CN112522247A - 一种微生物菌剂的固定化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物菌剂的固定化工艺。采用本工艺固定的微生物菌剂，在使用前期可通过包埋袋上的微孔进行持续释放，在使用2个月后包埋袋开始降解，微生物菌剂全面释放，降解产物为水和二氧化碳，无毒害，不会产生二次污染，通过本发明公开的固定化工艺来进行复合微生物的固定化包埋，具备制备过程简单、对微生物无毒害、传质性能良好、使用后可降解无毒害、价格低廉的优点，具有较高的实用性。
Description
技术领域
本发明涉及固定化工艺技术领域，具体为一种微生物菌剂的固定化工艺。
背景技术
固定化微生物技术是20世纪70年代发展起来的一项生物技术，是指利用物理或化学手段将游离微生物限定在特定载体内，使其高浓度富集的一种新型技术，是生物工程的重要分支。固定化微生物技术自问世以来，己广泛应用于食品加工、土壤修复和废水处理等领域，具有广阔的发展前景。
目前常见的固定化技术手段是将游离微生物细胞固定在海藻酸钠、聚乙烯醇，聚丙烯酰胺等材料做成的颗粒中。颗粒形成的微环境相对封闭，对外部环境影响起到缓冲作用，微生物能在颗粒内部保持活性和增殖，易于形成优势菌群，有利于人工接种微生物的存活和与土著菌的生态竞争。该技术的最大特点是生物密度高、作用持久，克服了微生物细胞对环境敏感、性质不稳定、易失活或死亡等缺点，己经成为生物工程领域的重要分支。
目前固定化微生物的方法主要有包埋法、吸附法两大类。包埋法是用物理方法将微生物包裹在凝胶的网格结构中，实现对微生物的固定化。常用的凝胶载体有海藻酸钠、聚乙烯醇、卡拉胶、琼脂、聚丙烯酰胺、醋酸纤维、明胶等。
包埋法有很多优点：操作简单，制备条件较温和，载体种类较多，选择性大，可根据微生物特性和要求选用合适的载体材料，以保持较高的微生物活性等；可以包埋较多的微生物，短时间内获得较高微生物浓度；微生物能均匀地分布在凝胶网格内；包埋后固定化微生物的微环境适于微生物生长，能快速增殖。包埋法也存在一些局限性：有些包埋载体材料形成的凝胶结构对高分子底物的通透性较差，影响了传质效果；有些载体材料形成的凝胶的传质效果虽较好，但在使用过程中强度不高、受压易变形、破裂粉碎，大多载体在微生物固定化时仅能形成块状或膜状的凝胶，不能形成小球状或珠状的凝胶颗粒；有些载体材料的生物分解性较差，不能有效地降解，造成二次污染。因此，需要一种强度高、传质好、生物分解性好的微生物固定化工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物菌剂的固定化工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种微生物菌剂的固定化工艺，包括以下步骤：
S1：制备可降解包埋袋；
S2：制备微生物菌剂；
S3：微生物菌剂包埋固定。
进一步的，S1：
将聚己内酯粉末置于玻璃板上加热至全部融化，将融化的聚己内酯在玻璃上展平，停止加热，冷却聚己内酯，得到聚己内酯薄膜，将聚己内酯薄膜均匀打孔，分割成小块，对折封边，制得可降解包埋袋，聚己内酯先从周围环境中吸收水分，主链由于水解或酶解导致化学链断裂，分子量和力学性能下降，高聚物变成低聚物碎片，质量降低，进一步水解成二氧化碳和水，无毒害，不会产生二次污染；
进一步的，S2：
将载体、二氧化硅、去离子水混合成基质，进行灭菌，降温，将微生物与基质混合搅拌均匀，冷却至室温，形成微生物菌剂备用；
进一步的，S3：
将上述制备好的微生物菌剂分割成小块，装入可降解包埋袋中，封口后即得到包埋好的微生物菌剂产品。
进一步的，S1：
(1)将聚己内酯粉末置于玻璃板上面加热，升温至100℃，直至聚已内酯全部融化；
(2)用热风枪将融化的聚己内酯向玻璃四周吹赶，吹至全部展平，停止加热；
(3)将展平的聚己内酯置于室温下冷却，冷却后轻轻从玻璃上揭下，得到聚己内酯薄膜备用；
(4)采用打孔针将(3)制备好的聚己內酯薄膜均匀打孔，然后分割成长宽比为2：1的长方形单元小块，将长方形单元小块薄膜对折后形成正方形单元小块，两侧用烧热的铁丝封边，形成只有一边开口的可降解包埋袋；
进一步的，S2：
(1)将载体、二氧化硅、去离子水混合成基质，放入110～140℃的高压灭菌锅中进行灭菌处理20～35min；
(2)将灭完菌的基质置于35～50℃的水浴锅中进行降温，直至温度降为4℃；
(3)将微生物添加至基质中搅拌至混合均匀，取出基质冷却至室温后凝固，形成微生物菌剂备用；
进一步的，S3：
将上述制备好的微生物菌剂分割成单元小块，装入可降解包埋袋中，用热铁丝进行封口后即得到包埋好的微生物菌剂产品。
进一步的，所述聚己内酯薄膜的厚度为0.5～2μm。
进一步的，所述载体为琼脂、卡拉胶、海藻酸钠、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、明胶中的任一种。
进一步的，所述载体优选为琼脂，以琼脂为载体具备以下特点：对微生物无毒性、具有高的载体活性、性质稳定，材料容易获得，价格便宜、操作制备方便，能适用于大规模生产、传质性能好，但琼脂的机械强度较差，加入二氧化硅可以增强琼脂的机械强度。
进一步的，所述载体、二氧化硅、去离子水的质量比为(10～40)：1：479。
进一步的，所述微生物常用的有枯草芽孢杆菌、乳酸芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蛋白质降解菌、纤维素降解菌中的任一种或多种。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
本发明公开了一种微生物菌剂的固定化工艺，采用本工艺固定的微生物菌剂，在使用前期可通过包埋袋上的微孔进行持续释放，在使用2个月后包埋袋开始降解，微生物菌剂全面释放，降解产物为水和二氧化碳，无毒害，不会产生二次污染，通过本发明公开的固定化工艺来进行复合微生物的固定化包埋，具备制备过程简单、对微生物无毒害、传质性能良好、使用后可降解无毒害、价格低廉的优点，具有较高的实用性。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种微生物菌剂的固定化工艺，包括以下步骤：
S1：制备可降解包埋袋；
S2：制备微生物菌剂；
S3：微生物菌剂包埋固定。
其中，S1：
(1)将聚己内酯粉末25g放在一块规格为1m*1m的玻璃板上面加热，温度为100℃；
(2)加热至聚己内酯全部融化后，用热风枪将融化的聚己内酯向玻璃四周吹赶，吹至全部展平，停止加热；
(3)将展平的聚己内酯置于室温下冷却，冷却后轻轻从玻璃上揭下，得到厚度为0.5μm的聚己内酯薄膜备用；
(4)采用1μm打孔针将(3)制备好的聚己內酯薄膜均匀打孔，然后分割成4cm*2cm规格的单元小块，将单元小块薄膜对折后形成2cm*2cm的正方形，两侧用烧热的铁丝封边，形成只有一边开口的可降解包埋袋；
其中，S2：
(1)将琼脂、二氧化硅、去离子水按照质量比10：1：479混合成基质，放入110℃的高压灭菌锅中进行灭菌处理20min；
(2)将灭完菌的基质置于35℃的水浴锅中进行降温，直至温度降为4℃；
(3)将枯草芽孢杆菌添加至基质中搅拌至混合均匀，取出基质冷却至室温后凝固，形成微生物菌剂备用；
其中，S3：
将上述制备好的微生物菌剂分割成1cm*1cm的单元小块，装入可降解包埋袋中，用热铁丝进行封口后即得到包埋好的微生物菌剂产品。
实施例2
一种微生物菌剂的固定化工艺，包括以下步骤：
S1：制备可降解包埋袋；
S2：制备微生物菌剂；
S3：微生物菌剂包埋固定。
其中，S1：
(1)将聚己内酯粉末50g放在一块规格为1m*1m的玻璃板上面加热，温度为100℃；
(2)加热至聚己内酯全部融化后，用热风枪将融化的聚己内酯向玻璃四周吹赶，吹至全部展平，停止加热；
(3)将展平的聚己内酯置于室温下冷却，冷却后轻轻从玻璃上揭下，得到厚度为1μm的聚己内酯薄膜备用；
(4)采用1μm打孔针将(3)制备好的聚己內酯薄膜均匀打孔，然后分割成4cm*2cm规格的单元小块，将单元小块薄膜对折后形成2cm*2cm的正方形，两侧用烧热的铁丝封边，形成只有一边开口的可降解包埋袋；
其中，S2：
(1)将琼脂、二氧化硅、去离子水按照质量比20：1：479混合成基质，放入120℃的高压灭菌锅中进行灭菌处理25min；
(2)将灭完菌的基质置于40℃的水浴锅中进行降温，直至温度降为4℃；
(3)将枯草芽孢杆菌添加至基质中搅拌至混合均匀，取出基质冷却至室温后凝固，形成微生物菌剂备用；
其中，S3：
将上述制备好的微生物菌剂分割成1cm*1cm的单元小块，装入可降解包埋袋中，用热铁丝进行封口后即得到包埋好的微生物菌剂产品。
实施例3
一种微生物菌剂的固定化工艺，包括以下步骤：
S1：制备可降解包埋袋；
S2：制备微生物菌剂；
S3：微生物菌剂包埋固定。
其中，S1：
(1)将聚己内酯粉末75g放在一块规格为1m*1m的玻璃板上面加热，温度为100℃；
(2)加热至聚己内酯全部融化后，用热风枪将融化的聚己内酯向玻璃四周吹赶，吹至全部展平，停止加热；
(3)将展平的聚己内酯置于室温下冷却，冷却后轻轻从玻璃上揭下，得到厚度为1.5μm的聚己内酯薄膜备用；
(4)采用1μm打孔针将(3)制备好的聚己內酯薄膜均匀打孔，然后分割成4cm*2cm规格的单元小块，将单元小块薄膜对折后形成2cm*2cm的正方形，两侧用烧热的铁丝封边，形成只有一边开口的可降解包埋袋；
其中，S2：
(1)将琼脂、二氧化硅、去离子水按照质量比30：1：479混合成基质，放入130℃的高压灭菌锅中进行灭菌处理30min；
(2)将灭完菌的基质置于45℃的水浴锅中进行降温，直至温度降为4℃；
(3)将枯草芽孢杆菌添加至基质中搅拌至混合均匀，取出基质冷却至室温后凝固，形成微生物菌剂备用；
其中，S3：
将上述制备好的微生物菌剂分割成1cm*1cm的单元小块，装入可降解包埋袋中，用热铁丝进行封口后即得到包埋好的微生物菌剂产品。
实施例4
一种微生物菌剂的固定化工艺，包括以下步骤：
S1：制备可降解包埋袋；
S2：制备微生物菌剂；
S3：微生物菌剂包埋固定。
其中，S1：
(1)将聚己内酯粉末100g放在一块规格为1m*1m的玻璃板上面加热，温度为100℃；
(2)加热至聚己内酯全部融化后，用热风枪将融化的聚己内酯向玻璃四周吹赶，吹至全部展平，停止加热；
(3)将展平的聚己内酯置于室温下冷却，冷却后轻轻从玻璃上揭下，得到厚度为2μm的聚己内酯薄膜备用；
(4)采用1μm打孔针将(3)制备好的聚己內酯薄膜均匀打孔，然后分割成4cm*2cm规格的单元小块，将单元小块薄膜对折后形成2cm*2cm的正方形，两侧用烧热的铁丝封边，形成只有一边开口的可降解包埋袋；
其中，S2：
(1)将琼脂、二氧化硅、去离子水按照质量比40：1：479混合成基质，放入140℃的高压灭菌锅中进行灭菌处理35min；
(2)将灭完菌的基质置于50℃的水浴锅中进行降温，直至温度降为4℃；
(3)将枯草芽孢杆菌添加至基质中搅拌至混合均匀，取出基质冷却至室温后凝固，形成微生物菌剂备用；
其中，S3：
将上述制备好的微生物菌剂分割成1cm*1cm的单元小块，装入可降解包埋袋中，用热铁丝进行封口后即得到包埋好的微生物菌剂产品。
对比例1
一种微生物菌剂的固定化工艺，包括以下步骤：
S1：制备可降解包埋袋；
S2：制备微生物菌剂；
S3：微生物菌剂包埋固定。
其中，S1：
(1)将聚己内酯粉末50g放在一块规格为1m*1m的玻璃板上面加热，温度为100℃；
(2)加热至聚己内酯全部融化后，用热风枪将融化的聚己内酯向玻璃四周吹赶，吹至全部展平，停止加热；
(3)将展平的聚己内酯置于室温下冷却，冷却后轻轻从玻璃上揭下，得到厚度为1μm的聚己内酯薄膜备用；
(4)采用1μm打孔针将(3)制备好的聚己內酯薄膜均匀打孔，然后分割成4cm*2cm规格的单元小块，将单元小块薄膜对折后形成2cm*2cm的正方形，两侧用烧热的铁丝封边，形成只有一边开口的可降解包埋袋；
其中，S2：
(1)将卡拉胶、二氧化硅、去离子水按照质量比20：1：479混合成基质，放入120℃的高压灭菌锅中进行灭菌处理25min；
(2)将灭完菌的基质置于40℃的水浴锅中进行降温，直至温度降为4℃；
(3)将枯草芽孢杆菌添加至基质中搅拌至混合均匀，取出基质冷却至室温后凝固，形成微生物菌剂备用；
其中，S3：
将上述制备好的微生物菌剂分割成1cm*1cm的单元小块，装入可降解包埋袋中，用热铁丝进行封口后即得到包埋好的微生物菌剂产品。
对比例2
一种微生物菌剂的固定化工艺，包括以下步骤：
S1：制备可降解包埋袋；
S2：制备微生物菌剂；
S3：微生物菌剂包埋固定。
其中，S1：
(1)将聚己内酯粉末50g放在一块规格为1m*1m的玻璃板上面加热，温度为100℃；
(2)加热至聚己内酯全部融化后，用热风枪将融化的聚己内酯向玻璃四周吹赶，吹至全部展平，停止加热；
(3)将展平的聚己内酯置于室温下冷却，冷却后轻轻从玻璃上揭下，得到厚度为1μm的聚己内酯薄膜备用；
(4)采用1μm打孔针将(3)制备好的聚己內酯薄膜均匀打孔，然后分割成4cm*2cm规格的单元小块，将单元小块薄膜对折后形成2cm*2cm的正方形，两侧用烧热的铁丝封边，形成只有一边开口的可降解包埋袋；
其中，S2：
(1)将聚乙烯酰胺、二氧化硅、去离子水按照质量比20：1：479混合成基质，放入120℃的高压灭菌锅中进行灭菌处理25min；
(2)将灭完菌的基质置于40℃的水浴锅中进行降温，直至温度降为4℃；
(3)将枯草芽孢杆菌添加至基质中搅拌至混合均匀，取出基质冷却至室温后凝固，形成微生物菌剂备用；
其中，S3：
将上述制备好的微生物菌剂分割成1cm*1cm的单元小块，装入可降解包埋袋中，用热铁丝进行封口后即得到包埋好的微生物菌剂产品。
对比例3
一种微生物菌剂的固定化工艺，包括以下步骤：
S1：制备可降解包埋袋；
S2：制备微生物菌剂；
S3：微生物菌剂包埋固定。
其中，S1：
(1)将聚己内酯粉末50g放在一块规格为1m*1m的玻璃板上面加热，温度为100℃；
(2)加热至聚己内酯全部融化后，用热风枪将融化的聚己内酯向玻璃四周吹赶，吹至全部展平，停止加热；
(3)将展平的聚己内酯置于室温下冷却，冷却后轻轻从玻璃上揭下，得到厚度为1μm的聚己内酯薄膜备用；
(4)采用1μm打孔针将(3)制备好的聚己內酯薄膜均匀打孔，然后分割成4cm*2cm规格的单元小块，将单元小块薄膜对折后形成2cm*2cm的正方形，两侧用烧热的铁丝封边，形成只有一边开口的可降解包埋袋；
其中，S2：
(1)将明胶、二氧化硅、去离子水按照质量比20：1：479混合成基质，放入120℃的高压灭菌锅中进行灭菌处理25min；
(2)将灭完菌的基质置于40℃的水浴锅中进行降温，直至温度降为4℃；
(3)将枯草芽孢杆菌添加至基质中搅拌至混合均匀，取出基质冷却至室温后凝固，形成微生物菌剂备用；
其中，S3：
将上述制备好的微生物菌剂分割成1cm*1cm的单元小块，装入可降解包埋袋中，用热铁丝进行封口后即得到包埋好的微生物菌剂产品。
以实施例1、2、3、4和对比例1、2、3作为试样，制得包埋好的微生物菌剂产品后将其埋入泥浆培养基中，静置2个月后测量其微生物存活率和载体降解率，静置4个月后再次测量其微生物存活率和载体降解率。
实施例1、2、3、4所用载体为琼脂，微生物存活率及载体降解率较好，实验结果较为理想；
对比实施例2，对比例1所用载体为卡拉胶，卡拉胶的强度要比琼脂高，但耐生物分解性不如琼脂，载体分解较快，相同条件下微生物存活率比琼脂为载体的要低，且价格贵；
对比实施例2，对比例2所用载体为聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺的强度比琼脂高，耐生物分解性比琼脂高，但聚丙烯酰胺有生物毒性，载体分解较慢，但微生物存活率极低，且价格贵；
对比实施例2，对比例3所用载体为明胶，明胶的强度和耐生物分解性都比琼脂要低，载体分解最快，相同条件下微生物存活率比琼脂为载体的要低，且价格较贵。
综合以上数据，载体为琼脂时，所得实验数据最为理想，本发明公开的一种微生物菌剂的固定工艺，可以实现制备过程简单、对微生物无毒害、传质性能良好、使用后可降解无毒害、价格低廉的优点，具有较高的实用性。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而己，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种微生物菌剂的固定化工艺，其特征在于：
包括以下步骤：
S1：制备可降解包埋袋；
S2：制备微生物菌剂；
S3：微生物菌剂包埋固定。
2.根据权利要求1所述的一种微生物菌剂的固定化工艺，其特征在于：
所述S1：
将聚己内酯粉末置于玻璃板上加热至全部融化，将融化的聚己内酯在玻璃上展平，停止加热，冷却聚己内酯，得到聚己内酯薄膜，将聚己内酯薄膜均匀打孔，分割成小块，对折封边，制得可降解包埋袋；
所述S2：
将载体、二氧化硅、去离子水混合成基质，进行灭菌，降温，将微生物与基质混合搅拌均匀，冷却至室温，形成微生物菌剂备用；
所述S3：
将上述制备好的微生物菌剂分割成小块，装入可降解包埋袋中，封口后即得到包埋好的微生物菌剂产品。
3.根据权利要求2所述的一种微生物菌剂的固定化工艺，其特征在于：
所述S1：
(1)将聚己内酯粉末置于玻璃板上面加热，升温至100℃，直至聚已内酯全部融化；
(2)用热风枪将融化的聚己内酯向玻璃四周吹赶，吹至全部展平，停止加热；
(3)将展平的聚己内酯置于室温下冷却，冷却后轻轻从玻璃上揭下，得到聚己内酯薄膜备用；
(4)采用打孔针将(3)制备好的聚己內酯薄膜均匀打孔，然后分割成长宽比为2：1的长方形单元小块，将长方形单元小块薄膜对折后形成正方形单元小块，两侧用烧热的铁丝封边，形成只有一边开口的可降解包埋袋；
所述S2：
(1)将载体、二氧化硅、去离子水混合成基质，放入110～140℃的高压灭菌锅中进行灭菌处理20～35min；
(2)将灭完菌的基质置于35～50℃的水浴锅中进行降温，直至温度降为4℃；
(3)将微生物添加至基质中搅拌至混合均匀，取出基质冷却至室温后凝固，形成微生物菌剂备用；
所述S3：
将上述制备好的微生物菌剂分割成单元小块，装入可降解包埋袋中，用热铁丝进行封口后即得到包埋好的微生物菌剂产品。
4.根据权利要求3所述的一种微生物菌剂的固定化工艺，其特征在于：所述聚己内酯薄膜的厚度为0.5～2μm。
5.根据权利要求3所述的一种微生物菌剂的固定化工艺，其特征在于：所述载体为琼脂、卡拉胶、海藻酸钠、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、明胶中的任一种。
6.根据权利要求5所述的一种微生物菌剂的固定化工艺，其特征在于：所述载体优选为琼脂。
7.根据权利要求3所述的一种微生物菌剂的固定化工艺，其特征在于：所述载体、二氧化硅、去离子水的质量比为(10～40)：1：479。
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| Title |
|---|
| BALAKRISHNAN等: "Star poly(ε-caprolactone)-based electrospun fibers as biocompatible scaffold for doxorubicin with prolonged drug release activity", 《COLLOIDS AND SURFACES B:BIOINTERFACES》 * |
| 史增谦: "生物可降解聚合物空腔结构的制备", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（博士） 工程科技I辑》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112522247B (zh) | 2022-12-13 |
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