CN111337587B - 一种高通量测定土壤微生物生物量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及环境监测分析的技术领域，公开了一种高通量测定土壤微生物生物量的方法。该方法包括以下步骤(1)样品预处理；(2)样品密封培养；(3)建立校准曲线；(4)采用顶空气相色谱(HS‑GC)对样品进行检测；(5)结果计算。本发明涉及土壤中微生物生物量的测定方法，适用于不同土壤样品。通过测定密封培养瓶中土壤微生物通过基质诱导呼吸(SIR)作用而产生的CO₂来测定土壤微生物生物量碳(MBC)以量化SMB。该方法不仅可以简化操作流程，提高测定结果的准确性，而且无需使用氯仿(有毒的有机溶剂)，符合绿色化学的宗旨。本发明所述的方法尤其适用于不同土壤样品中SMB的快速、批量化检测。

Description

一种高通量测定土壤微生物生物量的方法

技术领域

本发明涉及环境监测分析的技术领域，更具体地，涉及一种高通量测定土壤微生物生物量的方法。

背景技术

土壤微生物作为土壤中重要的分解者，在养分循环和转化中起着重要作用。SMB是指土壤中所有生物的数量(植物根和土壤动物除外)，它决定了土壤的同化和矿化能力大小，被广泛用作衡量土壤肥力和生态系统生产力的一个指标。因此，一种准确、简单、方便地测定SMB的方法对土壤生态系统的研究至关重要。实际上，MBC即土壤中所有活微生物的碳总量，可作为表征SMB总量的指标。

目前，最常用的MBC测定方法有氯仿熏蒸萃取法(CFE)和基质诱导呼吸法(SIR)。CFE主要用于测定MBC，测定原理是利用浸提剂提取熏蒸前后土壤中有机碳的差值与MBC之间存在良好的相关性，经过熏蒸后，MBC能够被K₂SO₄溶液提取并被定量测定。CFE方法的步骤包括：在给定的培养条件下(温度25℃，土壤含水率40～50％)对新鲜土壤进行7～15d的预培养；样品经熏蒸24h、K₂SO₄溶液提取后，采用重铬酸钾氧化法测定溶液中的有机碳。该方法主要缺点是操作繁琐耗时，且土壤含水率、土壤质地及转换系数Kec等因素均会影响浸提速率从而影响其准确性。此外，氯仿是一种有毒的有机溶剂，对操作者有较大的安全隐患。

与CFE方法相比，SIR方法简单得多，测定原理是土壤微生物在添加诱导底物后会释放二氧化碳(CO₂)，当微生物量酶系统达到饱和时，CO₂的释放速率与微生物量的大小呈线性相关，可以快速测定SMB。SIR方法的步骤包括：将10～30g烘干土壤样品置于封闭的三角烧瓶中，加入葡萄糖溶液(6mg/L)，密封三角烧瓶并置于恒温振荡培养箱(25℃，培养1～4h)；培养结束后，用注射器抽取瓶中的气体样品并用气相色谱仪对其中的CO₂进行测定。SIR方法的最大问题是：在培养时间的选择上没有一个明确的定义，不同的土壤由于微生物生物量和群落结构上的差异，诱导呼吸率不同，在底物诱导呼吸时有着不同的停滞期，需要的培养时间也不尽相同。此外，SIR方法在测量CO₂上也存在问题，因为人工顶空采样和气相色谱注入都存在着较大的不确定性。

公开号为CN101210882A的发明专利申请公开了“一种测定土壤微生物生物量碳的方法”，具体的说是一种改进MBC的测定方法。土样采用熏蒸-浸提方法进行处理，用K₂SO₄溶液振荡浸提，采用重铬酸钾法测定。该发明通过改用消煮仪作为消煮加热仪器，消煮管代替消煮瓶盛装试样和试剂溶液，采用梯度升温的方式实现缓慢加热的目的。公开号为CN105277404A的发明专利申请公开了“测定土壤微生物生物量碳氮用氯仿熏蒸装置及熏蒸方法”，该发明提供了一种每次能够处理大量的土壤样品破真空方便且无需转移样品也能够完成浸提工艺的测定土壤微生物生物量碳氮用氯仿熏蒸装置及熏蒸方法。公开号为CN109916840A的发明专利申请公开了“一种测定土壤微生物生物量碳氮含量的方法”，该发明结合利用现有的土壤DNA提取技术和手段，设计出一种测量土壤微生物生物量碳氮含量的新方法。

以上现有的技术存在的不足：操作繁琐耗时；测定过程会使用到氯仿(有毒的有机溶剂)，具有较大的安全隐患。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的问题，提供一种高通量测定土壤微生物生物量的方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种基于顶空气相色谱高通量测定土壤微生物生物量的方法，利用基于SIR的HS-GC测定培养过程中产生的CO₂，来量化MBC的方法按下列步骤实现：

(1)样品预处理：土壤样品先除去可见的植物残体及土壤动物，然后自然晾干，过筛混匀；污泥样品需先自然晾干，再过筛混匀。

(2)样品密封培养：取步骤(1)中0.10～1.00g干土壤样品或干污泥样品于顶空瓶中，加入1～5mL葡萄糖溶液，立即密封并混匀，放入恒温振荡培养箱，培养箱条件为20～35℃、150～300r/min。

(3)建立标准曲线：准备一系列浓度的NaHCO₃标准溶液置于顶空瓶中，先对其进行密封，然后注射0.1～0.6mL H₂SO₄溶液，最后将顶空瓶置于顶空进样器中，设置顶空进样器操作条件以及气相色谱仪操作条件，HS-GC采用分批自动检测模式，对样品所产生的CO₂进行测定；根据所得到的CO₂色谱峰面积信号值与已知浓度的H₂SO₄溶液之间的对应关系绘制一条标准曲线，得到校准因子。

(4)样品检测：向步骤(2)中完成培养的顶空瓶加入0.5～3mL盐酸酸化并置于顶空进样器中，采用与步骤(3)中相同的顶空进样器操作条件以及气相色谱仪操作条件，对样品在不同培养时间内所产生的CO₂进行测定，记录样品的CO₂色谱峰面积信号值。

(5)结果计算：将步骤(4)中所得CO₂色谱峰面积信号值与步骤(3)所得的标准曲线进行比较，通过计算得出被检样品在SIR期间的呼吸速率；

通过下式计算出被检样品在SIR期间的呼吸速率：

上述公式中：

t₁和t₂分别为CO₂产量线性增加的两个时间点；

和

分别表示t₁和t₂时刻的CO₂产生量；

m是土壤样品在烘干基础上的质量；

基于HS-GC的SIR测量，通过下式计算MBC：

上述公式中：b为诱导呼吸对微生物量的转换系数，b值为3.4。

优选地，步骤(1)中所述过筛的规格为0.25～2mm。

优选地，步骤(2)中所述葡萄糖溶液浓度为0.50～2.00g/L。

优选地，步骤(3)中H₂SO₄溶液浓度为0.1～0.5mol/L。

优选地，步骤(3)中顶空进样器操作条件为：40～70℃强烈摇瓶1～6min，管路温度为50～100℃，传输线温度为50～100℃，顶空样品瓶中载气平衡时间为10～30S，管路充气时间10～30S，管路平衡时间1～10S，环路平衡时间10～30S。

优选地，步骤(3)中气相色谱仪操作条件是：使用GS-Q型毛细管色谱柱(30m×0.53mm)，色谱柱温度为30～150℃；载气(氮气)流量为2.0～6.0mL/min；热导检测器检测器温度为150～350℃。

优选地，步骤(4)中酸化采用盐酸这一无机酸，其加入体系后不会氧化有机物而产生CO₂，所述盐酸浓度为0.0005～0.005mol/L。

优选地，所述土壤为壤土，如褐土、红土；所述污泥为市政污泥超高温好氧堆肥发酵产物。

本发明利用HS-GC法，由于被检样品中的微生物在底物的诱导下呼吸而产生CO₂，根据测定CO₂色谱峰面积信号值可计算得出被检样品在SIR期间的呼吸速率，间接得出土壤或污泥中MBC，操作简单，分析结果准确度高。

首先，在足够氧气(O₂)的条件下，土壤中微生物在葡萄糖的诱导下进行呼吸，微生物的生长伴随着CO₂的产生，以CO₂的产生量表示被检样品中微生物在SIR期间的呼吸速率：

然后，使氯仿熏蒸萃取法(CFE)平行测定MBC测量，绘制SIR期间的呼吸速率CO₂(μlh^-1g^-1 soil)与MBC之间的关系曲线；结果显示，SIR期间的呼吸速率CO₂(μl h^-1g^-1soil)与MBC平方根之间存在良好线性关系，即：

CO₂(μl h^-1 g^-1 soil)＝b×√MBC(n＝18，R₂＝0.984)

基于HS-GC的SIR测量，通过下式计算MBC：

上述公式中：b为诱导呼吸对微生物量的转换系数，b值为3.4。

因此，被检样品在培养完成后，可以通过HS-GC测定培养过程中产生的CO₂来量化MBC。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

本发明利用HS-GC技术，测定密闭顶空瓶中土壤微生物通过SIR作用所产生的CO₂，培养过程中产生的CO₂量与MBC成正比，可以通过顶空瓶中CO₂来量化MBC，间接得出SMB总量。

首先，本发明涉及土壤中微生物生物量的测定方法，适用于不同土壤样品；其次，本发明不需要使用氯仿(有毒的有机溶剂)，符合绿色化学的宗旨；再次，本方法采用HS-GC方法，样品培养是在顶空瓶中进行的，可以大大降低顶空取样和GC注入的不确定性。

综上所述，该方法中顶空瓶实际上是样品培养的容器，不仅操作简单，测定速度快，且结果准确度高，本方法测定MBC的相对标准偏差小于10.3％；发明的方法与CFE法测定样品中MBC含量具有较好的一致性，相对标准偏差差的平均值为6.4％。

附图说明

图1为SIR期间的呼吸速率CO₂(μl h^-1g^-1 soil)与MBC(CFE)的关系；

图2为SIR期间的呼吸速率CO₂(μl h^-1g^-1 soil)与MBC(CFE)平方根的关系。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。

实施例1

一种基于顶空气相色谱高通量测定土壤微生物生物量的方法，包括以下步骤：

(1)样品预处理：供试褐土取自广西大学周边地区(N 22°51ˊ3.21″)，样品先除去可见的植物残体及土壤动物，然后自然晾干，过2mm筛；经检测，其基本理化性质为：pH＝8.1、有机质含量为85g/kg。

(2)样品密封培养：取步骤(1)中0.10g干土壤样品于顶空瓶中，加入1mL葡萄糖溶液(0.60g/L)，立即密封并混匀，放入恒温振荡培养箱，培养箱条件为25℃、150r/min。

(3)建立标准曲线：制备浓度为0.5mol/L的NaHCO₃标准溶液，并分别取0、20、50、100、200、400、600uL NaHCO₃标准溶液于顶空瓶中，先对其进行密封，然后注射0.2mL H₂SO₄溶液(0.1mol/L)，最后将顶空瓶置于顶空进样器中，设置顶空进样器操作条件以及气相色谱仪操作条件，HS-GC采用分批自动检测模式，对样品所产生的CO₂进行测定；根据所得到的CO₂色谱峰面积信号值与已知浓度的H₂SO₄溶液之间的对应关系绘制一条标准曲线，得到校准因子：

y＝685.51x+5087.6(R²＝0.9994)

顶空进样器操作条件：60℃强烈摇瓶2min，管路温度为70℃，传输线温度为80℃，顶空样品瓶中载气平衡时间为12S，管路充气时间12S，管路平衡时间3S，环路平衡时间12S。

气相色谱仪操作条件：使用GS-Q型毛细管色谱柱(30m×0.53mm)，色谱柱温度为30℃，载气(氮气)流量为3.8mL/min，热导检测器检测器温度为250℃。

(4)样品检测：将步骤(2)中完成培养的顶空瓶置于顶空进样器中，加入1mL0.005mol/L盐酸酸化，采用与步骤(3)中相同的顶空进样器操作条件以及气相色谱仪操作条件，对样品在不同培养时间内所产生的CO₂进行测定，记录样品的CO₂色谱峰面积信号值。

(5)结果计算：将步骤(4)中所得CO₂色谱峰面积信号值与步骤(3)所得的标准曲线进行比较，通过下式计算出被检样品在SIR期间的呼吸速率：

上述公式中：

t₁和t₂分别为CO₂产量线性增加的两个时间点；

和

分别表示t₁和t₂时刻的CO₂产生量；

m是土壤样品在烘干基础上的质量。

然后，使氯仿熏蒸萃取法平行测定MBC测量，绘制SIR期间的呼吸速率CO₂(μl h^-1g^-1soil)与MBC之间的关系曲线；结果显示，SIR期间的呼吸速率CO₂(μl h^-1g^-1 soil)与MBC平方根之间存在良好线性关系，即：

CO₂(μl h^-1g^-1 soil)＝b×√MBC(n＝18，R₂＝0.984)

基于HS-GC的SIR测量，通过下式计算MBC：

上述公式中：b为诱导呼吸对微生物量的转换系数，b值为3.4。

实施例2～5检测各种样品

实施例2～5分别对不同的样品进行检测，各检测工艺条件如表1所示，其他未列出操作同实施例1。

表1实施例2～5各样品的检测条件

对比例1～3

对比例1～3的各检测工艺条件如表2所示，其他未列出操作同实施例1。

表2对比例1～3的工艺条件

检测结果分析：

检测结果如表3所示，从表3可知，基于HS-GC的SIR法测定MBC的相对标准偏差小于10.3％，因此，可认为操作检测参数条件在本方法范围内具有较好的检测优势。但从对比例1～3可知，若操作检测参数条件不在本方法的范围内，该方法将无法发挥对土壤或污泥样品的检测优势，具体表现为相对标准偏差大于15％。

表3各实施例和对比例的MBC检测结果

准确性验证

将过2mm筛的一组不同的土壤和污泥样品，分别采用本发明的方法以及CFE法测定样品中MBC含量，进行了对比研究。

表4列出了这两种方法的结果。结果表明，两种方法具有较好的一致性，相对标准偏差差的平均值为6.4％。因此，本方法可作为测定样品中MBC含量的替代方法。

表4基于HS-GC的SIR法与CFE法测定样品中MBC含量的结果对比

本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)等”是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的实施例能够除了在这里图示或描述的内容以外的顺序实施。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种基于顶空气相色谱高通量测定土壤微生物生物量的方法，其特征在于，利用基于SIR的HS-GC测定培养过程中产生的CO₂来量化MBC，该方法按下列步骤实现：

(1)样品预处理：土壤样品先除去可见的植物残体及土壤动物，然后自然晾干，过筛混匀；污泥样品先自然晾干，再过筛混匀；

(2)样品密封培养：取步骤(1)中0.10～1.00g干土壤样品或干污泥样品于顶空瓶中，加入1～5mL葡萄糖溶液，立即密封并混匀，放入恒温振荡培养箱，培养箱条件为20～35℃、150～300r/min；

(3)建立标准曲线：准备一系列浓度的NaHCO₃标准溶液置于顶空瓶中，先对其进行密封，然后注射0.1～0.6mL H₂SO₄溶液，最后将顶空瓶置于顶空进样器中，设置顶空进样器操作条件以及气相色谱仪操作条件，HS-GC采用分批自动检测模式，对样品所产生的CO₂进行测定；根据所得到的CO₂色谱峰面积信号值与已知浓度的H₂SO₄溶液之间的对应关系绘制一条标准曲线，得到校准因子；

(4)样品检测：向步骤(2)中完成培养的顶空瓶加入0.5～3mL盐酸酸化并置于顶空进样器中，采用与步骤(3)中相同的顶空进样器操作条件以及气相色谱仪操作条件，对样品在不同培养时间内所产生的CO₂进行测定，记录样品的CO₂色谱峰面积信号值；

(5)结果计算：将步骤(4)中所得CO₂色谱峰面积信号值与步骤(3)所得的标准曲线进行比较，通过计算得出被检样品在SIR期间的呼吸速率；

通过下式计算出被检样品在SIR期间的呼吸速率：

呼吸速率的单位为μlh^-1g^-1 soil；

上述公式中：

t₁和t₂分别为CO₂产量线性增加的两个时间点；

和

分别表示t₁和t₂时刻的CO₂产生量；

m是土壤样品在烘干基础上的质量；

首先，在足够氧气O₂的条件下，土壤中微生物在葡萄糖的诱导下进行呼吸，微生物的生长伴随着CO₂的产生，以CO₂的产生量表示被检样品中微生物在SIR期间的呼吸速率：

然后，使氯仿熏蒸萃取法CFE平行测定MBC测量，绘制SIR期间的呼吸速率CO₂与MBC之间的关系曲线；结果显示，SIR期间的呼吸速率CO₂与MBC平方根之间存在良好线性关系，即：

n＝18，R²＝0.984

基于HS-GC的SIR测量，通过下式计算MBC：

2.根据权利要求1所述基于顶空气相色谱高通量测定土壤微生物生物量的方法，其特征在于，步骤(1)中所述过筛的规格为0.25～2mm。

3.根据权利要求1所述基于顶空气相色谱高通量测定土壤微生物生物量的方法，其特征在于，步骤(2)中所述葡萄糖溶液浓度为0.50～2.00g/L。

4.根据权利要求1所述基于顶空气相色谱高通量测定土壤微生物生物量的方法，其特征在于，步骤(3)中H₂SO₄溶液为0.1～0.5mol/L。

5.根据权利要求1所述基于顶空气相色谱高通量测定土壤微生物生物量的方法，其特征在于，步骤(3)中所述HS-GC分批自动检测的顶空进样器操作条件为：40～70℃强烈摇瓶1～6min，管路温度为50～100℃，传输线温度为50～100℃，顶空样品瓶中载气平衡时间为10～30S，管路充气时间10～30S，管路平衡时间1～10S，环路平衡时间10～30S；

气相色谱仪操作条件是：使用GS-Q型毛细管色谱柱30m×0.53mm，色谱柱温度为30～150℃，载气为氮气，载气流量为2.0～6.0mL/min，热导检测器温度为150～350℃。

6.根据权利要求1所述基于顶空气相色谱高通量测定土壤微生物生物量的方法，其特征在于，步骤(4)中所述盐酸浓度为0.0005～0.005mol/L。

7.根据权利要求1所述基于顶空气相色谱高通量测定土壤微生物生物量的方法，其特征在于，所述土壤类型为壤土，包括褐土、红土；所述污泥为市政污泥超高温好氧堆肥发酵产物。

Images