CN112521435B - 一种罗红霉素类似物在制备抗菌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种罗红霉素类似物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于，所述罗红霉素类似物结构式如下式所示：

本发明制备的罗红霉素类似物，对于肺炎球菌、草绿色链球菌、金黄色葡萄球菌或草绿色链球菌，均有显著的抗菌活性，尤其是对于草绿色链球菌和金黄色葡萄球菌，其抗菌活性甚至优于罗红霉素。

Description

一种罗红霉素类似物在制备抗菌药物中的应用

技术领域

本发明属于药物化学领域，涉及一种罗红霉素类似物的在制备抗菌药物中的应用。

背景技术

红霉素(EA)最初由Lilly公司分离得到的第一个大环内酯类抗生素药物，是近半个世纪以来使用最广泛的高效抗大多数革兰氏阳性菌和一些革兰氏阴性菌的抗生素。主要由内酯环、德糖胺和克拉定糖组成。

由于红霉素在酸性条件下不稳定，红霉素经口服后很容易在胃酸作用下经分子内反应生成无抗菌活性的螺缩酮衍生物，造成药物的生物利用率低。为了提高其稳定性，人们对涉及反应位点的C-6，C-9，C-11及C-12等进行结构改造，抑制环合降解，合成了一系列半合成的红霉素衍生物。得到了第二代的大环内酯类红霉素衍生物罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素和第三代大环内酯类衍生物泰利霉素、赛红霉素等。然而随着这些抗生素的广泛使用,细菌对它们的耐药性也越来越强，而细菌对抗生素产生耐药性是不可逆转的，人类对感染性疾病将面临无药可医的困境。近期，耐万古霉素的“超级细菌”的出现,使得寻找和开发新的抗生素已迫在眉睫。以活性天然产物为母体进行化学结构修饰合成新的衍生物，比从自然界中随机筛选新的天然产物更具有针对性,是目前发现新药的重要途径之一。由于大部分天然产物的结构十分复杂，采用化学方法进行直接合成往往非常困难。由此发展的组合生物合成技术为得到具有高活性的复杂天然产物类似物的提供了一条可能的途径。

在红霉素发酵的过程中，会产生一系列杂质，红霉素分为红霉素A、B、C、D、E、F。红霉素E的制备仅在1973年的美国专利有报导，可以通过红霉素链霉菌(NRRL3887)发酵，再分离提纯来得到(US3714142)。红霉素A、B、C、D、E的活性差别比较大，仅红霉素A是红霉素主要的活性成分。B虽然抗菌谱和抗菌活性与红霉素A相似，但是B的毒性比A大两倍。红霉素C不是活性物质，因此B和C除了发酵过程需要控制含量，后续处理的过程当中也需要除去，以提高活性物质A的含量。红霉素E由于含量低，研究的很少，抗菌活性仅为A的13％(Tetrahedron,1975,31(17):1985-1989)，一般是作为非活性物质除去(红霉素高产菌株诱变育种与发酵过程优化[D].华东理工大学，2015；红霉素发酵调控及过程优化研究[D].华东理工大学,2013.)。

申请人在之前的研究中也发现，红霉素E和羟胺反应衍生化之后的产物，红霉素E肟的抗菌活性也远不如红霉素A肟(孟祥燕,李娜,彭凤,et al.9-(E)-红霉素A肟杂质的分离与鉴定[J].中国抗生素杂志，2016，41(004):280-284.)，在本申请之前红霉素E肟均作为未知的杂质包括在红霉素A肟中。

发明内容

本发明的目的是提供一种罗红霉素类似物，该罗红霉素类似物被发现在制备抗菌药物时，具有优异的效果。

本发明提供的一种罗红霉素类似物，其结构式如下式所示：

所述罗红霉素类似物可以采用以下方法制备而得：

(1)硫氰酸红霉素E精制

将硫氰酸红霉素粗粉常温投入反应罐中，再加入甲醇，搅拌后加入冰醋酸至完全溶解，完全溶解后PH＝5～6，用液碱调节PH至11，滴加水，抽滤，取母液样，用二氯甲烷萃取三次，搅拌，静置，取下层液，常温减压浓缩，得粗产品，而后使用硅胶柱层析，采用梯度洗脱方式，最终得到精制的样品；

(2)制备9-(E)-红霉素A肟硫氰酸盐

室温下，投入甲醇、三乙胺、精制的硫氰酸红霉素E、盐酸羟胺、冰醋酸，调节pH＝6.5-6.9，逐步升温至55℃，继续反应，反应完毕，将反应逐渐降温至20℃，加入纯化水，然后继续降温至5℃，过滤，固体水洗得湿肟盐；将湿肟盐加入甲醇，加热至25℃，加入NaOH溶液，调至pH在11.0左右，再加入纯水析晶，搅拌后离心，固体水洗，得到白色粉末状固体，烘干得产物(化合物2)；

(3)制备罗红霉素类似物

将步骤(2)制备的产物(化合物2)溶解在二甲基甲酰胺溶剂中，升温至全溶，然后用冰水降温度10℃以下，加入甲醇钠甲醇溶液，搅拌，继续降温，加入DMF和1-甲氧基-2-氯甲氧基乙烷，反应结束后用醋酸调PH至6.5～7.5，将料液移至浓缩罐浓缩，至基本浓缩干后，加入3.0～5.0倍甲醇溶解，加入适量活性炭，保持温度35～45℃脱色30分钟以上，过滤，料液移至结晶罐中，调pH至10.5～11.5，经结晶、离心甩干、真空干燥，得罗红霉素类似物(化合物3)。

涉及的化学反应方程式如下：

本发明制备的罗红霉素类似物(化合物3)，在制备抗菌药物中具有显著的用途。针对肺炎球菌、草绿色链球菌、金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌均有良好的抗菌活性，特别是针对草绿色链球菌、金黄色葡萄球菌，其抗菌活性优于罗红霉素。

本发明的有益效果如下：

申请人在通过对原先为杂质组分的红霉素E进行有效分离提纯时发现，在该结构的基础上进行衍生化得到特定的罗红霉素衍生物。通过进一步研究发现：该结构的罗红霉素衍生物，与作为杂质的红霉素E以及红霉素E肟的低抗菌活性均有明显不同，显示出了和罗红霉素相当甚至略优于罗红霉素的抗菌活性，说明该化合物也有成为新型抗菌药物的潜力，而形成二氧杂六环的结构则可以作为一种新的衍生化方案进行进一步的研究；同时，对于罗红霉素的生产工艺来说，如果罗红霉素类似物(化合物3)的抗菌活性和罗红霉素相当，则在后续的生产中就无需考虑罗红霉素类似物(化合物3)作为杂质的含量问题，因此，具备较为广泛的工业应用前景和经济价值。

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为精制前硫氰酸红霉素样品的HPLC图(Shodex Asahipak ODP-50(250mm×4.6mm)，以乙腈(色谱纯):0.5％磷酸二氢铵(A.R)缓冲液＝3:4体积比为流动相，流速为1mL/min，在210nm处检测，柱温为50℃)；

图2为精制后所得到硫氰酸红霉素E样品的HPLC图(反相柱C18柱RP-C18(250mm×4.6mm)，以乙腈(色谱纯):0.5％磷酸二氢铵(A.R)缓冲液＝35:65为流动相，流速为0.8mL/min，在215nm处检测，柱温为50℃)；

图3为实施例3制备的罗红霉素类似物样品的HPLC图(反相柱C18柱RP-C18(250mm×4.6mm)，以乙腈(色谱纯):0.5％磷酸二氢铵(A.R)缓冲液＝35:65为流动相，流速为1mL/min，在215nm处检测，柱温为35℃)；

图4为精制后化合物3的高分辨质谱图；

图5为精制后化合物3的¹HNMR图(600M，CDCl₃)；

图6为精制后化合物3的¹³CNMR图(125M，CDCl₃)；

图7为精制后化合物3的红外谱图。

具体实施方式

实施例1：硫氰酸红霉素E精制

以硫氰酸红霉素粗粉(其中硫氰酸红霉素E含量为2.6％)为原料，起始的硫氰酸红霉素粗粉的液相分析如图1、表1所示，将粗粉1.5kg常温投入反应罐中，再加入甲醇3.0L(2倍粗粉质量体积)，搅拌20分钟，加入冰醋酸至完全溶解，冰醋酸投入量约为200ml，完全溶解后PH＝5～6，用液碱调节PH至11，PH＝9时有固体析出，滴加工艺用水3.5L，滴加水，抽滤，取母液样，用二氯甲烷2.5L萃取三次，搅拌，静置，取下层液，常温减压浓缩，得粗产品47g，而后使用硅胶柱层析(400目)，流动相为(二氯甲烷和甲醇氨水溶液)，采用梯度洗脱方式，最终得到硫氰酸红霉素E样品10g，精制后所得到硫氰酸红霉素E液相分析如图2、表2所示，纯度达到88.8％。

表1、

表2

实施例2：

室温下，在装有机械搅拌、温度计，冷凝管的50ml三口烧瓶中，投入甲醇15ml，三乙胺4.45g(0.044mol)，硫氰酸红霉素E(主含量88.8％)10.0g(0.012mol)，盐酸羟胺3.36g(0.048mol)，冰醋酸1.08ml(1.13g，0.019mol)，pH＝6.5-6.9，逐步升温至55℃，继续反应24h结束。反应用HPLC监控红霉素E含量<0.5％为反应完全。反应完毕，将反应逐渐降温至20℃，加入25ml纯化水，然后继续降温至5℃，过滤，固体水洗得湿肟盐(9-(E)-红霉素A肟硫氰酸盐)10.2g。

将湿肟盐投入100ml三口烧瓶中，加入26ml甲醇，加热至25℃，加入30％NaOH溶液，调至pH在11.0左右，再缓慢加入50ml纯水析晶，加完搅拌12h后离心，固体水洗，得到白色粉末状固体。在65℃左右烘干至恒重，得产物(化合物2)约7.9g，总收率约87％。

实施例3：

将3g(3.65mmol)实施例2制备的产物(化合物2)溶解在12mL的二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，升温至全溶。然后用冰水降温度10℃以下，加入0.8mL(0.25g/g浓度)的甲醇钠甲醇溶液，搅拌，继续降温。在恒压滴液漏斗中，加入约10mL的DMF和1-甲氧基-2-氯甲氧基乙烷0.52g(4.17mmol)。当料液降温至0℃以下，缓慢滴加，加完后搅拌。反应结束后用醋酸调PH至6.5～7.5，将料液移至浓缩罐浓缩，控制内温小于65℃。至基本浓缩干后，加入3.0～5.0倍甲醇(V/m)溶解，加入适量活性炭，保持温度35～45℃脱色30分钟以上。过滤，料液移至结晶罐中，用液碱调pH至10.5～11.5，再加入甲醇体积1.5～2.5倍的工艺用水(V/V)结晶。将固体离心甩干，真空干燥，得罗红霉素类似物(化合物3)，产量为2.2g，产率70％(纯度80.2％，无罗红霉素的峰出现)。

精制：将实施例3所得到的产物(化合物3)，经实施例1的分离提纯方式进行提纯，最终得到纯度为90％的目标产物。

结构确认：

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+H]⁺Calcd for C₄₁H₇₅N₂O₁₆ 851.5117，found 851.5105。

其结构表征的图谱如表3、图3、图4、图5、图6、图7所示。

表3

实施例4：罗红霉素类似物3的抗菌活性的测定

(一)试验内容：

采用微量液体二倍稀释法，测定化合物的最低抑菌浓度(MIC)。

(二)试验材料与方法：

1.培养基

MH液体培养基，北京三药科技开发公司，按配方配制高压灭菌后备用。

RPMI-1640液体培养基，美国Gibco公司产品，按配方配制高压灭菌后备用。

2.供试品

样品：采用实施例3精制后的罗红霉素类似物。

对照品：罗红霉素；中国食品药品检定研究院，批号130557-201604。

3.试验菌株

选取临床致病菌15株，菌株编号如下：金黄色葡萄球菌3株(编号金1～金3)；肺炎球菌3株(编号肺1～肺3)；大肠埃希菌3株(编号大1～大3)，草绿色链球菌3株(编号链1～链3)，白色念珠菌3株(编号白1～白3)。另选择金黄色葡萄球菌ATCC29213、ATCC25923为质控菌株。

上述菌株分别由南方医院临床分离并鉴定种属后提供，本室保存于-80℃。

4.菌悬液制备

取各实验菌株新鲜斜面菌种，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌接种于5ml营养肉汤培养基，肺炎球菌、草绿色链球菌接种于5ml营养肉汤培养基(含5％马血清)，35℃培养8小时，用灭菌MH液体培养基适当稀释至浓度约1～9×10⁵CFU/ml备用。

取白色念珠菌新鲜斜面菌种，接种于5ml沙氏肉汤培养基，28℃培养36小时，用灭菌RPMI1640液体培养基适当稀释至浓度约1～9×10⁴CFU/ml备用。

5.药物溶解和稀释

精密称取样品与罗红霉素适量，加入少量无水乙醇溶解后，制备得1280μg/ml供试液，用无菌水如下稀释：

取1280μg/ml稀释液2ml加入2ml无菌水，得640μg/ml稀释液；

取1280μg/ml稀释液1ml加入3ml无菌水，得320μg/ml稀释液；

取1280μg/ml稀释液1ml加入7ml无菌水，得160μg/ml稀释液；

取160μg/ml稀释液2ml加入2ml无菌水，得80μg/ml稀释液；

取160μg/ml稀释液1ml加入3ml无菌水，得40μg/ml稀释液；

取160μg/ml稀释液1ml加入7ml无菌水，得20μg/ml稀释液；

取20μg/ml稀释液2ml加入2ml无菌水，得10μg/ml稀释液；

取20μg/ml稀释液1ml加入3ml无菌水，得5μg/ml稀释液；

取20μg/ml稀释液1ml加入7ml无菌水，得2.5μg/ml稀释液；

取2.5μg/ml稀释液2ml加入2ml无菌水，得1.25μg/ml稀释液；

取2.5μg/ml稀释液1ml加入3ml无菌水，得0.625μg/ml稀释液；

取2.5μg/ml稀释液1ml加入7ml无菌水，得0.3125μg/ml稀释液；

取0.3125μg/ml稀释液2ml加入2ml无菌水，得0.15625μg/ml稀释液。

6.含药液体培养基的制备

6.1MH培养基(细菌测试)

分别取上述制备的各浓度稀释液1ml，加入MH液体培养基9ml，混匀后备用，得浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625μg/ml的系列含药液体培养基。其中肺炎球菌、草绿色链球菌采用的MH培养基中含5％马血清。

6.2RPMI1640培养基(白色念珠菌测试)

分别取上述制备的各浓度稀释液1ml，加入RPMI1640液体培养基9ml，混匀后备用，得浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625μg/ml的系列含药液体培养基。

7.接种及培养

吸取各浓度含药液体培养基0.9ml分装至灭菌试管，标记，无菌操作加入0.1ml已制备的试验菌悬液，每一菌株实验浓度为0.015625～128μg/ml共计14个浓度。混匀后，将试管放置于37℃培养20小时，取出观察结果，记录生长状况，以能抑制相应实验菌生长的最低稀释度为该药物的最低抑菌浓度(MIC)。

(三)实验结果

培养后观察结果，罗红霉素类似物与罗红霉素对各测试细菌菌株均具有一定的抗菌活性，但对白色念珠菌在测试浓度范围内未显示抗菌活性。其最低抑菌浓度(MIC)见表4。

表4、MIC测定结果(单位：μg/ml)

结论：

体外抗菌活性测定结果显示：对于大部分的菌种，罗红霉素类似物3表现出了和罗红霉素相当的抗菌作用，部分菌种的抗菌活性甚至略优于罗红霉素，对革兰阳性苛养菌肺炎球菌、草绿色链球菌的抗菌活性较好，其MIC值均小于或等于1μg/ml；对革兰阳性的金黄色葡萄球菌的MIC值范围约为2～4μg/ml，优于革兰阴性的大肠埃希菌(16～64μg/ml)；对白色念珠菌未显示抗菌作用。其中对草绿色链球菌、金黄色葡萄球菌的抗菌活性优于罗红霉素，分析其原因，其对应的结构特征就是C2位的R²，R³之间形成了氧杂环的结构，因此，本发明形成二氧杂六元环的结构是提高红霉素衍生物抗菌活性的一种新型的方法，在此基础上所做的优化，可以增强其抗菌活性。从而解决了现有罗红霉素衍生物普遍作为杂质的含量问题，对于罗红霉素的生产工艺来说，具备较为广泛的工业应用前景和经济价值。

Claims (3)

1.一种罗红霉素类似物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：所述罗红霉素类似物的结构式如下式所示：

2.根据权利要求1所述的一种罗红霉素类似物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：所述菌种为肺炎球菌、草绿色链球菌或金黄色葡萄球菌。

3.根据权利要求1所述的一种罗红霉素类似物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：所述罗红霉素类似物对于草绿色链球菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性优于罗红霉素。

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