CN112538507B - 复杂序列壳二糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于海洋生物工程技术领域，具体涉及一种复杂序列壳二糖的制备方法。具有特定脱乙酰基模式的几丁质脱乙酰酶与几丁二糖于缓冲体系内进行酶反应，而后脱盐、浓缩冻干，即得复杂序列壳二糖；其中，具有特定脱乙酰基模式的几丁质脱乙酰酶为通过重组表达获得的NodB或VcCOD。本发明使用具有单点脱乙酰模式的几丁质脱乙酰酶对几丁二糖进行温和的酶解反应，避免了副产物的产生和对环境的污染，该方法简便快速。

Description

复杂序列壳二糖的制备方法
技术领域
本发明属于海洋生物工程技术领域，具体涉及一种复杂序列壳二糖的制备方法。
背景技术
壳寡糖，是一种由D-氨基葡萄糖(GlcN)和N-乙酰-D氨基葡萄糖(GlcNAc)通过β-1,4糖苷键连接而成的线性寡糖。壳寡糖被发现具有多种生理活性，如抗肿瘤，抗菌，抗炎，抗氧化，促生长，调节血糖血脂，活化肠道菌群等。壳寡糖的活性与其结构密切相关，如聚合度DP、乙酰度DA、乙酰化模式PA等。目前壳寡糖的活性研究一般采用的都是混合物，很难知道具体是哪个或哪些分子在发挥作用，进而很难研究其生物机制。而且壳寡糖的生物活性不仅仅依赖于其聚合度和乙酰度，还受其序列的影响。目前已有报道证明同一聚合度，不同的异构体对促进血管生成的作用不同。因此壳寡糖的研究不再仅仅局限于聚合度和乙酰度，得到确定序列的壳寡糖对研究壳寡糖的生物活性机制十分必要。目前几丁二糖和壳二糖可以分离纯化得到，复杂序列壳二糖只能通过化学合成方法获知其活性，但糖链合成需要进行大量的羟基、氨基保护和脱保护反应，步骤非常复杂，产率很低。
发明内容
本发明的目的是提供一种复杂序列壳二糖的制备。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种复杂序列壳二糖的制备方法，具有特定脱乙酰基模式的几丁质脱乙酰酶与几丁二糖于缓冲体系内进行酶反应，而后脱盐、浓缩冻干，即得复杂序列壳二糖；其中，具有特定脱乙酰基模式的几丁质脱乙酰酶为通过重组表达获得的NodB或VcCOD。
所述具有特定脱乙酰基模式的几丁质脱乙酰酶NodB和几丁二糖于缓冲体系内进行酶反应，在30-40℃下反应时间10-24h，脱盐后浓缩冻干，即得复杂序列壳二糖GlcN-GlcNAc，结构式如下:
Figure BDA0002829980580000011
其中，缓冲体系中NodB和几丁二糖的质量比例为1:20-1:30；
所述缓冲体系为15-25mM的Mops、8-10mM的DTT和0.5-1.5mM的MnSO4，pH 6-8。
所述具有特定脱乙酰基模式的几丁质脱乙酰酶VcCOD分别与几丁二糖或复杂序列壳二糖GlcN-GlcNAc混合后于10mM-20mM碳酸氢铵缓冲液，pH6-8，在30-40℃、反应10-24h，脱盐后浓缩冻干，即得复杂序列壳二糖；
其中，原料为几丁二糖获得复杂序列壳二糖GlcNAc-GlcN，结构式如下：
Figure BDA0002829980580000021
原料为复杂序列壳二糖GlcN-GlcNAc获得复杂序列壳二糖GlcN-GlcN，结构式如下：
Figure BDA0002829980580000022
其中，缓冲体系中VcCOD分别与几丁二糖或复杂序列壳二糖GlcN-GlcNAc的质量比例为1:20-1:30。
上述其中NodB作用于壳寡糖链非还原端第一位的乙酰基，VcCOD作用于壳寡糖链非还原端第二位的乙酰基。然后将两种脱乙酰酶作用于原料几丁二糖GlcNAc-GlcNAc，NodB单独作用得到GlcN-GlcNAc，VcCOD单独作用得到GlcNAc-GlcN，同时作用得到GlcN-GlcN，得到的样品再经脱盐柱脱盐后浓缩。
所述具有特定脱乙酰基模式的几丁质脱乙酰酶通过重组表达、分离纯化具体为合成脱乙酰酶NodB或VcCOD的基因质粒，将其转入感受态细胞中，而后震荡培养，待OD600值为0.4-1.2，将体系温度降至15-18℃，加入诱导剂IPTG诱导15-24h，离心收集菌体，破碎细胞，离心分离上清，收集上清液经镍柱纯化蛋白，待用。
所述感受态细胞为BL21(DE3)，所述抗生素为氨苄青霉素钠。
所述脱盐为将反应物通过洗脱液对其进行脱盐柱进行处理；洗脱液为纯净水。所述脱盐柱Sephadex G10，流速0.2-0.4ml/min。
所述脱盐柱色谱填料为凝胶排阻填料，例如Sephadex G10、Bio gel P2等。
本发明所具有的优点：
1.本发明使用具有单点脱乙酰模式的几丁质脱乙酰酶对几丁二糖进行温和的酶解反应，避免了副产物的产生和对环境的污染，该方法简便快速。
2.本发明制备的二糖通过重组表达蛋白的方法可获得更高聚合度不同序列壳寡糖单体，该方法对壳寡糖的进一步活性筛选及活性机制的阐明具有重要的意义；其中，重组表达蛋白采用低温诱导，避免了蛋白的包涵体存在形式，纯化出纯蛋白并保证了其活性和反应条件。
附图说明
图1为本发明实施例提供的得到的复杂序列壳二糖GlcNAc-GlcN的质谱图；其中，A为一级质谱，B为AMAC标记后分子离子峰576的二级裂解片段,GlcN-amac：179+194+1＝374。
图2为本发明实施例提供的得到的复杂序列壳二糖GlcN-GlcNAc的质谱图；其中，A为一级质谱，B为AMAC标记后分子离子峰576的二级裂解片段,GlcNAc-amac：221+194+1＝416。
图3为本发明实施例提供的得到的复杂序列壳二糖GlcN-GlcN的质谱图。
具体实施例
下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。
实施例1
具有特定脱乙酰基模式的几丁质脱乙酰酶的构建：
NodB质粒的构建:
按现有方法，对根瘤菌GRH2(NCBI acc.No.AJW76244.1)以及基础载体pET-22b(+)的克隆位点NdeI/XhoI进行酶切，而后通过T4将其连接，即获得几丁质脱乙酰酶NodB质粒；其表达的蛋白可作用于壳寡糖链非还原端第一位的乙酰基。
VcCDA质粒的构建:
按现有方法，对霍乱弧菌(NCBI acc.No.AAF94439.1)以及基础载体pET-22b(+)的克隆位点SalI/Xho进行酶切，而后通过T4将其连接，即获得几丁质脱乙酰酶VcCDA质粒；其表达的蛋白可作用于壳寡糖链非还原端第二位的乙酰基。
上述两个质粒均是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例1
在BL21(DE3)感受态细胞中加入上述NodB质粒(NCBI acc.No.AJW76244.1，克隆位点NdeI/XhoI，载体是pET-22b(+)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)3μL，37℃震荡培养2h以上，测OD600值为0.6左右，而后将温度降至16℃，转速降低至120rpm，加入IPTG，使终浓度为0.1mM，诱导15h。离心收集菌体，破碎细胞，于4℃12000rpm离心20min，收集上清过镍柱纯化蛋白，获得纯化后NodB蛋白。
所述过镍柱条件：纯化前，使用0.22uM的滤器过滤上清，注入10倍柱体积的Binding buffer平衡镍柱，注入经滤器过滤了的上清，注入10倍柱体积的Washing buffer洗去杂蛋白，注入2.5倍柱体积的Elution buffer，收集流出液即为蛋白。
其中：
Binding buffer：50mM Tris，150mM NaCl,pH 8.0；
Washing Buffer：50mM Tris，150mM NaCl，20mM咪唑，pH＝8.0；
Elution Buffer：50mM Tris，150mM NaCl，250mM咪唑，pH＝8.0。
1mg几丁二糖和50ug上述获得纯化NodB蛋白于300ul缓冲体系中37℃反应20小时。反应结束后经脱盐柱Sephadex G10脱盐，洗脱液为纯净水，流速是0.5ml/min，10min收集一管，糖组分在45-52管中，盐组分在52管后，将上述获得糖组分通过真空冷冻干燥机浓缩冷冻干燥，得到壳二糖GlcN-GlcNAc。
所述缓冲体系为20mM的Mops、10mM的DTT和1mM的MnSO4，pH 6-8。
实施例2
在BL21(DE3)感受态细胞中加入上述VcCOD质粒3μL，37℃震荡培养2h以上，测OD600值为0.6左右，而后将温度降至16℃，转速降低至120rpm，加入IPTG，使终浓度为0.1mM，诱导15h。离心收集菌体，超声20min破碎细胞，分离上清，于4℃12000rpm离心20min，收集上清液过镍柱纯化蛋白，获得纯化后VcCOD蛋白。
1mg几丁二糖和50ug上述获得纯化VcCOD蛋白于500ul碳酸氢铵缓冲液中37℃反应20小时，反应结束后经脱盐柱Sephadex G10脱盐，洗脱液为纯净水，流速是0.5ml/min，10min收集一管，糖组分在45-52管中，盐组分在52管后，将上述获得糖组分通过真空冷冻干燥机浓缩冷冻干燥，得到壳二糖GlcNAc-GlcN。
所述碳酸氢铵缓冲液为10mM的碳酸氢铵缓冲液。
实施例3
将上述实施例1得到的1mg壳二糖GlcN-GlcNAc和50ug上述获得纯化后VcCOD蛋白于500ul碳酸氢铵缓冲液中37℃反应20小时，反应结束后经脱盐柱Sephadex G10脱盐，洗脱液为纯净水，流速是0.5ml/min，10min收集一管，糖组分在45-52管中，盐组分在52管后，将上述获得糖组分通过真空冷冻干燥机浓缩冷冻干燥，得到壳二糖GlcN-GlcN。
对上述实施例获得壳二糖分别采用质谱AMAC进行标记检测分子量序列；并通过AMAC标记法和二级质谱结合以解读糖链序列，具体为：
1mg上述实施例获得糖分别溶于20ulAMAC溶液混匀，加入20ul氰基硼氢化钠溶液，摇匀，将反应液90℃水浴，避光反应30min，冻干，进行一级质谱表征和分子离子峰二级质谱分析(参见图1-3)。
由图1-3可见，图1的复杂序列壳二糖GlcNAc-GlcN的质谱图中，A为一级质谱，AD的分子离子峰为383。证明几丁二糖确实脱掉了一个乙酰基，B为AMAC标记后分子离子峰576的二级裂解片段,AMAC标记于糖链的还原端，AMAC分子量194Da，对标记后的分子离子峰576(382+194)裂解。GlcNAc-GlcN裂解后片段为GlcN-amac：179+194+1＝374。说明还原端是一个GlcN，由此可推断另一个碎片是位于非还原端的GlcNAc。即序列是AD。
图2复杂序列壳二糖GlcN-GlcNAc的质谱图中，A为一级质谱，DA的分子离子峰为383。证明几丁二糖确实脱掉了一个乙酰基，B为AMAC标记后分子离子峰576的二级裂解片段,AMAC标记于糖链的还原端，AMAC分子量194Da，对标记后的分子离子峰576(382+194)裂解。GlcN-GlcNAc裂解后片段为GlcNAc-amac：221+194+1＝416。说明还原端是一个GlcNAc，由此可推断另一个碎片是位于非还原端的GlcN。即序列是DA。
图3复杂序列壳二糖GlcN-GlcN的一级质谱图。

Claims (2)

1.一种复杂序列壳二糖的制备方法，其特征在于：
具有特定脱乙酰基模式的几丁质脱乙酰酶NodB和几丁二糖于缓冲体系内进行酶反应，在30-40℃下反应时间10-24h，脱盐后浓缩冻干，即得复杂序列壳二糖GlcN-GlcNAc，结构式如下:
Figure FDA0003712515830000011
其中，缓冲体系中NodB和几丁二糖的质量比例为1:20-1:30；所述缓冲体系为15-25mM的Mops、8-10mM的DTT和0.5-1.5mM的MnSO4，pH 6-8；
具有特定脱乙酰基模式的几丁质脱乙酰酶VcCOD与复杂序列壳二糖GlcN-GlcNAc混合后于10mM-20mM碳酸氢铵缓冲液，pH 6-8，在30-40℃、反应10-24h，脱盐后浓缩冻干，即得复杂序列壳二糖；
其中，原料为复杂序列壳二糖GlcN-GlcNAc获得复杂序列壳二糖GlcN-GlcN，结构式如下：
Figure FDA0003712515830000012
其中，缓冲体系中VcCOD与复杂序列壳二糖GlcN-GlcNAc的质量比例为1:20-1:30；
具有特定脱乙酰基模式的几丁质脱乙酰酶通过重组表达、分离纯化具体为合成脱乙酰酶NodB或VcCOD的基因质粒，将其转入感受态细胞中，而后震荡培养，待OD600值为0.4-1.2，将体系温度降至15-18℃，加入诱导剂IPTG诱导15-24h，离心收集菌体，破碎细胞，离心分离上清，收集上清液经镍柱纯化蛋白，待用,其中脱乙酰酶NodB NCBI acc.No.AJW76244.1，脱乙酰酶VcCOD NCBI acc.No.AAF94439.1；
所述脱盐柱色谱填料为凝胶排阻填料。
2.按权利要求1所述的复杂序列壳二糖的制备方法，其特征在于：所述脱盐为将反应物通过脱盐柱进行处理；洗脱液为纯净水。
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