CN112526039A - 一种血清代谢谱分子量校准品试剂盒及其制备方法、使用方法 - Google Patents
一种血清代谢谱分子量校准品试剂盒及其制备方法、使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种血清代谢谱分子量校准品试剂盒及其制备方法、使用方法,包括代谢分子校准品、溶解液与分子量校准列表;其中,代谢分子校准品与溶解液的配比为:1份代谢分子校准品对应1‑5份溶解液。本发明的分子量校准品取自生物样本,成本低,制备方便;可涵盖代谢分子检测的100‑1000Da范围,且同时适用于正离子和负离子检测模式,可根据需要选择分子量校准品和校准列表;使用方便,可适用于多种离子源质谱仪和多种生物样本的代谢分子区的检测和分子量校准;本发明适用于代谢小分子的准确分子量测定、代谢小分子的结构鉴定和解析、分子精准质谱成像。
Description
技术领域
本发明涉及质谱技术领域,特别涉及一种血清代谢谱分子量校准品试剂盒及其制备方法、使用方法。
背景技术
代谢分子因能实时反映生物体的表型变化、生理和病理情况,其在血液、唾液、尿液、组织、细胞等复杂生物样本中的组成变化与疾病监控密切相关。MALDI-MS基质辅助激光解吸离子化质谱技术是一种高通量的质谱技术,其不仅在蛋白、多肽、核酸等大分子的检测和分析中应用广泛,近年来也在代谢小分子检测中引起高度重视。但因代谢分子组成种类繁多,以脂质为例,已被发现和命名的就超过20000种,在以MALDI及其他直接离子化质谱技术为平台进行复杂生物样本的直接检测和分析时,分子量校准极为重要,直接影响代谢谱图的可靠性和精准性。生物样本中的代谢分子组成复杂,部分以簇峰形式出现,在MALDI等直接离子化质谱仪种检测范围主要集中在50-1200Da范围内。目前尚未有能够全覆盖该范围的小分子分子量校准品的试剂盒或产品。
由Avanti开发的商业化脂质校准品能够覆盖400-900Da,但由多种脂质纯品混合而成,成本较高,价格昂贵,且因溶解于甲醇溶液中易挥发,不易保存。CHCA、DHB、SA等MALDI中常用的有机酸也可作为小分子的分子量校准品,但其易形成高度不均匀的结晶,从而影响质谱检测时的分子量精度,达不到合适的校准效果,且其形成的簇峰分子量已被解析的范围也仅在50-500Da范围内,不足以覆盖高分子区的代谢分子的检测。
专利CN104597114B提出以多种脂肪酸的混合物作为负离子检测模式下代谢分子区的分子量校准品,但也仅能校准100-350Da范围。根据校准原则,若校准品的分子量不能均匀分布于所需检测范围,则易发生校准严重偏移的现象。
专利CN109632938A利用AgNO3@PDA纳米颗粒中的银簇峰作为分子量校准品,代谢分子点样于AgNO3@PDA纳米颗粒表面,银簇成为正离子检测模式下的内标校准品。该方法可以覆盖300-1000Da分子量范围,但银簇峰会严重干扰复杂生物样本的谱图出峰,同时改变代谢分子的离子加和形式,代谢分子的谱形与纳米颗粒在基底上的分布情况相关,谱图的稳定性无法得到保障。且银簇仅在正离子模式下形成可计算精准分子量的分子列表,无法同时用于负离子模式下的代谢分子区的校准。同时因在直接离子化质谱检测技术中,离子抑制效应无法避免,其他内标法也通常不利于复杂生物样本的精准检测。
市场上亟待开发低成本、使用方便、覆盖范围广的用于代谢分子的分子量校准试剂盒。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足而提供了一种血清代谢谱分子量校准品试剂盒,本发明的试剂盒的制备方法简单,可根据校准范围调整试剂盒的配方和分子量校准列表,兼顾负离子模式和正离子模式,避免不同检测模式分别进行校准的缺点;校准精度高;试剂盒可适用于血清的质谱检测应用场景。
本发明的目的之二是提供该试剂盒的制备方法。
本发明的目的之三是提供该试剂盒的使用方法。
为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种血清代谢谱分子量校准品试剂盒,所述试剂盒包括代谢分子校准品、溶解液与分子量校准列表;其中,代谢分子校准品与溶解液的配比为:1份代谢分子校准品对应1-5份溶解液;代谢分子校准品从血清样本中提取得到,血清样本的分子量校准列表包括:负离子模式下质荷比m/z=152.9699、255.2330、279.2330、283.2643、303.2330、367.1551、435.2482、465.3030、616.4784、642.4990、687.5554、726.6026、752.6139、778.5289、794.5272、833.5268、861.5499、885.5499、904.6189、922.6131,可校准100-1000Da范围;正离子模式下质荷比m/z=184.1097、437.1032、459.1522、478.2330、502.2330、546.2744、635.1439、659.2695、678.5991、690.4992、725.5410、780.5514、832.5827,可校准150-900Da范围。
前述的一种血清代谢谱分子量校准品试剂盒,所述溶解液为能够溶解分子量校准品的溶剂,包括:水、甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、丙酮及其两种以上溶剂混合之后的混合溶剂。
上述的血清代谢谱分子量校准品试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
步骤一,代谢分子校准品的制备:使用提取试剂提取不同生物样本中的代谢分子,获得含有代谢分子的校准品;
步骤二,代谢分子校准品中代谢分子的分子量的测定:
1)溶解液与代谢校准品混合得到代谢分子校准品溶液,在代谢分子校准品溶液中加入纯品校准品作为内标,制备成含内标的代谢分子校准品溶液;
2)将含内标的代谢分子校准品溶液点样于载样台上,自然干燥;
3)将载样台放入质谱仪中进行正离子模式和负离子模式检测,用内标法确认代谢分子校准品溶液中两种检测模式下各个质谱峰的分子量;
4)挑选出峰强度高、稳定的质谱峰进行二级质谱检测,获取二级质谱图,对其进行结构鉴定,得到理论准确分子量;
5)对含有内标的代谢分子校准品再次进行检测,以纯品校准品和已明确结构、理论准确分子量的峰为内标,二次确认和修正代谢分子校准品在两种检测模式下除已知理论分子量以外的峰的准确分子量,获得准确分子量列表;
6)挑选准确分子量列表中强度高、稳定的峰,在质谱仪控制软件种建立分子量校准列表;
步骤三,按照如下配方配置试剂盒:配方包括:代谢分子校准品、溶解液、分子量校准列表;代谢分子校准品与溶解液的配比为:1份代谢分子校准品对应1-5份溶解液。
结合内标法和二级质谱鉴定,确定代谢分子校准品在两种检测模式下的准确分子量列表;其中,准确分子量列表的包括:负离子模式下m/z=152.9699、255.2330、279.2330、283.2643、303.2330、367.1551、435.2482、465.3030、616.4784、642.4990、687.5554、726.6026、752.6139、778.5289、794.5272、861.5499、885.5499、904.6189、922.6131,正离子模式下m/z=184.1097、437.1032、459.1522、478.2330、502.2330、546.2744、635.1439、659.2695、678.5991、690.4992、725.5410、780.5514、808.5560、832.5832。
负离子模式下检测的纯品校准品的质谱峰包括:m/z=199.1704、255.2330、283.2643、311.2956、367.3582、690.5079,正离子模式下检测的纯品校准品的质谱峰包括:m/z=184.1097、790.6326、812.6145、829.7256。
上述血清代谢谱分子量校准品试剂盒的使用方法,包括内标校准法和外标校准法;内标校准法用于待测样本中存在与分子量校准品中重叠的代谢分子,外标校准法对待测样本的成份不做规定。
前述的血清代谢谱分子量校准品试剂盒的使用方法,内标校准法包括如下步骤:
步骤一,对待测血清样本的分子量进行校准:
1)获取待测血清样本中的代谢分子;
2)用溶解液溶解1份代谢分子校准品得到代谢分子校准品溶液;
3)将待测生物样本中的代谢分转移至载样台,同时将代谢分子校准品溶液点样于相同载样台上;
4)启动质谱仪器采集数据,用代谢分子校准品和分子量校准列表对两种检测模式下的仪器进行校准,并保存方法;
5)完成仪器校准后,对待测样本进行谱图采集,确认在待测样本中能够稳定出峰的分子量校准列表,剔除试剂盒的分子量校准列表中不能在待测样本中稳定出峰的峰,并以此修正后的分子量校准列表对每个孔的待测样本进行内标校准;
步骤二,对校准效果进行评估:
1)对待测样本谱图中峰强度较高、较稳定的峰进行二级鉴定,确认该峰与分子量校准列表中对应的峰来自同一分子;
2)将多个位点上分子量内标校准后峰的质荷比与分子量校准列表中的准确分子量比较,计算校准精度(ppm),公式为|m/z(校准后分子量)-m/z(准确分子量)|/m/z(准确分子量)×106,用于评判分子量校准效果;
内标校准法在数据分析软件中的使用方法包括如下步骤:
步骤一,获取样本的代谢谱图:
1)采集、提取或富集血清样本中的代谢分子;
2)将血清样本中采集、提取或富集的代谢样品转移至载样台,启动质谱仪器采集数据;
步骤二,在数据分析软件中实现内标校准:
将质谱仪采集的代谢谱图调入数据分析软件中,同时调用分子量校准列表,在血清样本质谱图中将分子量校准列表中的标准分子量与检测分子量相匹配,按照线性方程或二次方程拟合校准曲线,并将其应用到每张代谢谱图中,实现全谱图的校准;
步骤三,对校准效果进行评估:
将多张血清样本谱图中的分子经过分子量内标校准后的峰的质荷比与分子量校准列表中的准确分子量比较,计算相对误差(ppm),公式为|m/z(校准后分子量)-m/z(准确分子量)|/m/z(准确分子量)×106,用于评判分子量校准效果。
前述的血清代谢谱分子量校准品试剂盒的使用方法,所述外标校准法的适用软件包括:仪器检测控制软件;外标校准法的使用方法包括如下步骤:
步骤一,对待测血清样本的分子量进行校准:
1)采集、提取或富集生物样本中的代谢分子;
2)用溶解液溶解1份代谢分子校准品得到代谢分子校准品溶液;
3)将血清样本中采集、提取或富集的代谢样品转移至载样台,同时将代谢分子校准品溶液点样于载样台,待测样本点分布于代谢分子校准品点的周围或相邻位置;
4)启动质谱仪器采集数据,用代谢分子校准品和分子量校准列表对质谱仪进行负离子和正离子模式下的分子量进行外标校准,校准后对待测样本孔中的待测血清样本进行两种检测模式下的谱图采集;
步骤二,对校准效果进行评估:
1)对待测样本谱图中峰强度较高、较稳定的峰进行二级鉴定,二级鉴定能确认分子结构的峰计算其理论分子量;
2)将多个位点上分子量校准后峰的质荷比与理论准确分子量比较,计算相对误差(ppm),公式为|m/z(校准后分子量)-m/z(理论分子量)|/m/z(理论分子量)×106,用于评判分子量校准效果。
前述的血清代谢谱分子量校准品试剂盒的使用方法,所述质谱仪包括:飞行时间离子源质谱仪、SIMS离子源质谱仪或常压敞开式离子源质谱。
前述的血清代谢谱分子量校准品试剂盒的使用方法,质谱仪的载样台为导电基底,包括不锈钢靶板或纳米结构芯片。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1)本发明的分子量校准品取自血清,成本低,制备方便;
2)本发明的分子校准品及其分子量外标校准列表可涵盖代谢分子检测的100-1000Da范围,且同时适用于正离子和负离子检测模式,可根据需要选择分子量校准品和校准列表;
3)本发明的分子量校准品试剂盒使用方便,可适用于多种离子源质谱仪和多种生物样本的代谢分子区的检测和分子量校准;
4)本发明适用于代谢小分子的准确分子量测定、代谢小分子的结构鉴定和解析、分子精准质谱成像。
附图说明
图1是本发明的流程图;
图2是本发明纯品内标校准品与分子量校准品混合后在负离子模式下的出峰图;
图3是本发明纯品内标校准品与分子量校准品混合后在正离子模式下的出峰图;
图4是本发明血清中提取的分子量校准品负离子模式下的出峰谱图;
图5是本发明血清中提取的分子量校准品正离子模式下的出峰谱图;
图6是本发明经分子量内标校准后的校准精度列表;
图7是本发明经分子量外标校准后的的校准精度图。
具体实施方式
下面将结合附图详细描述本发明的具体实施例,应当注意,这里描述的实施例只用于举例说明,并不用于限制本发明。在以下描述中,为了便于对本发明的透彻理解,阐述了大量特定细节。然而,本领域普通技术人员可以理解,这些特定细节并非为实施本发明所必需。此外,在一些实施例中,为了避免混淆本发明,未对公知的电路、材料或方法做具体描述。
本发明提供了一种血清代谢谱分子量校准品试剂盒,所述试剂盒包括代谢分子校准品、溶解液与分子量校准列表;其中,代谢分子校准品与溶解液的配比为:1份代谢分子校准品对应1-5份溶解液。
在本发明中,所述质谱仪包括:飞行时间离子源质谱仪、SIMS离子源质谱仪、常压敞开式离子源质谱仪。
所述载样台包括不锈钢靶板、纳米材料芯片或其他导电基底。
实施例1从血清样本中提取并制备代谢分子校准品
步骤一,获取血液样本,凝固后离心,得到澄清淡黄色血清上清液;
步骤二,取10-50μL血清上清液,加入5-10倍体积的混合提取溶剂,经历振荡孵育、离心步骤,使血清样本分层;
步骤三,从步骤二中的血清分层样本中分离得到含有代谢分子的溶液,将其溶剂蒸干,获得代谢分子校准品。
步骤四,将代谢分子校准品用溶解液重溶,配制成代谢分子校准品溶液。作为一种优选,从血清样本中提取的代谢分子校准品的溶解液为异丙醇和水的混合溶剂,代谢分子校准品与溶解液的配比为1:2。
图1为从血清样本中提取并制备代谢分子校准品的流程图。
实施例2
代谢分子量校准品的分子量测定和分子量校准列表的获得
步骤一,100~1000μL溶解液加入到代谢分子校准品中,振荡重溶,制备得到校准品溶液,单管分装10μL/管,未使用时-80℃保存;
步骤二,在校准品溶液中加入由月桂酸、软脂酸、硬脂酸、花生酸、木蜡酸、1,2-二棕榈酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺组成的纯品混合代谢分子,组成含有内标的负离子模式下的分子量校准品;
步骤三,在校准品溶液中加入由1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和1,2,3-三棕榈酸甘油酯组成的纯品混合代谢分子,组成含有内标的正离子模式下的分子量校准品;
步骤四,将含有内标的代谢分子校准品溶液点样于纳米质谱芯片上,0.5~2μL/孔,两种检测模式下的分子量校准品各点10-20个位点,自然干燥。有关纳米质谱芯片的具体构造可参考本申请人的CN110530965A专利;
步骤五,将载样台放入质谱仪中进行检测,用内标法确认代谢分子校准品溶液中负离子和正离子检测模式下各个质谱峰的分子量,由月桂酸、软脂酸、硬脂酸、花生酸、木蜡酸、1,2-二棕榈酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺组成的纯品混合代谢分子在负离子模式下的出峰位置为:m/z=199.1704、255.2330、283.2643、311.2956、367.3582、690.5079;由1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和1,2,3-三棕榈酸甘油酯组成的纯品混合代谢分子在正离子模式下的出峰位置包括:m/z=184.1097、790.6326、812.6145、829.7256;
步骤六,挑选出峰强度高、稳定的质谱峰进行二级质谱检测,获取二级质谱图,对其进行结构鉴定,从而得到理论分子量,在负离子模式下能确定结构的分子的理论分子量包括m/z=255.2330、279.2330、281.2486、283.2643、303.2330、367.1551、726.6026、861.5499、885.5499;在正离子模式下能确定结构的分子的理论分子量包括m/z=184.1097、478.2330、502.2330、725.5410、780.5514、808.5560;
步骤七,对含有内标的代谢分子校准品再次进行检测,以纯品校准品和已明确结构、理论分子量的峰为内标,二次确认代谢分子校准品在负离子检测模式下除已知理论分子量以外的峰的准确分子量,该值为测试的10-20个位点上的平均值;
步骤八,挑选已知理论分子量或未知理论分子量但已得到准确分子量的峰中强度高、稳定的峰在质谱仪控制软件种建立分子量校准列表,负离子模式下的分子量校准列表包括:非离子模式下质荷比m/z=152.9699、255.2330、279.2330、283.2643、303.2330、367.1551、435.2482、465.3030、616.4784、642.4990、687.5554、726.6026、752.6139、778.5289、794.5272、833.5268、861.5499、885.5499、904.6189、922.6131,可校准100-1000Da范围;正离子模式下质荷比m/z=184.1097、437.1032、459.1522、478.2330、502.2330、546.2744、635.1439、659.2695、678.5991、690.4992、725.5410、780.5514、808.5560、832.5827,可校准150-900Da范围;附图2为纯品内标品与分子量校准品混合后在负离子模式下的出峰图。横坐标为质荷比(m/z),无单位;纵坐标为峰强度,无单位。
需要说明的是:本实施例中的分子量校准品由组织样本中提取得到。且两种检测模式下的分子量校准列表仅为一种优选,可根据检测需要进行取舍,负离子模式下可以为255.2330、283.2643、303.2330、419.2568、599.3202,也可以为419.2568、599.3202、806.5458、885.5499、878.6033、888.6240、906.6346,1042.6717、1070.7030,正离子模式下可以为184.1097、437.1032、478.2330、502.2330,也可以为725.5410、780.5514、808.5560、832.5832、881.7574,以均匀覆盖检测范围为前提条件。
从血清样本中提取分子量校准品时,分子校准列表包括:负离子模式下质荷比m/z=152.9699、255.2330、279.2330、283.2643、303.2330、367.1551、435.2482、465.3030、616.4784、642.4990、687.5554、726.6026、752.6139、778.5289、794.5272、833.5268、861.5499、885.5499、904.6189、922.6131,可校准100-1000Da范围;正离子模式下质荷比m/z=184.1097、437.1032、459.1522、478.2330、502.2330、546.2744、635.1439、659.2695、678.5991、690.4992、725.5410、780.5514、832.5827,可校准150-900Da范围;
实施例3
代谢分子量校准品的分子量内标校准法的校准效果评价
步骤一,对待测血清生物样本的分子量进行校准:
1)采集、提取或富集血清中的代谢分子;
2)用溶解液溶解1份由血清中提取的代谢分子校准品得到代谢分子校准品溶液;
3)将血清中采集、提取或富集的代谢样品转移至载样台,同时将代谢校准品溶液点样于载样台,待测血清样本点分布于代谢分子校准品点的周围或相邻位置;
4)启动质谱仪器采集数据,用代谢分子校准品对两种检测模式下的仪器进行校准,并保存方法;
5)完成仪器校准后,对待测血清样本进行谱图采集,确认在待测样本中能够稳定出峰的分子量校准列表,对每个孔的待测样本进行内标校准;
步骤二,对校准效果进行评估:
1)对待测样本谱图中峰强度较高、较稳定的峰进行二级鉴定,确认该峰与分子量校准列表中对应的峰来自同一分子;
2)将多个位点上分子量内标校准后峰的质荷比与分子量校准列表中的准确分子量比较,计算校准精度(ppm),公式为|m/z(校准后分子量)-m/z(准确分子量)|/m/z(准确分子量)×106,用于评判分子量校准效果。
附图3为由血清中提取的分子量校准品负离子模式下的出峰谱图。横坐标为质荷比(m/z),无单位;纵坐标为峰强度,无单位。
附图4为由血清中提取的分子量校准品正离子模式下的出峰谱图。横坐标为质荷比(m/z),无单位;纵坐标为峰强度,无单位。
附图5为一代表孔的参考峰经分子量内标校准后的校准精度,内标校准精度均<20ppm,其中400-1000Da范围内分子量内标校准后的校准精度均<10ppm。
实施例4
由组织中提取制备的代谢分子量校准品的分子量外标校准法的校准效果评价
步骤一,用溶解液溶解1份由组织中提取制备的代谢分子校准品得到代谢分子校准品溶液;
步骤二,将代谢分子校准品点样于纳米质谱芯片表面上的3×3共9个检测位点,纳米质谱芯片的孔径为3mm,孔间距为4.5mm,中心位置为外标校准孔,周围8个位点为分子量校准的评价孔,0.5~2μL/位点;
步骤三,启动质谱仪器采集数据,先用外标校准孔中的代谢分子校准品对质谱仪进行分子量外标校准,校准后对分子量校准的评价孔进行谱图采集;
步骤四,挑选评价孔中获得的谱图中均匀分布于分子量检测范围内的多个峰,除用于分子量校准的校准峰外,同时增加未用于分子校准的其他峰,并借助于二级鉴定计算其理论准确分子量;
步骤五,将8个校准评价位孔中分子量的质荷比与准确分子量比较,计算相对误差(ppm),公式为|m/z(校准后分子量)-m/z(准确分子量)|/m/z(理论分子量)×106,用于评判分子量校准效果。
作为一种实施例,用于分子量校准效果评估的峰可选用以下列表:负离子模式下理论质荷比为m/z=255.2330、281.2330、303.2330、419.2568、599.3202、806.5458、878.6033、888.6240、906.6346,正离子模式下质荷比为为m/z=478.2330、506.2642、756.5514、782.5676、798.5410。
附图6为分子量校准品负离子模式下的出峰谱图。横坐标为质荷比(m/z),无单位;纵坐标为峰强度,无单位。
附图7为分子量校准品正离子模式下的出峰谱图。横坐标为质荷比(m/z),无单位;纵坐标为峰强度,无单位。
实施例9
由血清中提取制备的代谢分子量校准品的分子量外标校准法的校准效果评价
步骤一,用溶解液溶解1份由血清中提取制备的代谢分子校准品得到代谢分子校准品溶液;
步骤二,将代谢分子校准品点样于纳米质谱芯片表面上的70个检测位点,纳米质谱芯片的孔径为3mm,孔间距为4.5mm,总体尺寸为70×25mm,70个检测位点的中心位置孔为外标校准孔,周围69个位点为分子量校准的评价孔,0.5~2μL/位点;
步骤三,启动质谱仪器采集数据,先用外标校准孔中的代谢分子校准品对质谱仪进行分子量外标校准,校准后对分子量校准的评价孔进行谱图采集;
步骤四,挑选评价孔中获得的谱图中均匀分布于分子量检测范围内的多个峰,将69个校准评价位孔中分子量的质荷比与准确分子量比较,计算相对误差(ppm),公式为|m/z(校准后分子量)-m/z(准确分子量)|/m/z(理论分子量)×106,用于评判分子量校准效果。
作为一种实施例,用于分子量校准效果评估的峰可选用以下列表:负离子模式下理论质荷比为m/z=255.2330、283.2643、303.2330、435.2482、465.3030、616.4784、642.4990、687.5554、726.6026、861.5499、885.5499,正离子模式下质荷比为为m/z=437.1032、478.2330、502.2330、725.5410、780.5514、808.5560。
虽然已参照几个典型实施例描述了本发明,但应当理解,所用的术语是说明和示例性、而非限制性的术语。由于本发明能够以多种形式具体实施而不脱离发明的精神或实质,所以应当理解,上述实施例不限于任何前述的细节,而应在随附权利要求所限定的精神和范围内广泛地解释,因此落入权利要求或其等效范围内的全部变化和改型都应为随附权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种血清代谢谱分子量校准品试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括代谢分子校准品、溶解液与分子量校准列表;其中,代谢分子校准品与溶解液的配比为:1份代谢分子校准品对应1-5份溶解液;代谢分子校准品从血清样本中提取得到;
其中,血清样本的分子量校准列表包括:负离子模式下质荷比m/z=152.9699、255.2330、279.2330、283.2643、303.2330、367.1551、435.2482、465.3030、616.4784、642.4990、687.5554、726.6026、752.6139、778.5289、794.5272、833.5268、861.5499、885.5499、904.6189、922.6131,可校准100-1000Da范围;正离子模式下质荷比m/z=184.1097、437.1032、459.1522、478.2330、502.2330、546.2744、635.1439、659.2695、678.5991、690.4992、725.5410、780.5514、808.5560、832.5827,可校准150-900Da范围。
2.根据权利要求1所述的一种血清代谢谱分子量校准品试剂盒,其特征在于,所述溶解液包括:水、甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、丙酮及其两种以上溶剂混合之后的混合溶剂。
3.一种血清代谢谱分子量校准品试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一,代谢分子校准品的制备:使用提取试剂提取血清中的代谢分子,获得含有代谢分子的校准品;
步骤二,代谢分子校准品中代谢分子的分子量的测定:
1)溶解液与代谢分子校准品混合得到代谢分子校准品溶液,在代谢分子校准品溶液中加入纯品校准品作为内标,制备成含内标的代谢分子校准品溶液;
2)将含内标的代谢分子校准品溶液点样于载样台上,自然干燥;
3)将载样台放入质谱仪中进行正离子模式和负离子模式检测,用内标法确认代谢分子校准品溶液中两种检测模式下各个质谱峰的分子量;
4)挑选出峰强度高、稳定的质谱峰进行二级质谱检测,获取二级质谱图,对其进行结构鉴定,得到理论准确分子量;
5)对含有内标的代谢分子校准品再次进行检测,以纯品校准品和已明确结构、理论准确分子量的峰为内标,二次确认和修正代谢分子校准品在两种检测模式下除已知理论分子量以外的峰的准确分子量,获得准确分子量列表;
6)挑选准确分子量列表中强度高、稳定的峰,在质谱仪控制软件种建立分子量校准列表;
步骤三,按照如下配方配置试剂盒:配方包括:代谢分子校准品、溶解液、分子量校准列表;代谢分子校准品与溶解液的配比为:1份代谢分子校准品对应1-5份溶解液。
4.一种血清代谢谱分子量校准品试剂盒的使用方法,其特征在于,包括内标校准法和外标校准法;内标校准法用于待测样本中存在与分子量校准品中重叠的代谢分子,外标校准法对待测样本的成份不做规定。
5.根据权利要求4所述的一种血清代谢谱分子量校准品试剂盒的使用方法,其特征在于,
内标校准法包括如下步骤:
步骤一,对待测生物样本的分子量进行校准:
1)获取待测生物样本中的代谢分子;
2)用溶解液溶解1份代谢分子校准品得到代谢分子校准品溶液;
3)将待测生物样本中的代谢分子转移至载样台,同时将代谢分子校准品溶液点样于相同载样台上;
4)启动质谱仪器采集数据,用代谢分子校准品和分子量校准列表对两种检测模式下的仪器进行校准,并保存方法;
5)完成仪器校准后,对待测样本进行谱图采集,确认在待测样本中能够稳定出峰的分子量校准列表,剔除试剂盒的分子量校准列表中不能在待测样本中稳定出峰的峰,并以此修正后的分子量校准列表对每个孔的待测样本进行内标校准;
步骤二,对校准效果进行评估:
1)对待测样本谱图中峰强度较高、较稳定的峰进行二级鉴定,确认该峰与分子量校准列表中对应的峰来自同一分子;
2)将多个位点上分子量内标校准后峰的质荷比与分子量校准列表中的准确分子量比较,计算校准精度(ppm),公式为|m/z(校准后分子量)-m/z(准确分子量)|/m/z(准确分子量)×106,用于评判分子量校准效果;
内标校准法在数据分析软件中的使用方法包括如下步骤:
步骤一,获取样本的代谢谱图:
1)采集、提取或富集生物样本中的代谢分子;
2)将生物样本中采集、提取或富集的代谢样品转移至载样台,启动质谱仪器采集数据;
步骤二,在数据分析软件中实现内标校准:
将质谱仪采集的代谢谱图调入数据分析软件中,同时调用分子量校准列表,在样本质谱图中将分子量校准列表中的标准分子量与检测分子量相匹配,按照线性方程或二次方程拟合校准曲线,并将其应用到每张代谢谱图中,实现全谱图的校准;
步骤三,对校准效果进行评估:
将多张样本谱图中的分子经过分子量内标校准后的峰的质荷比与分子量校准列表中的准确分子量比较,计算相对误差(ppm),公式为|m/z(校准后分子量)-m/z(准确分子量)|/m/z(准确分子量)×106,用于评判分子量校准效果。
6.根据权利要求4所述的一种血清代谢谱分子量校准品试剂盒的使用方法,其特征在于,所述外标校准法的适用软件包括:仪器检测控制软件;外标校准法的使用方法包括如下步骤:
步骤一,对待测生物样本的分子量进行校准:
1)采集、提取或富集生物样本中的代谢分子;
2)用溶解液溶解1份代谢分子校准品得到代谢分子校准品溶液;
3)将生物样本中采集、提取或富集的代谢样品转移至载样台,同时将代谢校准品溶液点样于载样台,待测样本点分布于代谢分子校准品点的周围或相邻位置;
4)启动质谱仪器采集数据,用代谢分子校准品和分子量校准列表对质谱仪进行负离子和正离子模式下的分子量进行外标校准,校准后对待测样本孔中的待测样本进行两种检测模式下的谱图采集;
步骤二,对校准效果进行评估:
1)对待测样本谱图中峰强度较高、较稳定的峰进行二级鉴定,二级鉴定能确认分子结构的峰计算其理论分子量;
2)将多个位点上分子量校准后峰的质荷比与理论准确分子量比较,计算相对误差(ppm),公式为|m/z(校准后分子量)-m/z(理论分子量)|/m/z(理论分子量)×106,用于评判分子量校准效果。
7.根据权利要求5或6所述的一种血清代谢谱分子量校准品试剂盒的使用方法,其特征在于,所述质谱仪包括:飞行时间离子源质谱仪、SIMS离子源质谱仪或常压敞开式离子源质谱。
8.根据权利要求7所述的一种血清代谢谱分子量校准品试剂盒的使用方法,其特征在于,质谱仪的载样台为导电基底,包括不锈钢靶板或纳米结构芯片。
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