得测试土样提取液和对照土样提取液，分别经过滤和酸化，然后注入至碳氮分析仪进样口进行氮含量测定，最后进行结果计算，即完成。
本发明采用的催化剂具有很低的空白值，能够保证氮含量很低的样品测量结果的可信度和精准度；此外，本发明酸化后的提取液注入碳氮分析仪进样口后在燃烧管内能够直接燃烧转化成机器可测定的形式的氮，因此无需进行氧化消解过程，同时本发明测定过程也无需配置氧化剂，简化了测定过程，节省测定样品时间，每个样品均能在较短的时间内测定完成，提高测定效率，又可避免因复杂的测定工序而产生的实验误差，大幅度提高了测定速度和结果的精确度。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意合理组合。
具体实施方式一：本实施方式利用碳氮分析仪快速测定森林土壤微生物生物量氮的方法按照以下步骤进行：
一、取样：采集土壤样品并置于0～4℃条件下保存；
二、土壤前处理：
除去土壤样品中大于2mm的植物残体和土壤动物，然后过2mm土壤筛，调整土壤样品的湿度为田间持水量的40％；然后将土壤样品置于密封容器内进行培养；
其中，在培养过程中，在密封容器内放置有盛有氢氧化钠溶液的敞口容器用以吸收培养期间释放的CO2；
三、熏蒸：
取步骤二所得土样置于敞口容器内，将敞口容器放在真空干燥器中，同时将另一个盛有氯仿的敞口容器和盛有氢氧化钠溶液的敞口容器放置在真空干燥器中，控制真空干燥器内空气相对湿度为100％，然后对真空干燥器进行抽真空至真空度为-0.07Mpa以下，此时氯仿沸腾，4～6分钟后停止抽真空，将真空干燥器密封并置于25℃的暗室中放置24小时，然后取出盛有氯仿和氢氧化钠溶液的敞口容器，然后再重复对真空干燥器抽真空至土样内氯仿完全除去，得到测试土样；
取步骤二所得土样并置于空气湿度为100％的真空干燥器中，密封后置于温度为25℃的暗室中放置24小时，得到对照土样；
四、提取：将测试土样和对照土样分别进行震荡提取，并分别过滤，得到测试土样提取液和对照土样提取液；
五、标准曲线测定：首先配置标准曲线待测液，利用碳氮分析仪对标准曲线待测液进行测定，得到标准曲线；
六、样品测定：
开机前向碳氮分析仪燃烧管内放入铂催化剂，碳氮分析仪预热后，取步骤四所得测试土样提取液和对照土样提取液，分别经过滤和酸化，然后注入至碳氮分析仪进样口进行氮含量测定，最后进行结果计算，即完成。
本实施方式采用的催化剂具有很低的空白值，能够保证氮含量很低的样品测量结果的可信度和精准度；此外，本实施方式酸化后的提取液注入碳氮分析仪进样口后在燃烧管内能够直接燃烧转化成机器可测定的形式的氮，因此无需进行氧化消解过程，同时本实施方式测定过程也无需配置氧化剂，简化了测定过程，节省测定样品时间，每个样品均能在较短的时间内测定完成，提高测定效率，又可避免因复杂的测定工序而产生的实验误差，大幅度提高了测定速度和结果的精确度。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二所述培养的条件为：湿度为100％，温度25℃，培养14天。湿度可以通过在密封容器内放置适量水实现；
具体实施方式三：本实施方式与体实施一或二不同的是：步骤四所述震荡提取时加入的试剂为0.25-0.50mol·L-1的硫酸钾溶液，震荡速度为280-300rev·min-1，震荡时间为30min。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤五所述配置标准曲线待测液方法为：首先配置浓度为1000mg·L-1的TN溶液作为母液，分别量取0mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL母液，用去离子水定容至100mL容量瓶中，得到0mg·L-1、20mg·L-1、40mg·L-1、60mg·L-1、80mg·L-1和100mg·L-1的标准曲线待测液。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤五所述对标准曲线待测液进行测定时碳氮分析仪参数设置：温度为750℃，进样体积为300-500uL，积分时间为200-300s。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤六所述碳氮分析仪预热方法为：开机后首先对去离子水进行测定，重复2～3次，测定时碳氮分析仪参数设置为：温度为750℃，进样体积为300-500uL，积分时间为200-300s。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤六所述进行氮含量测定时碳氮分析仪参数设置为：温度为750℃，进样体积为300-500uL，积分时间为200-300s。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤六所述酸化方法为：加入1mol/L的HCL溶液至提取液pH为6～8。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤六所述过滤采用的滤膜为直径0.45um为微孔滤膜。
实施例1：
本发明利用碳氮分析仪快速测定森林土壤中微生物生物量氮的方法按照以下步骤进行：
本发明采用德国Analytik Jena公司的型号为Multi N/C 2100S的碳氮分析仪；
一、取样：在森林样地内，确定采样点采集土壤样品，在采样点用土钻采集土样，将采集的土样置于0～4℃冰箱内保存；
二、土壤前处理：测定前仔细除去土壤中大于2mm的植物残体和土壤动物，过2mm土壤筛并混匀。如果土壤过湿，应在室内适当风干再过筛，风干过程中注意经常翻动，以免局部干燥。风干至土壤湿度为田间持水量的40％，此时土壤手感湿润疏松但不结块；
将土壤放置在密封的塑料桶内，桶内同时放入盛有适量水的容器以保指桶内的持相对湿度为100％，并放一小杯1mol·L-1氢氧化钠溶液用以吸收培养期间释放的CO2，之后，将塑料桶放入培养箱，在25℃下培养14天；
三、熏蒸：
称取经步骤二前处理的含有50.00g干土的土样置于100m L烧杯中，将烧杯放入真空干燥器中；同时并放入盛有去氯仿的烧杯2只(约2/3烧杯)，烧杯内放入经浓盐酸溶液(质量分数为37％)浸泡过夜后洗涤烘干的碎瓷片(约0.5mm大小)以防瀑沸，同时放入一小烧杯稀氢氧化钠溶液(浓度为1mol·L-1)用以吸收熏蒸期间释放出的CO2，真空干燥器底部应加入水以保持相对湿度为100％。采用真空泵对干燥器进行抽真空，真空度控制在-0.07Mpa以下，此时氯仿剧烈沸腾，5分钟后，停止抽真空并封闭真空干燥器，转移至25℃的暗室放置24小时，取出氯仿(此氯仿可回收再利用)和稀氢氧化钠溶液，反复抽真空(真空干燥器)至土壤无氯仿味为止。同时取步骤二所得土样并置于空气湿度为100％的真空干燥器中，密封后置于温度为25℃的暗室中放置24小时，得到对照土样；用于后期的计算。
四、提取：将熏蒸土壤无损地分别转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL浓度为0.25mol·L-1的硫酸钾溶液，震荡30min，震荡速度为300rev·min-1，用中速定量滤纸过滤于塑料瓶中，得到测试土样提取液；
重复本步骤对对照土样进行提取得到对照土样提取液；提取液应立即分析或在-18℃下保存。
五、标准曲线测定：首先配置标准曲线待测液，利用碳氮分析仪对标准曲线待测液进行测定，得到标准曲线；
所述配置标准曲线待测液方法为：首先配置浓度为1000mg·L-1的TN溶液(全氮溶液)作为母液，分别量取0mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL母液，用去离子水定容至100mL容量瓶中，得到0mg·L-1、20mg·L-1、40mg·L-1、60mg·L-1、80mg·L-1和100mg·L-1的标准曲线待测液。此标准曲线测定后的土壤微生物生物量氮含量范围为0mg·Kg-1、40mg·Kg-1、80mg·Kg-1、120mg·Kg-1、160mg·Kg-1、200mg·Kg-1。
所述对标准曲线待测液进行测定时碳氮分析仪参数设置：温度为750℃，进样体积为300uL，积分时间为300s；
六、样品测定：
(1)催化剂：选择铂催化剂，开机测定前放入碳氮分析仪燃烧管内，放置一次可测定约1500个样品。
(2)机器预热：开机后首先进行空样测定，即只测定去离子水，重复2～3次，此步骤为了预热并稳定仪器；测定时碳氮分析仪参数设置为：温度为750℃，进样体积为300uL，积分时间为300s；
(3)样品过滤和酸化：样品为步骤四所得测试土样提取液和对照土样提取液；如果样品是刚刚完成浸提，则直接采用微孔滤膜过滤提取液，滤膜直径0.45um；如果是解冻的提取液，底部会有白色沉淀，则必须将提取液完全解冻摇晃均匀后过滤待测，样品经过滤后，滴入1mol/L HCL溶液进行酸化样品pH在6-8之间；
(4)测定过程：分析中碳氮分析仪器参数设置同标准曲线测定设置。用进样针管取样品300μL酸化后的提取液，打开进样口插入进样管，点击电脑提示框同时注入样品，按住针管10s左右后，迅速拔针并关闭进样口，测定结束后记录每个样品的氮含量数据，最后进行结果计算，即完成。
本实施例采用的催化剂具有很低的空白值，能够保证氮含量很低的样品测量结果的可信度和精准度；此外，本实施例酸化后的提取液注入进样口后在燃烧管内能够直接燃烧转化成机器可测定的形式的氮，因此无需氧化消解过程，同时本实施例测定过程也无需配置氧化剂，简化了测定过程，节省测定样品时间，每个样品仅需6分钟即可测定完成，提高测定效率，又可避免因复杂的测定工序而产生的实验误差，大幅度提高了测定速度和精确度。

Claims (9)

1.一种利用碳氮分析仪快速测定森林土壤中微生物生物量氮的方法，其特征在于：该方法按照以下步骤进行：
一、取样：采集土壤样品并置于0～4℃条件下保存；
二、土壤前处理：
除去土壤样品中大于2mm的植物残体和土壤动物，然后过2mm土壤筛，调整土壤样品的湿度为田间持水量的40％；然后将土壤样品置于密封容器内进行培养；
其中，在培养过程中，在密封容器内放置有盛有氢氧化钠溶液的敞口容器用以吸收培养期间释放的CO2；
三、熏蒸：
取步骤二所得土样置于敞口容器内，将敞口容器放在真空干燥器中，同时将另一个盛有氯仿的敞口容器和盛有氢氧化钠溶液的敞口容器放置在真空干燥器中，控制真空干燥器内空气相对湿度为100％，然后对真空干燥器进行抽真空至真空度为-0.07Mpa以下，此时氯仿沸腾，4～6分钟后停止抽真空，将真空干燥器密封并置于25℃的暗室中放置24小时，然后取出盛有氯仿和氢氧化钠溶液的敞口容器，然后再重复对真空干燥器抽真空至土样内氯仿完全除去，得到测试土样；
取步骤二所得土样并置于空气湿度为100％的真空干燥器中，密封后置于温度为25℃的暗室中放置24小时，得到对照土样；
四、提取：将测试土样和对照土样分别进行震荡提取，并分别过滤，得到测试土样提取液和对照土样提取液；
五、标准曲线测定：首先配置标准曲线待测液，利用碳氮分析仪对标准曲线待测液进行测定，得到标准曲线；
六、样品测定：
开机前向碳氮分析仪燃烧管内放入铂催化剂，碳氮分析仪预热后，取步骤四所得测试土样提取液和对照土样提取液，分别经过滤和酸化，然后注入至碳氮分析仪进样口进行氮含量测定，最后进行结果计算，即完成。
2.根据权利要求1所述的利用碳氮分析仪快速测定森林土壤中微生物生物量氮的方法，其特征在于：步骤二所述培养的条件为：湿度为100％，温度25℃，培养10-14天。
3.根据权利要求1所述的利用碳氮分析仪快速测定森林土壤中微生物生物量氮的方法，其特征在于：步骤四所述震荡提取时加入的试剂为0.25-0.50mol·L-1的硫酸钾溶液，震荡速度为280-300rev·min-1，震荡时间为30min。
4.根据权利要求1所述的利用碳氮分析仪快速测定森林土壤中微生物生物量氮的方法，其特征在于：步骤五所述配置标准曲线待测液方法为：首先配置浓度为1000mg·L-1的TN溶液作为母液，分别量取0mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL母液，用去离子水定容至100mL容量瓶中，得到0mg·L-1、20mg·L-1、40mg·L-1、60mg·L-1、80mg·L-1和100mg·L-1的标准曲线待测液。
5.根据权利要求1所述的利用碳氮分析仪快速测定森林土壤中微生物生物量氮的方法，其特征在于：步骤五所述对标准曲线待测液进行测定时碳氮分析仪参数设置：温度为750℃，进样体积为300-500uL，积分时间为200-300s。
6.根据权利要求1所述的利用碳氮分析仪快速测定森林土壤中微生物生物量氮的方法，其特征在于：步骤六所述碳氮分析仪预热方法为：开机后首先对去离子水进行测定，重复2～3次，测定时碳氮分析仪参数设置为：温度为750℃，进样体积为300-500uL，积分时间为200-300s。
7.根据权利要求1所述的利用碳氮分析仪快速测定森林土壤中微生物生物量氮的方法，其特征在于：步骤六所述进行氮含量测定时碳氮分析仪参数设置为：温度为750℃，进样体积为300-500uL，积分时间为200-300s。
8.根据权利要求1所述的利用碳氮分析仪快速测定森林土壤中微生物生物量氮的方法，其特征在于：步骤六所述酸化方法为：加入1mol/L的HCL溶液至提取液pH为6～8。
9.根据权利要求1所述的利用碳氮分析仪快速测定森林土壤中微生物生物量氮的方法，其特征在于：步骤六所述过滤采用的滤膜为直径0.45um为微孔滤膜。
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