CN112535759B - 一种微/纳米分级多孔微球及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微/纳米分级多孔微球及其制备方法与应用。制备方法包括如下步骤：(1)制备甲壳素纳米纤维与壳聚糖的混合溶液；(2)制备Pickering乳液；(3)制备微/纳米分级多孔微球。本发明的制备方法简单，反应条件温和，成本低廉，制备的微球通过控制外表面孔隙大小防止红细胞和血小板进入微球，实现缩短创面止血时间，促进创面修复；微球孔壁由甲壳素纳米纤维连结，可模拟血管组织内皮下基质中的胶原纤维形态，粘附并激活血小板，利于加速止血，且有效吸附创面血液，保持创面干燥；壳聚糖与血液接触时，其聚阳离子的结构以及其分子与细胞膜之间的结合力使全血凝结，加速止血过程，同时抑制创面感染和促进细胞增殖。

Description

一种微/纳米分级多孔微球及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及新型医用止血材料技术领域，特别涉及一种微/纳米分级多孔微球及其制备方法与应用。

背景技术

创面大出血是军事行动、交通事故和外科手术中主要的死亡原因。在大出血造成的死亡中，约50％为军队的战斗死亡，约15-25％为平民医院的创伤。严重的伤口容易造成感染，损害自然愈合过程，甚至会导致危及生命的败血症。因此，快速止血不仅是初期生存的必要策略，也是最理想的恢复手段。目前，常用的止血材料有明胶、淀粉、二氧化硅、水凝胶、纤维素海绵、纳米纤维等。市面上也有许多止血产品，然而这些产品的疗效存在显著差异，且尚未经过严格的临床试验评估。据报道，其中一些产品在严重出血时使用会形成感染和脓肿，使组织愈合复杂化。因此，开发具有良好抗菌性能且能快速止血并促进创面组织修复的新型止血材料，具有重要的科学研究意义和临床实用价值。

甲壳素(Chitin，Ch)是一种具有纳米级纤维形态和优异材料性能的半结晶生物聚合物，广泛存在于节肢动物的外骨骼中，但大多数甲壳素原料通常作为工业废弃物被丢弃。纳米纤维通常定义为直径小于100纳米，纵横比大于100的纤维，具有极高的表面体积比并能形成高度多孔的网状结构。由于生物聚合物具有生物降解性、生物相容性、可再生性和可持续性等环保功能，因此，利用生物聚合物产生纳米纤维成为一项重要的研究课题。

壳聚糖(Chitosan，CS)，又称脱乙酰甲壳素，是由甲壳素经过脱乙酰而得到，在自然界中的产量仅次于植物纤维素。壳聚糖在与血液接触时可以使全血凝结成为血块，主要是由于它的聚阳离子的结构以及其分子与细胞膜之间的结合力，这使得它可作为良好的止血材料。此外，壳聚糖廉价、无毒、抗菌、可酶降解、易于加工等优点使其在构建组织工程支架、药物控释载体以及创面止血修复方面得到广泛的应用。

在现有的各类止血材料中，止血材料的主要性状有织物状、海绵状、无纺布、水凝胶以及粉末状。除粉末状以外的其它性状止血材料大多只适用于牙科和外科，难以在生命意外和军事事件中及时发挥作用，特别是对一些头部、颈部、胸部、腹部和躯干等不可按压的敏感伤口时，效果更是难以提高。而粉末状材料能则能有效解决上述问题，其具有便于携带，使用简便，快速实现创面的血液吸附，保持创面的干燥性，从而加速止血、促进修复的优点。

基于以上，本申请发明人提供了一种具有快速吸液、抑制创面感染、促进创面修复的分级多孔的CS/Ch止血微球状止血粉。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种微/纳米分级多孔微球的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的微/纳米分级多孔微球。

本发明的再一目的在于提供上述微/纳米分级多孔微球的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种微/纳米分级多孔微球的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备甲壳素纳米纤维与壳聚糖的混合溶液(CS/Ch混合溶液)

将纳米纤维长度为20-200nm的甲壳素纳米纤维悬浮液与壳聚糖溶液混合，均质，得到混合溶液；

(2)制备Pickering乳液

将步骤(1)得到的混合溶液与有机相混合，均质，得到Pickering乳液；

(3)制备微/纳米分级多孔微球

将步骤(2)得到的Pickering乳液采用高压静电液滴喷射技术形成微液滴，接收，脱水去油，干燥，获得微/纳米分级多孔微球。

步骤(1)中所述甲壳素纳米纤维悬浮液为酸性条件下将浓度为0.5～2.0wt％的甲壳素水溶液搅拌、研磨和均质后得到。

所述酸性条件下的pH通过乙酸溶液调节，pH为1～6；优选为3～4。

所述的乙酸溶液的体积比为1％。

所述的搅拌的时间为12～48h；优选为24h。

所述研磨的条件：研磨压力150～400MPa、研磨次数20～60times；优选为研磨压力200MPa、研磨次数20times。

所述均质的条件：转速8000～15000rpm、分散时间0.5～2h；优选为转速13000rpm、分散时间0.5h。

步骤(1)中所述甲壳素纳米纤维悬浮液中甲壳素纳米纤维长度为20～200nm。

步骤(1)中所述壳聚糖溶液的浓度为2.0～5.0wt％。

步骤(1)中所述壳聚糖溶液为溶于乙酸溶液后搅拌至完全溶解得到。

所述乙酸溶液的浓度为体积比1％～2％。

步骤(1)中所述甲壳素纳米纤维悬浮液与所述壳聚糖溶液的用量为体积比1:1-3:1；优选为体积比1:1。

步骤(1)中所述均质的条件：转速8000～15000rpm，分散时间0.5～2h。

步骤(2)中所述有机相为不溶于水的任意有机溶剂。

步骤(2)中所述混合溶液与所述的有机相的体积比为30～50：50～70；优选为体积比为40～50：50～60。

步骤(2)中所述均质为7000～20000rpm转速条件下为均质10～60min；优选为7000～15000rpm转速条件下均质20～30min。

步骤(3)中所述高压静电液滴喷射技术的参数为：注射器20mL，21～24号针头，电压为10～20kV，接收距离为5～15cm，纺丝液流速为2～8mL/h，纺丝温度为20～30℃，湿度为30％～50％。

步骤(3)中所述接收的凝固浴为质量比1％～3％的氢氧化钠溶液。

步骤(3)中所述脱水去油为依次用体积比为20～100％的乙醇溶液进行梯度脱水去油；优选为依次用体积比为20％、40％、60％、80％和100％的乙醇溶液进行梯度脱水去油。

步骤(3)中所述干燥优选为冷冻干燥。

所述冷冻干燥的时间为24～48h。

所述的冷冻干燥的温度为-80～-40℃。

一种微/纳米分级多孔微球，通过上述微/纳米分级多孔微球的制备方法得到。

上述微/纳米分级多孔微球在制备止血粉中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明的制备方法简单，反应条件温和，成本低廉，制备的微/纳米分级多孔微球可通过控制外表面孔隙大小，以防止红细胞和血小板进入微球，从而实现缩短创面止血时间，促进创面修复；具有良好的吸附性能，在伤口修复期间不易滑落，能较好的黏附在创口表面，从而降低外界微生物对伤口感染的可能性。

2、高比表面积和高孔隙率的甲壳素纳米纤维在Pickering乳液中作为表面活性剂，能有效稳定乳液；微/纳米分级多孔微球孔壁由甲壳素纳米纤维连结，可以模拟血管组织内皮下基质中的胶原纤维形态，粘附并激活血小板，有利于加速止血；甲壳素纳米纤维能够为微/纳米分级多孔微球提供有效的吸液能力，有效吸附创面血液，保持创面干燥。

3、本发明的微/纳米分级多孔微球中，壳聚糖与血液接触时，其聚阳离子的结构以及其分子与细胞膜之间的结合力可以使全血凝结成为血块，加速止血过程，同时，壳聚糖良好的抗菌性能有效抑制创面感染，生物相容性能促进细胞的黏附和增殖。

附图说明

图1是不同浓度的甲壳素纳米纤维制备的Pickering乳液照片图；其中，a为新鲜制备的乳液，b和c为室温下储存一周后的乳液。

图2是CS/Ch混合溶液与有机相制备的Pickering乳液照片图；其中，比例为有机相的占比，a为新鲜制备的乳液，b和c为室温下储存一周后的乳液。

图3是高压静电液滴喷射得到的微/纳米分级多孔微球的照片图。

图4是实施例11-14的微/纳米分级多孔微球的SEM图；其中，a、b、c、d为表面图，a1、b1、c1、d1截面图。

图5是微/纳米分级多孔微球的全血凝固测试结果图。

图6是微/纳米分级多孔微球的止血实验结果图；其中，a为大鼠截尾模型的实验结果，b为大鼠肝裂模型的实验结果。

图7为微/纳米分级多孔微球处理伤口后的H&E组织学分析结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。甲壳素与壳聚糖(分子量为30000)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

实施例1甲壳素纳米纤维与壳聚糖的混合溶液(CS/Ch)的制备

将一定质量的甲壳素加入离子水中，配制成浓度为0wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.5wt％、1.0wt％的甲壳素溶液，加入体积比1％的醋酸溶液调pH值为3～4，搅拌24h，经研磨机研磨，研磨压力为200MPa，研磨次数为50times，后经高速均质机分散，转速为10000rpm，均质时间为1h，得到稳定、均一的甲壳素纳米纤维悬浮液。取一定质量壳聚糖粉末加入体积比为1％的醋酸溶液中，壳聚糖溶液浓度为2.0wt％，机械搅拌直至壳聚糖完全溶解。取相同体积的甲壳素纳米纤维悬浮液和壳聚糖溶液，混合，经高速均质机进行均质，均质转速为8000rpm，均质时间为1h，得到混合溶液。

实施例2甲壳素纳米纤维与壳聚糖的混合溶液的制备

将一定质量的甲壳素加入离子水中，配制成浓度为0.2wt％的甲壳素溶液，加入体积比1％的醋酸溶液调pH值为3～4，搅拌24h，经研磨机研磨，研磨压力为300MPa，研磨次数为30times，后经高速均质机分散，转速为9000rpm，均质时间为1.5h，得到稳定、均一的甲壳素纳米纤维悬浮液(纤维长度为100nm)。取一定质量壳聚糖粉末加入体积比为2％的醋酸溶液中，壳聚糖溶液浓度为3.0wt％，机械搅拌直至壳聚糖完全溶解。取相同体积的甲壳素纳米纤维悬浮液和壳聚糖溶液，混合，经高速均质机进行均质，均质转速为10000rpm，均质时间为0.5h，得到混合溶液。

实施例3甲壳素纳米纤维与壳聚糖的混合溶液的制备

将一定质量的甲壳素加入离子水中，配制成浓度为0.5wt％的甲壳素溶液，加入体积比1％的醋酸溶液调pH值为3～4，搅拌24h，经研磨机研磨，研磨压力为400MPa，研磨次数为40times，后经高速均质机分散，转速为12000rpm，均质时间为2h，得到稳定、均一的甲壳素纳米纤维悬浮液(纤维长度为50nm)。取一定质量壳聚糖粉末加入体积比为2％的醋酸溶液中，壳聚糖溶液浓度为3.0wt％，机械搅拌直至壳聚糖完全溶解。取相同体积的甲壳素纳米纤维悬浮液和壳聚糖溶液，混合，经高速均质机进行均质，均质转速为8000rpm，均质时间为1.5h，得到混合溶液。

实施例4甲壳素纳米纤维与壳聚糖的混合溶液的制备

取一定质量的甲壳素粉末加入至去离子水中，配置成浓度为1.0wt％的甲壳素溶液，加入体积比1％的醋酸溶液调pH值为3～4，室温搅拌24h，经研磨机研磨，研磨压力为200MPa，研磨次数为20times，后经高速均质机分散，转速为13000rpm，均质时间为0.5h，得到稳定、均一的甲壳素纳米纤维悬浮液(纤维长度为20nm)；取一定质量壳聚糖粉末加入体积比为1％的醋酸溶液中，浓度为4.0wt％，室温条件下机械搅拌直至壳聚糖完全溶解即为壳聚糖溶液。取相同体积的甲壳素纳米纤维悬浮液和壳聚糖溶液，混合，经高速均质机进行均质，均质转速为8000rpm，均质时间为30min，得到混合溶液。

实施例5 Pickering乳液的制备

调控实施例1制备的甲壳素纳米纤维及壳聚糖混合溶液与橄榄油的比例为40：60，经高压均质机进行均质，转速为8000rpm，时间为20min，得到稳定均一的乳白色状Pickering乳液。

乳液见图1，可以看出当甲壳素纳米纤维浓度为0wt％(纯CS)、0.1wt％和0.2wt％时，Pickering乳液完全失稳，这是由于界面上吸附的纳米纤维和水相中未吸附的溶液不足以形成围绕橄榄油液滴形成牢固的三维网络，从而最终导致Pickering乳液在倒置瓶子中的流动。而当甲壳素纳米纤维浓度达到或高于0.5wt％时，会形成均匀稳定的O/W型Pickering乳液。这是因为当甲壳素纳米纤维到达一定浓度时其自身可以作为一种表面活性剂，这种纳米纤维结构在油水界面分布，能将油相或者水相包裹在内，相当于形成一层致密的膜对乳液进行包裹，从而达到稳定乳液的目的。

实施例6 Pickering乳液的制备

调控实施例4制备的混合溶液(甲壳素纳米纤维和壳聚糖)与橄榄油的比例为体积比5：95，经均质机进行均质，转速为15000rpm，时间为30min，得到稳定均一的乳白色状Pickering乳液。

实施例7 Pickering乳液的制备

调控实施例4制备的混合溶液(甲壳素纳米纤维和壳聚糖)与橄榄油的比例为体积比20：80，经均质机进行均质，转速为13000rpm，时间为20min，得到稳定均一的乳白色状Pickering乳液。

实施例8 Pickering乳液的制备

调控实施例4制备的混合溶液(甲壳素纳米纤维和壳聚糖)与橄榄油的比例为体积比30：70，经高压均质机进行均质，转速为10000rpm，时间为30min，得到稳定均一的乳白色状Pickering乳液。

实施例9 Pickering乳液的制备

调控实施例4制备的甲壳素纳米纤维及壳聚糖混合溶液与橄榄油的比例为40：60，经高压均质机进行均质，转速为8000rpm，时间为20min，得到稳定均一的乳白色状Pickering乳液。

实施例10 Pickering乳液的制备

将实施例4制备的甲壳素纳米纤维及壳聚糖混合溶液与橄榄油的比例控制在50：50，经高压均质机进行均质，转速为8000rpm，时间为20min，得到稳定均一的乳白色状Pickering乳液。

实施例6-10得到的有机相组分为50％～95％的乳液见图2，显然，在有机相占比为50～60％的情况下，得到了稳定的Pickering乳液，在贮藏1周后仍保持稳定，乳液处在半固态状态。然而在油相比>60％时，会导致完全的相分离，乳液出现明显分层现象，这说明能保持乳液稳定的最大油相比约为60％。

将实施例2和3制备的甲壳素纳米纤维及壳聚糖混合溶液采用实施例10的相同方法得到的乳液同样呈稳定均一的乳白色状Pickering乳液。

实施例11微/纳米分级微球的制备

采用高压静电液滴喷射技术，将实施例4制备的壳聚糖溶液加入到20mL注射器中，实验采用21号针头，电压为15kV，接收距离为10cm，纺丝液流速为6mL/h，纺丝温度为26℃，湿度为45％，接收的凝固浴为质量比为2％的氢氧化钠溶液。然后分别用体积比20～100％的乙醇溶液进行梯度脱水去油处理(依次用体积比为20％、40％、60％、80％和100％的乙醇进行梯度脱水处理)，-40℃冷冻干燥24h，获得微/纳米分级多孔微球。

实施例12微/纳米分级多孔微球的制备

采用高压静电液滴喷射技术，将实施例4制备的混合溶液加入到20mL注射器中，实验采用22号针头，电压为17kV，接收距离为12cm，纺丝液流速为8mL/h，纺丝温度为26℃，湿度为45％，接收的凝固浴为质量比为2％的氢氧化钠溶液。然后分别用体积比20～100％的乙醇溶液进行梯度脱水去油处理(依次用体积比为20％、40％、60％、80％和100％的乙醇进行梯度脱水处理)，-60℃冷冻干燥24h，获得微/纳米分级多孔微球。

实施例13微/纳米分级多孔微球的制备

采用高压静电液滴喷射技术，将实施例8制备的乳液加入到20mL注射器中，实验采用23号针头，电压为12kV，接收距离为14cm，纺丝液流速为4mL/h，纺丝温度为26℃，湿度为45％，接收的凝固浴为质量比为2％的氢氧化钠溶液。然后分别用体积比20～100％的乙醇溶液进行梯度脱水去油处理(依次用体积比为20％、40％、60％、80％和100％的乙醇进行梯度脱水处理)，-50℃冷冻干燥24h，获得的微/纳米分级多孔微球见图3。

实施例14微/纳米分级多孔微球的制备

采用高压静电液滴喷射技术，将实施例9制备的乳液加入到20mL注射器中，实验采用24号针头，电压为15kV，接收距离为12cm，纺丝液流速为6mL/h，纺丝温度为26℃，湿度为45％，接收的凝固浴为质量比为2％的氢氧化钠溶液。然后分别用体积比20-100％的乙醇溶液进行梯度脱水去油处理(依次用体积比为20％、40％、60％、80％和100％的乙醇进行梯度脱水处理)，-80℃冷冻干燥48h，获得微/纳米分级多孔微球。结果见图3。

实施例15微/纳米分级多孔微球的制备

采用高压静电液滴喷射技术，将实施例10制备的乳液加入到20mL注射器中，实验采用24号针头，电压为13kV，接收距离为10cm，纺丝液流速为7mL/h，纺丝温度为26℃，湿度为45％，接收的凝固浴为质量比为2％的氢氧化钠溶液。然后分别用体积比20-100％的乙醇溶液进行梯度脱水去油处理(依次用体积比为20％、40％、60％、80％和100％的乙醇进行梯度脱水处理)，-70℃冷冻干燥48h，获得的微/纳米分级多孔微球。

将实施例12-15的微/纳米分级多孔微球采用扫描电子显微镜(SEM)拍照，结果见图4。从图4可以看出，气凝胶微球的表面和横截面均显示出均匀的三维多孔结构。其中实施例12制备得到的多孔微球表面为光滑致密，实施例13-15制备得到的微球表面粗糙，球壁上有大量的大孔和中孔，孔壁间由纳米纤维连结。从截面图中可以观察到，在微球中随机分布范围从几纳米到几十微米的分级孔，且随着模板乳液中油相体积比的增加，所制备的气凝胶孔的数量和类别也相应增加。

实施例16全血凝固实验

称取10mg实施例11-15制备的微/纳米分级多孔微球材料，加入到2mL的全血中，再加入25μL浓度为0.25M的CaCl₂溶液，启动血液凝固机制。室温下孵育30min，然后逐滴加入10mL蒸馏水而不干扰凝块，随后从中取出5mL溶液，在1000rpm下离心2min。收集上清液并在37℃下保持30min,再将200μL的上清液转移至96孔板中，用酶标仪检测溶液在540nm处的吸光度，结果见图5。

此实施例评价了甲壳素纳米纤维以及构建的微/纳米分级多孔对材料凝血行为的影响，进行了全血凝固时间探究并测量了去离子水溶血未被海绵捕获的红细胞后在540nm处的吸光度，血红蛋白溶液的吸光度值越低表明凝血速度越快。结果如图5所示，从图中可以看出，甲壳素纳米纤维的引入以及多孔结构的构建有利于缩短止血时间，加速凝血，采用有机相50-70％制备的Pickering乳液得到的微球(CS/Ch-50、CS/Ch-60、CS/Ch-70)具有良好的加速止血作用。采用壳聚糖制备的微球(CS)、直接采用CS/Ch混合溶液制备的微球(CS/Ch)不具有快速止血的效果。

实施例17微/纳米分级多孔微球的止血实验

鼠尾止血模型

动物实验均严格按照相关规定和批准执行。首先用戊巴比妥钠麻醉大鼠，在距离尾尖2cm处剪断尾部。分别用8mg三组样品(实施例11、12、14制备得到)覆盖尾部伤口，每10s揭开海绵观察伤口出血情况直至伤口停止出血，记录鼠尾出血时间，并用滤纸吸收溢出的血液，称重以确定失血量。每个样本在三只大鼠身上进行评估，并以生理盐水作为对照(Control)。

鼠肝裂伤模型

用戊巴比妥钠麻醉大鼠，用医用刀片在右肝叶上切出一个1×0.5cm的切口。分别将三组样品(8mg)(实施例11、12、14制备得到)放在肝脏切口处，开始记录时间直至伤口停止出血，并用滤纸吸收溢出的血液，以确定失血量。每个样本在三只大鼠身上进行评估，并以生理盐水作为对照(Control)。

大鼠截尾和肝裂模型的失血量统计见表1。

表1

采用大鼠尾部截肢模型评价CS、CS/Ch和CS/Ch-60微球粉末的止血效果。在大鼠断尾模型中，每组样本的平均止血时间明显短于对照组(图6a)，失血量也明显减少(表1)。与纯CS微球粉末相比，CS/Ch-60的止血时间缩短84s，出血量减少62％，这说明CS/Ch-60样品具有良好的止血能力。

与大鼠断尾模型相似，CS/Ch-60组样品的鼠肝止血时间也明显短于对照组，说明修饰后的样品对肝出血也有良好的止血作用(图6b)。其中，对照组、CS、CS/Ch和CS/Ch-60样品的止血时间分别为134s、107s、98s和71s，出血量则分别为0.38g、0.25g、0.21g和0.16g(表1)。结果表明，引入甲壳素纳米纤维以及构建分级多孔结构可提高材料的止血性能。

实施例18肝脏创面止血处理后的组织切片H&E染色

创面修复大体观察

实验中选取12只SPF级雄性SD大鼠(150～250g)用于评价CS、CS/Ch和CS/Ch-60微球粉末(实施例11、12、14制备得到)对肝脏创面的愈合效果。动物实验在标准的实验室条件下进行，温度为25℃，平均湿度保持在40％左右，所有大鼠均给予正常取食和饮水。制造创面方法同实施例15。根据伤口被CS、CS/Ch和CS/Ch-60样品处理的时间，将大鼠随机分为四组，每组3只大鼠进行平行实验，分别在7d和14d时间点观察伤口修复效果。在样品表面覆盖一层纱布，以隔绝空气中的水分和细菌，并防止在创面愈合过程中大鼠将复合物蹭掉。其中，用生理盐水处理伤口作为空白对照组(Control)。在伤口被C、CS/Ch和CS/Ch-60复合物处理后的第7d和第14d对大鼠进行安乐死，切除伤口及周围健康皮肤组织，用于后续实验。实验结束后，对所有老鼠尸体作无害化处理。

组织学评价

(1)组织石蜡包埋切片：

1)取材：将切除的皮肤组织固定于4％多聚甲醛24h以上。

2)脱水：使用梯度乙醇对组织进行脱水处理。具体为：室温条件下，75％乙醇4h，85％乙醇2h，90％乙醇2h，95％乙醇1h，无水乙醇Ⅰ30min，无水乙醇Ⅱ30min。然后放入二甲苯分别透明10min、5min；分别在软蜡Ⅰ中浸泡1h，软蜡Ⅱ中浸泡1h，硬蜡中浸泡1h。

3)包埋：先将融化的蜡放入包埋器中，然后将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋器并做好标记。于-20℃冻台冷却凝固，然后取出并修整蜡块。

4)切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。将制备好的组织切片放60℃烘箱。待水烤干、蜡烤化后取出，常温保存备用。

(2)H&E染色：

1)脱蜡复水：将(1)中制备好的切片依次放入二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ20min，无水乙醇Ⅰ10min，无水乙醇Ⅱ10min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，80％乙醇5min，70％乙醇5min，蒸馏水冲洗多次。

2)苏木素染细胞核：将切片放入Harris苏木素染液中10min，去离子水冲洗，用1％的盐酸酒精分化几秒钟，去离子水冲洗，用0.6％的氨水返蓝，去离子水冲洗。

3)伊红染细胞质：将上述切片放入伊红染液中染色3min。

4)脱水封片：将切片依次用95％乙醇Ⅰ脱水5min，95％乙醇Ⅱ脱水5min，无水乙醇Ⅰ脱水5min，无水乙醇Ⅱ脱水5min，二甲苯Ⅰ脱水5min，二甲苯Ⅱ脱水5min中，透明，中性树胶封片。

进一步在病理水平上评估微/纳米分级多孔微球对创面的治疗效果的H&E染色组织切片如图7所示。从图中可以观察到，肝脏在损失的第7天处理后，空白生理盐水组、CS组在伤口部位以及伤口临近的组织中都有大量的炎症细胞存在，并且出现了严重的细胞间水肿现象。而CS/Ch和CS/Ch-60组炎症细胞有所减少，细胞水肿逐渐消退。术后14天，CS/Ch-60组中只观察到少量的炎症细胞，组织中细胞排列紧密有序，证明创面已经有大量新生上皮细胞。而生理盐水、CS、CS/Ch组细胞中仍伴有少量充血现象，细胞萎缩变形并且还存在大量的炎症细胞。

以上结果证明，微/纳米分级多孔微球能够实现缩短创面止血时间，促进创面修复，可抑制伤口感染，促进细胞的黏附和增殖。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种微/纳米分级多孔微球的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)制备甲壳素纳米纤维与壳聚糖的混合溶液

将纳米纤维长度为20-200nm的甲壳素纳米纤维悬浮液与壳聚糖溶液混合，均质，得到混合溶液；

(2)制备Pickering乳液

将步骤(1)得到的混合溶液与有机相混合，均质，得到Pickering乳液；

(3)制备微/纳米分级多孔微球

将步骤(2)得到的Pickering乳液采用高压静电液滴喷射技术形成微液滴，接收，脱水去油，干燥，获得微/纳米分级多孔微球；

步骤(1)中所述甲壳素纳米纤维悬浮液为酸性条件下将浓度为0.5～2.0wt％的甲壳素水溶液搅拌、研磨和均质后得到；

步骤(1)中所述甲壳素纳米纤维悬浮液中甲壳素纳米纤维长度为20～200nm；

步骤(1)中所述壳聚糖溶液为溶于乙酸溶液后搅拌至完全溶解得到；所述乙酸溶液的浓度为体积比1％～2％；

步骤(1)中所述壳聚糖溶液的浓度为2.0～5.0wt％；

步骤(1)中所述甲壳素纳米纤维悬浮液与所述壳聚糖溶液的用量为体积比1:1-3:1；

步骤(2)中所述混合溶液与所述的有机相的体积比为30～50：50～70；

步骤(3)中所述脱水去油为依次用体积比为20％、40％、60％、80％和100％的乙醇溶液进行梯度脱水去油。

2.根据权利要求1所述的微/纳米分级多孔微球的制备方法，其特征在于，

步骤(1)中所述甲壳素纳米纤维悬浮液与所述壳聚糖溶液的用量为体积比1:1；

步骤(2)中所述混合溶液与所述的有机相的体积比为40～50：50～60。

3.根据权利要求1所述的微/纳米分级多孔微球的制备方法，其特征在于，

所述酸性条件下的pH通过乙酸溶液调节，pH为1～6；

所述的乙酸溶液的体积比为1％；

所述的搅拌的时间为12～48h；

所述研磨的条件：研磨压力150～400MPa、研磨次数20～60times；

所述均质的条件：转速8000～15000rpm、分散时间0.5～2h。

4.根据权利要求3所述的微/纳米分级多孔微球的制备方法，其特征在于，

所述酸性条件下的pH为3～4；

所述的搅拌的时间为24h；

所述研磨的条件：研磨压力200MPa、研磨次数20times；

所述均质的条件：转速13000rpm、分散时间0.5h。

5.根据权利要求1所述的微/纳米分级多孔微球的制备方法，其特征在于，

步骤(1)中所述均质的条件：转速8000～15000rpm，分散时间0.5～2h；

步骤(2)中所述有机相为不溶于水的任意有机溶剂；

步骤(2)中所述均质为7000～20000rpm转速条件下为均质10～60min。

6.根据权利要求1所述的微/纳米分级多孔微球的制备方法，其特征在于，

步骤(3)中所述高压静电液滴喷射技术的参数为：注射器20mL，21～24号针头，电压为10～20kV，接收距离为5～15cm，纺丝液流速为2～8mL/h，纺丝温度为20～30℃，湿度为30％～50％；

步骤(3)中所述接收的凝固浴为质量比1％～3％的氢氧化钠溶液；

步骤(3)中所述干燥为冷冻干燥。

7.根据权利要求6所述的微/纳米分级多孔微球的制备方法，其特征在于，

所述冷冻干燥的时间为24～48h；

所述的冷冻干燥的温度为-80～-40℃。

8.一种微/纳米分级多孔微球，通过权利要求1-7任一项所述的微/纳米分级多孔微球的制备方法制备得到。

9.权利要求8所述的微/纳米分级多孔微球在制备止血粉中的应用。

Images