CN112516145A - 小分子化合物wk369在制备治疗卵巢癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种如式(I)所示的小分子化合物WK369在制备治疗卵巢癌药物中的应用，作为新型B细胞淋巴因子6(BCL6)的抑制剂，在分子水平该化合物可以竞争性结合到BCL6N端的BTB/POZ结构域，阻断BCL6与转录共抑制子SMRT的相互作用，抑制BCL6的转录抑制功能，使BCL6下游的靶基因重新激活。在细胞水平上该化合物能够选择性的抑制BCL6高表达卵巢癌细胞的增殖和迁移，促进其发生周期阻滞和凋亡。在动物水平上，该化合物能够显著抑制小鼠生发中心的形成以及BCL6高表达卵巢癌耐药肿瘤的生长和转移，并且上述给药过程中未显示明显的毒性，具有治疗BCL6高表达耐药卵巢癌的良好应用前景。

Description

小分子化合物WK369在制备治疗卵巢癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及小分子化合物WK369作为BCL6抑制剂在制备治疗卵巢癌疾病的药物中的应用。

背景技术

在全球范围内，卵巢癌(Ovarian cancer)是发病率仅次于子宫癌的第二常见女性生殖系统恶性肿瘤。此外，卵巢癌也是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，平均每年约有24万例卵巢癌新增病例和1.5万人死于卵巢癌，其五年生存率低于45％(CA CancerJClin.2019Jan；69(1):7-34)。

世界卫生组织(WHO)根据卵巢癌细胞的起源，发病机理，恶性程度以及预后等因素，将卵巢癌主要分为表面上皮性肿瘤，生殖细胞肿瘤，性索基质细胞肿瘤以及转移灶肿瘤四种类型，其中最常见的是上皮性肿瘤，大约有90％的恶性卵巢癌都起源于此。国际妇产科联合会(FIGO)根据癌症转移情况对卵巢癌的病理学分期进行了标准划分，主要分为病变局限于卵巢(I期)；卵巢伴盆腔转移，包括转移到子宫或输卵管内(II期)；病变转移到盆腔以外或腹膜后淋巴结(III期)；远端转移，包括转移到远端器官、腹部外淋巴结等(IV期)四个时期。由于卵巢癌早期症状不明显，约有60％的患者在诊断时已经发生了远端转移，因此随着分期的靠后，患者五年生存率明显下降，发生远端转移后的患者五年生存率仅为25％左右。

目前，卵巢癌的一线疗法是肿瘤细胞减灭术和化疗，肿瘤细胞减灭术是通过手术最大程度的去除可见的残余肿瘤，使残余肿瘤小于1cm或全部去除才会有较好预后，而化疗则主要是基于铂类和紫杉醇类药物进行，通常伴随有较多的毒副作用，例如恶心，骨髓抑制，脱发，周围神经病变，疲劳等。目前，一些新的方法加入到了一线治疗中，如：提高紫杉醇的给药密度并结合抗血管生成药物贝伐单抗联合治疗，间隔肿瘤细胞减灭术等。这些方法治疗强度更高，在一定程度上可以提高患者的生存率，但是也增加了患者毒副作用以及患者的经济负担。另外，由于大多数卵巢癌患者发生腹腔转移，因此提出了腹腔内化疗以及腹腔温热灌注化疗等治疗手段，但这些治疗方法并不能解决化疗药物治疗过程中表现出的高度毒性和并发症等问题，目前存在一些争议，需要在临床试验中进行确认。尽管患者对一线化疗有一定的反应率，但复发的问题依然很严重。据统计，在一线卵巢癌的治疗中，约有50％的患者会复发，其中25％的患者出现铂耐药，生存期不超过一年。复发性卵巢癌的主要治疗方法依然是根据患者肿瘤对铂类化疗药物的敏感性选择不同的二线化疗药物或考虑再次切除治疗。这些方法只能缓解病情，且化疗药物缺乏靶向性，无法解决再次复发，耐药以及副作用等问题(Cancer ChemotherPharmacol.2018Jan；81(1):17-38)。

现有的各类生物靶向药物对卵巢癌有一定的疗效。如：血管生成抑制剂，聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制剂等。其中，血管生成抑制剂贝伐单抗以及几种PARP抑制剂已经获得FDA批准用于卵巢癌的治疗，贝伐单抗和奥拉帕尼是在中国已上市的药物。但有研究表明，不是所有患者都会对PARP抑制剂产生反应，在治疗过程中依然存在耐药使得有效用药浓度增加等问题(WomensHealth(Lond).2016Jun；12(3):363-78)。此外，临床II期和III期的研究表明，奥卡帕尼并不能延长铂敏感的复发型卵巢癌患者的总生存期(OS)(Lancet Oncol,2014.15(8)：p.852-61)。因此，迫切需要新的靶向治疗方法来改善卵巢癌的临床疗效。

BCL6是近年来新发现的分子靶点，该基因位于人类3号染色体长臂27区域，编码的蛋白BCL6是一个转录抑制因子。研究表明，BCL6基因的易位和点突变会导致BCL6蛋白的持续性高表达，进而抑制其下游凋亡分化相关基因的表达，促使生发中心来源淋巴瘤的发生(NatRevImmunol.2015Mar；15(3):172-84)。此外，BCL6还参与了多种肿瘤的发生与发展，比如：卵巢癌，淋巴瘤，乳腺癌，胶质瘤，非小细胞肺癌等(Clin Cancer Res.2017Feb15；23(4):885-893)。目前已有多篇文章报道，研发BCL6抑制剂可以作为上述多种BCL6高表达癌症在内的有效治疗策略。在卵巢癌中，BCL6的高表达与卵巢癌细胞的增殖，转移，侵袭以及耐药密切相关，临床数据研究表明BCL6高表达的卵巢癌患者五年生存率明显下降(AmJCancerRes 2015；5(1):255-266)。

目前已研发出的BCL6抑制剂主要包括多肽类，小分子以及天然化合物。其中小分子抑制剂有79-6(Cancer Cell2010，17，400-11)，FX1(JClin Invest 2016，126，3351-62)，Takeda1(JMed Chem 2017，60，4358-4368)，BI3802(CellRep 2017，20，2860-2875)等。虽然这些小分子抑制剂具备一定的生物活性以及靶向性，但依然存在生物利用度差，抗肿瘤活性差，合成路线复杂等问题。例如79-6和FX1在分子及细胞水平发挥功能的浓度大于50甚至200微摩，BI3802因为在动物水平生物活性差，很难被吸收，限制了该化合物在动物水平上的进一步应用。而已经报道的BCL6的抑制剂主要是用于治疗淋巴瘤，很少在卵巢癌的治疗中运用。

结合临床治疗卵巢癌过程中出现的晚期转移、化疗毒副作用以及缺乏靶向药、耐药等重大问题，筛选出新型高效的靶向BCL6的小分子抑制剂用于治疗卵巢癌迫在眉睫，特别是开发出新的具有我国自主知识产权的BCL6靶向药物，将为后续靶向BCL6治疗卵巢癌的新药研发奠定基础，为卵巢癌耐药、转移患者的治疗带来新的靶标，具有重要的理论意义和广阔的应用前景。

发明内容

本发明提出式(I)所示的WK369小分子化合物或其水合物或药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗卵巢癌疾病的药物中的应用；本发明应用中，式(I)所示的WK369在体外和/或体内具有如下作用：第一：通过阻断BCL6与转录共抑制子SMRT的相互作用进而抑制BCL6的转录抑制功能，显著上调BCL6下游基因的表达。第二：对BCL6高表达卵巢癌细胞株具有显著的抑制增殖效果，而对BCL6低表达的卵巢癌细胞株和正常细胞杀伤较小。第三：显著抑制BCL6高表达的卵巢癌细胞的克隆形成，并抑制BCL6高表达卵巢癌细胞的迁移和侵袭，促进其发生周期阻滞和凋亡。第四：在小鼠生发中心形成动物模型中，显著抑制小鼠体内生发中心的形成。第五：在小鼠卵巢癌皮下荷瘤模型中，显著抑制肿瘤的生长。第六：在卵巢癌腹腔转移动物模型中，显著抑制肿瘤的腹腔内转移，并且给药过程中未显示明显的毒性。

其中，式(I)所示的WK369是一种小分子化合物，其分子式为C₁₉H₂₀FN₅O₂，分子量为369.4004。

本发明提出了式(I)所示的WK369小分子化合物或其水合物或药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗BCL6异常表达的恶性肿瘤药物中的应用。

本发明应用中，式(I)所示的WK369用于制备BCL6抑制剂。

其中，式(I)所示的WK369能在纳摩尔水平阻断BCL6与其转录共抑制子SMRT的结合。

其中，式(I)所示的WK369抑制BCL6的转录抑制功能，显著上调BCL6下游基因的表达；其中，所述下游基因包括ATR、P53、CDKN1A等。

本发明应用中，式(I)所示的WK369用于抑制与BCL6异常表达相关的恶性肿瘤的增殖、生长、迁移、浸润、复发、耐药以及促进肿瘤周期阻滞和凋亡。

其中，所述恶性肿瘤包括卵巢癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、Ph+急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、小儿急性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤骨髓瘤、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤等。

本发明应用中，所述式(I)所示的WK369化合物用于在体外和/或体内选择性抑制BCL6异常表达卵巢癌细胞增殖和肿瘤生长。

其中，式(I)所示的WK369可以在体外和/或体内选择性抑制多种BCL6高表达卵巢癌细胞株的增殖和克隆形成，包括抑制BCL6高表达卵巢癌细胞株SKOV3、ES-2、OVCAR8、CAOV3、MCAS、H08910PM的增殖和克隆形成，并且相对于BCL6低表达卵巢癌细胞株IGROV-1和正常细胞株L02、NCM460、PNT1A、293T、HAF，本发明化合物在BCL6高表达卵巢癌细胞株中的增殖抑制效果更显著。其中，所述SKOV3细胞株和ES-2细胞株为顺铂治疗耐药的BCL6高表达卵巢癌细胞株。

本发明应用中，式(I)所示的WK369化合物在体外和/或体内抑制BCL6高表达卵巢癌细胞的迁移、侵袭和转移。所述BCL6高表达卵巢癌细胞株包括SKOV3、ES-2。

其中，式(I)所示的WK369化合物在体外抑制BCL6高表达卵巢癌耐药细胞SKOV3和ES-2的迁移、侵袭。

本发明应用中，式(I)所示的WK369化合物显著促进BCL6高表达卵巢癌细胞发生周期阻滞、凋亡。

其中，式(I)所示的WK369化合物显著促进BCL6高表达卵巢癌耐药细胞SKOV3和ES-2于G2/M期发生细胞周期阻滞。

其中，式(I)所示的WK369化合物显著促进BCL6高表达卵巢癌耐药细胞SKOV3和ES-2发生早期和晚期细胞凋亡。

本发明应用中，式(I)所示的WK369化合物可以在小鼠体内抑制生发中心的形成。

其中，式(I)所示的WK369化合物在体内显著抑制小鼠生发中心形成以及减少生发中心B细胞的比例。

本发明应用中，式(I)所示的WK369化合物可以在体内抑制BCL6高表达卵巢癌SKOV3肿瘤的生长。

本发明应用中，式(I)所示的WK369化合物可以在体内抑制BCL6高表达卵巢癌ES-2肿瘤腹腔内转移。

本发明应用中，式(I)所示的WK369化合物的水合物或药学上可接受的盐或药学上可接受的载体等同样具有与式(I)WK369相同的抑制效果。

本发明应用中，式(I)所示的WK369化合物可单独使用或者与其他药物联合使用。

本发明还提出了一种药物组合物，其包括式(I)所示的WK369化合物或其水合物或药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

其中，所述的组合物在制备治疗与BCL6过表达相关的恶性肿瘤疾病的增殖、生长、迁移、浸润、复发、耐药、促进肿瘤周期阻滞和凋亡药物中的应用。

其中，所述恶性肿瘤包括卵巢癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、Ph+急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、套细胞淋巴瘤骨髓瘤、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤等。

本发明还提出了式(I)所示的WK369化合物阻断BCL6与其转录共抑制子SMRT的结合的方法。如式(I)所示的WK369化合物可以通过HTRF(均相时间分辨荧光)的方法浓度依赖的阻断BCL6与其转录共抑制子SMRT的结合。

本发明还提出了式(I)所示的WK369化合物抑制BCL6转录抑制功能的方法。如式(I)所示的WK369化合物可以通过荧光素酶报告基因的方法浓度依赖的抑制BCL6转录抑制功能。

本发明还提出了式(I)所示的WK369化合物在体外和/或体内上调BCL6下游基因表达的方法。如式(I)所示的WK369化合物可以通过qPCR(实时荧光定量核酸扩增检测系统)浓度依赖的上调BCL6下游基因的表达。

本发明还提出了式(I)所示的WK369在体外和/或体内抑制卵巢癌细胞的增殖的应用及方法。所述卵巢癌细胞株包括BCL6高表达卵巢癌细胞株SKOV3、ES-2、OVCAR8、CAOV3、MCAS、H08910PM和BCL6低表达卵巢癌细胞株IGROV-1，其中，相对于BCL6低表达卵巢癌细胞株IGROV-1，所述式(I)所示的WK369对BCL6高表达卵巢癌细胞株的增殖抑制效果更为明显。特别地，本发明所述式(I)所示的WK369可以抑制顺铂耐药治疗无效的BCL6高表达卵巢癌细胞株SKOV3细胞株和ES-2细胞株增殖。

本发明还提出了式(I)所示的WK369化合物在体外抑制多株BCL6高表达卵巢癌细胞克隆形成的方法。如式(I)所示的WK369化合物可以浓度依赖性抑制BCL6高表达卵巢癌细胞株SKOV3、ES-2、OVCAR8、CAOV3、MCAS、H08910PM的克隆形成，并且对BCL6低表达卵巢癌细胞株IGROV-1的克隆形成抑制能力减弱，在细胞水平表现出对BCL6高表达卵巢癌细胞的选择性抑制。

本发明还提出了式(I)所示的WK369化合物在体外抑制BCL6高表达卵巢癌细胞迁移和侵袭的方法。如式(I)所示的WK369化合物可以浓度依赖性抑制BCL6高表达卵巢癌细胞株SKOV3和ES-2的迁移和侵袭。所用到的迁移、侵袭检测方法为划痕横向迁移检测法和迁移小室纵向侵袭检测法。

本发明还提出了式(I)所示的WK369化合物在体外促进BCL6高表达卵巢癌细胞发生周期阻滞的方法。如式(I)所示的WK369化合物可以浓度依赖性促进BCL6高表达卵巢癌细胞株SKOV3和ES-2于G2/M发生细胞周期阻滞，并使周期相关调控蛋白发生明显变化。

本发明还提出了式(I)所示的WK369化合物在体外促进BCL6高表达卵巢癌细胞发生细胞凋亡的方法。如式(I)所示的WK369化合物可以浓度依赖性促进BCL6高表达卵巢癌细胞株SKOV3和ES-2发生早期和晚期细胞凋亡，并使细胞凋亡相关调控蛋白发生明显变化。

本发明提出式(I)所示的WK369化合物在体内抑制小鼠生发中心形成的方法。如式(I)所示的WK369化合物可以在体内减少小鼠生发中心B细胞的比例。

本发明还提出了式(I)所示的WK369化合物在体内抑制BCL6高表达卵巢癌耐药细胞株生长的方法。如式(I)所示的WK369化合物能在小鼠皮下荷瘤动物模型中抑制SKOV3肿瘤的生长，且无明显毒副作用。

本发明还提出了式(I)所示的WK369化合物在体内抑制卵巢癌细胞转移的方法。如式(I)所示的WK369化合物可以在小鼠卵巢癌腹腔转移动物模型中显著抑制ES-2肿瘤的腹腔内转移以及远端器官转移。

本发明通过HTRF(均相时间分辨荧光)结合荧光素酶报告基因的方法筛选得到小分子化合物如式(I)所示的WK369，该化合物能够在体外和体内强烈上调BCL6下游(细胞周期、DNA损伤相关等)基因的表达，进而促使BCL6高表达卵巢癌细胞发生周期阻滞和凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。在小鼠生发中心形成的动物模型中，进一步证明了本发明化合物可以在体内结合BCL6并发挥相应的生物功能，显著抑制小鼠生发中心的形成；在卵巢癌的皮下荷瘤动物模型中，显著抑制肿瘤的生长；在卵巢癌腹膜转移动物模型中，显著抑制ES-2细胞的腹腔内转移，并且在上述给药过程中未显示明显的毒性。上述体外/体内实验中所用到的SKOV3、ES-2细胞株为BCL6高表达细胞株同时也是典型的临床顺铂耐药细胞株，卵巢癌的转移、耐药是导致患者晚期死亡的重要原因，介于BCL6与癌细胞的耐药也有着紧密的联系，本发明在卵巢癌转移以及耐药治疗方面取得的新突破，为卵巢癌的靶向治疗提供了一种潜在的新型药物。

附图说明

图1所示为式(I)WK369化合物和阳性化合物FX1在分子水平竞争性结合到BCL6的N端的BTB/POZ结构域，从而抑制BCL6片段蛋白与多肽SMRT之间的相互作用。图1(A)和图1(B)分别表示阳性化合物FX1和本发明化合物WK369抑制BCL6片段蛋白与多肽SMRT之间的相互作用以及半数抑制浓度值。其中，图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

图2所示为式(I)WK369化合物和阳性化合物FX1在分子水平竞争性结合到BCL6的N端的BTB/POZ结构域，抑制BCL6发挥转录抑制功能的效果图。其中，横坐标表示式(I)WK369和阳性化合物FX1的加药浓度，纵坐标表示抑制的百分率。其中，图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

图3所示为式(I)WK369化合物上调BCL6下游基因。其中，图3(A)、(B)、(C)为WK369在BCL6高表达卵巢癌耐药细胞株ES-2中上调BCL6下游基因ATR、P53、CDKN1A的表达；图3(D)、(E)、(F)为WK369在BCL6高表达卵巢癌细胞株H08910PM中上调BCL6下游基因ATR、P53、CDKN1A的表达；图3(G)、(H)、(I)为WK369在BCL6高表达耐药卵巢癌细胞株SKOV3中上调BCL6下游基因ATR、P53、CDKN1A的表达。其中，图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

图4所示为式(I)WK369化合物在卵巢癌细胞株与正常细胞株、BCL6高表达细胞株与BCL6低表达细胞株的增殖抑制活性中具有选择性。其中，图4(A)为BCL6在卵巢癌细胞系OVCAR8、ES-2、SKOV3、H08910PM、IGROV-1、CAOV3、MCAS中的表达量；图4(B)为WK369对人类卵巢癌细胞系OVCAR8、ES-2、SKOV3、H08910PM、IGROV-1、CAOV3、MCAS和人类正常细胞系HAF、L02、NCM460、293T、PNT1A中的半数增殖抑制活性；图4(C)表示式(I)WK369在上述人类卵巢癌细胞系和人类正常细胞系中的半数增殖抑制活性上具有显著性差异；图4(D)表示式(I)WK369在上述BCL6高表达卵巢癌细胞株OVCAR8、ES-2、SKOV3、H08910PM、CAOV3、MCAS和BCL6低表达的卵巢癌细胞株IGROV-1的半数增殖抑制活性上具有显著性差异。其中，图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

图5所示为式(I)WK369化合物选择性抑制多株BCL6高表达卵巢癌细胞株的克隆形成。图5(A)表示与空白对照和阳性化合物FX1相比较，WK369在不同加药浓度下对卵巢癌细胞株ES-2、SKOV3、H08910PM、MCAS、CAOV3、OVCAR8、IGROV-1克隆形成抑制效果的白光照片。图5(B)、5(C)、5(D)、5(E)、5(F)、5(G)、5(H)分别表示与空白对照和阳性化合物FX1相比较，式(I)WK369在不同加药浓度下对卵巢癌细胞株ES-2、SKOV3、H08910PM、MCAS、CAOV3、OVCAR8、IGROV-1克隆形成抑制效果的统计结果。其中，图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

图6所示为式(I)WK369化合物在体外抑制BCL6高表达卵巢癌细胞横向迁移和纵向侵袭。图6(A)和图6(B)分别为与空白对照和阳性化合物FX1相比较，WK369在不同加药浓度下抑制BCL6高表达卵巢癌细胞株SKOV3、ES-2迁移的效果图；图6(C)和图6(D)分别图6(A)和图6(B)的统计结果图；图6(E)和图6(F)分别为与空白对照和阳性化合物FX1相比较，WK369在不同加药浓度下抑制BCL6高表达卵巢癌细胞株SKOV3、ES-2侵袭的效果图；图6(G)和图6(H)分别为图6(E)和图6(F)的统计结果图。其中，图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

图7所示为式(I)WK369化合物诱导BCL6高表达卵巢癌细胞发生周期阻滞。图7(A)和图7(B)为与空白对照和阳性化合物FX1相比较，WK369在不同加药浓度下诱导BCL6高表达卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3发生细胞周期阻滞的流式细胞仪结果图；图7(C)和图7(D)分别为图7(A)和图7(B)的结果统计图，其中WK369能浓度依赖性地诱导BCL6高表达卵巢癌耐药细胞株ES-2和SKOV3于G2M期发生周期阻滞；图7(E)和图7(F)分别为与空白对照和阳性化合物FX1相比较，WK369浓度依赖性地诱导BCL6高表达卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3周期相关调控蛋白CyclinB1、cdc25C、CyclinD1表达发生改变的电泳结果图，其中，GAPDH为内参。其中，图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

图8所示为式(I)WK369化合物诱导BCL6高表达卵巢癌细胞发生细胞凋亡。图8(A)和图8(B)分别为与空白对照和阳性化合物FX1相比较，WK369在不同加药浓度下诱导BCL6高表达卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3发生细胞凋亡的流式细胞仪结果图；图8(C)和图8(D)分别为图8(A)和图8(B)的结果统计图；图8(E)和图8(F)分别为与空白对照和阳性化合物FX1相比较，WK369浓度依赖性地诱导BCL6高表达卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3凋亡相关调控蛋白PARP表达发生改变的电泳结果图，其中，GAPDH为内参。其中，图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

图9所示为式(I)WK369化合物抑制小鼠生发中心形成的效果图。图9(A)和图9(B)分别是在50mg/kg/d的给药剂量下，小鼠生发中心B细胞百分比的流式结果图和柱状统计图。其中，图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

图10所示为式(I)WK369化合物体内抑制BCL6高表达卵巢癌耐药肿瘤生长的效果图。其中，图10(A，B，C)表示本发明化合物WK369和阳性化合物FX1在卵巢癌皮下荷瘤模型中抑制肿瘤生长的效果，且本发明化合物效果比阳性化合物FX1更显著；图10(D，E，F)为本发明化合物在小鼠体内肿瘤细胞中上调BCL6下游的基因ATR、P53、CDKN1A表达水平的显著效果图；图10(G)为本发明化合物显著降低肿瘤增殖标志物Ki67表达的免疫组化结果图，图10(H)为图10(G)的结果统计图。图10(I)为所示为式(I)WK369处理组与空白对照组和阳性对照组小鼠体重的统计图；图10(J)为小鼠主要脏器(包括心、肝、脾、肺、肾)的HE染色图。其中，图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

图11所示为式(I)WK369化合物在小鼠卵巢癌腹腔转移动物模型中显著抑制卵巢癌细胞的腹腔内转移及远端脏器转移。图11(A)和图11(B)分别为所示为式(I)WK369在小鼠卵巢癌腹腔转移动物模型中显著抑制卵巢癌细胞的腹腔内转移及远端脏器转移效果图；11(C)表示与对照组相比，式(I)WK369在小鼠卵巢癌腹腔转移动物模型中显著抑制卵巢癌细胞腹腔内转移的统计图；图11(D)表示与对照组相比，式(I)WK369在小鼠卵巢癌腹腔转移动物模型中显著减少卵巢癌细胞在腹腔内各脏器中形成肿瘤结节的数量统计图。图11(E)表示(I)WK369能有效提高腹腔转移卵巢癌小鼠的生存率。其中，图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：均相时间分辨荧光技术(HTRF)检测本发明化合物WK369抑制BCL6片段蛋白与其共抑制因子SMRT的相互作用

均相时间分辨荧光(HTRF)技术结合了荧光共振能量转移(FRET，FluorescenceResonanceEnergy Transfer)和时间分辨荧光(TRF″Time Resolved Fluorescence))两种技术。该技术是利用了具有穴状结构的Eu元素的螯和标记物和XL665作为一个供体(Donor)，是基于Eu穴状化合物的供体与受体(第二荧光标记物)之间的荧光共振能量转移(FRET)。在荧光共振能量转移中，受体发射荧光的寿命等同与供体的发射荧光的寿命。因为Eu的荧光衰减周期较长，所以含Eu的供体会诱导XL665受体长时间地发射荧光，受体激发后产生的荧光便能持续较长时间，这样通过时间分辨就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光，这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号。当由于生物分子相互作用导致两个荧光基团接近时，在激发时被穴状化合物捕获的部分能量释放，发射波长为620nm；另一部分能量转移到受体(acceptor)上，发射波长为665nm。665nm的发射光仅仅由供体(donor)引起的FRET产生。所以，当生物分子相互作用时，有两个激发光620nm和665nm；当不存在相互作用时，只有620nm一个激发光。

技术方法：

本研究建立了基于均相时间分辨荧光技术(HTRF)的BCL6-SMRT相互作用抑制活性测试方法，该方法具有稳定、经济、操作简便的特点，可以用于BCL6-SMRT相互作用抑制剂的活性评价。在这一体系中，本发明选定的能量供体是GST-Tb，受体是6His-XL665(Cisbio)。相应的，本发明表达纯化出的蛋白也分别带有GST和His标签，分别为BCL6-GST和6His-SMRT。BCL6的转录抑制活性结构域BTB domain是和转录共抑制因子SMRT(多肽SMRT)结合的结构域。本发明所需BCL6蛋白N端的BTB/POZ结构域序列为ADSCIQFTRHASDVLLNLNRLRSRDILTDVVIVVSREQFRAHKTVLMACSGLFYSIFTDQLKCNLSVINLDPEINPEGFCILLDFMYTSRLNLREGNIMAVMATAMYLQMEHVVDTCRKFIKASE-GST，多肽SMRT的序列为6HISGLVATVKEAGRSIHEIPREEL。当带有GST标签的BCL6蛋白N端和带有His标签的SMRT多肽进行相互作用时(空间距离小于10nM)，Anti-6His-XL665受体磁珠和Anti-GST-Tb供体磁珠也会相应靠近，从而发生共振能量转移(FRET)现象。供体磁珠荧光分子的激发将诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。当小分子抑制剂阻断BCL6和SMRT的相互作用时，FRET现象减弱。因此，FRET现象的强弱可以反映抑制剂分子对两个蛋白相互作用抑制作用的强弱。在本发明中选定的6His-SMRT浓度为200nM，BCL6-GST的浓度为6.25nM，实验为20μL的体系。首先于384孔板中每孔加入4μL的5×BCL6-GST和4μL的5×6His-SMRT室温孵育30min，各组设2个复孔。之后加入2μL的10×不同浓度化合物，最后加入GST-Tb和6His-XL665各5μL，室温孵育过夜，第二天于Cytation 5细胞成像微孔板检测仪上读值。实验结果用GraphPadPrism处理，实验独立重复3次。

实验结果如图1所示，本发明化合物能显著抑制BCL6片段蛋白与多肽SMRT的相互作用，其半数抑制浓度(IC₅₀)为0.315μM，而目前已经报道的阳性化合物FX1的半数抑制浓度为37.68μM，与阳性化合物FX1相比，本发明化合物WK369抑制BCL6片段蛋白与多肽SMRT相互作用的水平提升了大约120倍。

实施例2：荧光素酶报告基因检测本发明化合物WK369抑制BCL6的转录抑制活性

荧光素酶报告基因系统是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。荧光素酶(luciferase)可以催化底物生成氧化底物，在底物氧化的过程中，会发出生物发光，生物发光强度可反映出荧光素酶活性。

技术方法：

本发明采用萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)作为报告基因来反映转录因子的活性，海肾荧光素酶(renilla)作为内参基因来排除细胞状态和转染效率的影响。采用“GAL4-DBD+目的蛋白”与“GAL4-Luc”的经典方法来检测BCL6的转录活性。首先构建GAL4-TK-LUC来作为荧光素酶报告基因，此载体上有Firefly的基因序列，序列前插入有胸苷激酶(thymidine kinase，TK)的启动子，以此来启动Firefly基因的表达。TK启动子前克隆有5xGAL4的结合位点，以此来与转录抑制因子BCL6前的结合结构域结合。将BCL6的BTB/POZ结构域与GAL4转录因子的DNA结合结构域(DBD)融合作为抑制因子，该融合蛋白通过GAL4-DBD能与荧光素酶报告基因上游的GAL4binding site结合，抑制荧光的表达。载体构建好之后，将报告基因GAL4-TK-LUC和抑制因子GAL4-DBD-BCL6以及内参基因renilla共转染进细胞，本发明采用的工具细胞是293T。细胞转染24小时后，加入不同浓度的本发明化合物WK369和阳性化合物FX1对细胞进行处理。因为BCL6是作为转录抑制因子，因此本发明期望的药物是刺激作用。药物处理细胞24小时后，用裂解液收集细胞(胞内含有荧光素酶)，并于-80℃冰箱放置4小时以上。首先加入Firefly的底物，检测Firefly的荧光强度，随后再加入Renilla底物，检测内参海肾的荧光强度。其中，归一反应＝萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶，抑制率＝加药组/空白组(不加药)。

实验结果如图2所示，本发明化合物WK369能浓度依赖性抑制BCL6的转录抑制活性，效果显著优于阳性化合物，在本发明化合物加药浓度为20μM时，BCL6的转录抑制活性被完全消除。

实施例3：本发明化合物WK369上调BCL6下游基因的表达

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，简称qRT-PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，通过溶解曲线，可以确定PCR反应是否特异。本发明采用qRT-PCR来检查本发明化合物WK369对BCL6下游基因表达的调节情况。由于BCL6是一种转录抑制因子，可通过抑制其下游重要靶基因的表达而介导肿瘤的发生，这些靶基因主要包括P53、ATR、CDKN1A等。因此当BCL6的功能受到抑制时，其下游基因表达会上调。

技术方法：

1.RNA的提取：

(1)在6cm皿中接入ES-2，H08910PM，SKOV3细胞，待细胞生长至60％左右并贴壁至状态稳定后，加入不同浓度的本发明化合物WK369(1μM，5μM，10μM，20μM)和阳性化合物(20μM)，细胞经药物处理24h后消化离心收集细胞，使用预冷PBS洗2遍；

(2)加入1mLTrizol试剂，用枪吹打裂解细胞，此时样品可放置于-80℃保存数星期；

(3)将裂解后的细胞12000rpm离心5分钟，取上清至新的1.5mL无RNAse的EP管，加入200μL三氯甲烷(氯仿)，轻颠数次，静置5分钟后12000rpm 4℃离心15min；

(4)将上清吸入干净无RNAse的EP管中，注意不要吸到中间液相层，加入500μL的异丙醇，轻颠数次，放置10分钟沉淀RNA；

(5)将样品12000rpm 4℃离心10min，尽量吸除上清，加入1mL 75％乙醇(使用DEPC水配制)洗涤沉淀两次，室温晾干，之后加适量DEPC水溶解RNA沉淀；

(6)紫外可见分光光度计测定RNA浓度和纯度。

2.qRT-PCR：

(1)反转录：mRNA逆转为cDNA。反应体系为20μL，其中ddH₂O为15μL，5×Mix buffer为4μL，RNA为1000ng。反应条件为：37℃反应30min，85℃反应5s，16℃保存；

(2)qRT-PCR反应：根据Takara SYBR试剂盒进行。反应体系(25mL)如下：ddH₂O为10μL，2×SYBR Mix buffer为12.5μL，上下游引物(10μM)各1μL，模板cDNA为0.5μL。BCL6下游基因ATR的引物序列为AAGCGCCACTGAATGAAACT和GTCGCTGCTCAATGTCAAGA，P53的引物序列为CCCTTCCCAGAAAACCTACC和AATCAACCCACAGCTGCAC，CDKN1A的引物序列为CTGAAGGGTCCCCAGGTG和TAGGGCTTCCTCTTGGAGAA。内参基因actin的引物序列为GTACGCCAACACAGTGCTG和CGTCATACTCCTGCTTGCTG。反应条件为：预变性(95℃、5min)1个循环，PCR反应(95℃、30s，60℃、30s，72℃、30s)40个循环。

实验结果如图3所示，图3(A)、(B)、(C)为本发明化合物WK369和阳性化合物FX1在BCL6高表达卵巢癌耐药细胞株ES-2中上调BCL6下游基因ATR、P53、CDKN1A的表达；图3(D)、(E)、(F)为本发明化合物WK369和阳性化合物FX1在BCL6高表达卵巢癌细胞株H08910PM中上调BCL6下游基因ATR、P53、CDKN1A的表达；图3(G)、(H)、(I)为本发明化合物WK369和阳性化合物FX1在BCL6高表达卵巢癌耐药细胞株SKOV3中上调BCL6下游基因ATR、P53、CDKN1A的表达。实验结果表明，在三株BCL6高表达的卵巢癌细胞中，与阳性化合物FX1相比，本发明化合物WK369均能更为显著地上调BCL6下游基因ATR、P53、CDKN1A的表达，并且上调效果具有浓度依赖性。其中本发明化合物WK369对ATR、P53的表达上调几倍至十几倍，对CDKN1A的表达最高可上调几十倍。

实施例4：本发明化合物WK369选择性抑制多株BCL6高表达卵巢癌细胞的增殖

技术方法：

1.细胞的培养

本发明中所使用的卵巢癌细胞株ES-2、SKOV3、H08910PM、MCAS、CAOV3、OVCAR8、IGROV-1均来源于ATCC；人表皮成纤维细胞HAF、人正常肝细胞L02、人正常结肠上皮细胞NCM460、人肾上皮细胞293T和正常成人前列腺上皮细胞PNT1A均来源于ATCC。其中，SKOV3、H08910PM、MCAS、IGROV-1、L02、NCM460、PNT1A使用RPMI-1640培养基，ES-2、CAOV3、OVCAR8、HAF、293T使用高糖DMEM培养基，培养基含10％FBS和1％青霉素-链霉素双抗，细胞培养于37℃恒温培养箱(湿度95％，CO2浓度5％)中。

2.免疫印迹(western blot)实验

细胞经裂解提取蛋白，在100℃恒温水浴锅中将蛋白煮10min至完全变性。使用SDS-PAGE电泳分离蛋白质样品。将蛋白转移至NC膜上，将膜用5％的脱脂牛奶或BSA室温摇床上封闭2个小时。用相应的抗体(一抗)室温孵育两小时或4℃孵育过夜。用带有荧光标记的二抗孵育一小时，最后用扫膜仪Odyssey检测目的蛋白的表达。

2.SRB(磺酰罗丹明)法测定细胞增殖

不同的细胞株接种至96孔板(Corning)，24h后，加入不同浓度本发明化合物WK369，对照组加入等量的DMSO，各组设3个复孔，继续培养72h后，加预冷却的TCA(三氯乙酸，50％，w/V)4℃孵育60min以上固定细胞。固定后，流水冲5遍，风干。每孔加入50μlSRB染液(4％，w/V)，室温孵育10min染色。后将染液吸出，每孔加入醋酸洗5遍，除去未结合染料。风干后，每孔加入浓度为10mM Tris溶液100μl，震荡溶解结合的SRB染料。将96孔板置于酶标仪(SPECTRAMAX 190)中，在515nm波长下测定OD值。实验独立重复3次。细胞存活率(％)＝加药物OD值/对照组OD值×100％。

实验结果如图4所示，图4(A)为不同的卵巢癌细胞BCL6蛋白表达量的免疫印迹图，结果表明不同的卵巢癌细胞BCL6蛋白表达量有明显差异，ES-2、SKOV3、H08910PM、MCAS、CAOV3、OVCAR8六株卵巢癌细胞的BCL6蛋白表达量较高，为BCL6高表达卵巢癌细胞株，其中ES-2、SKOV3也是典型的顺铂耐药细胞株(ATCC)，IGROV-1的BCL6蛋白表达量较低，为BCL6低表达卵巢癌细胞株。图4(B)为本发明化合物WK369在上述人类卵巢癌细胞株和人类正常细胞株中的半数增殖抑制活性，结果表明，本发明化合物在BCL6高表达的卵巢癌细胞株中有很好的抗增殖活性，半数增殖抑制活性为1到8μM左右，在BCL6低表达卵巢癌细胞中的半数增殖抑制活性为16μM左右，在正常细胞株中的半数增殖抑制活性高达30至50μM。图4(C)的统计结果表明，本发明化合物WK369在上述人类卵巢癌细胞系和人类正常细胞系中的半数增殖抑制活性上具有显著性差异；图4(D)的统计结果表明，本发明化合物WK369在上述BCL6高表达卵巢癌细胞株和BCL6低表达的卵巢癌细胞株中的半数增殖抑制活性上具有显著性差异。说明本发明化合物WK369不仅能在分子水平与BCL6结合，抑制BCL6与其转录共抑制因子SMRT结合以及抑制BCL6的转录抑制活性，也能在细胞水平靶向BCL6抑制BCL6高表达的卵巢癌细胞株的增殖。

实施例5：本发明化合物WK369选择性抑制多株BCL6高表达卵巢癌细胞的克隆形成

细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、对杀伤因素敏感性等的重要技术方法。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆，每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。克隆形成率表示细胞的独立生存能力，各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测，细胞克隆形成率即细胞接种存活率，反映了细胞增殖能力和对杀伤因素的敏感性两个重要性状。

技术方法：

将2000个卵巢癌细胞接入到6孔板中，待细胞贴壁后加入图5中所示浓度的式(I)化合物WK369，一周后用多聚甲醛将细胞固定，然后用结晶紫染色，拍照并统计。

实验结果如图5所示，式(I)化合物WK369对各株BCL6高表达卵巢癌细胞的克隆形成都有很显著的抑制效果，通过对各株卵巢癌细胞克隆形成率的统计结果表明，相比于BCL6低表达卵巢癌细胞株，式(I)化合物WK369对BCL6高表达卵巢癌细胞株的抑制效果更为明显，并且本发明化合物WK369对各株BCL6高表达卵巢癌细胞的克隆形成抑制能力显著优于阳性化合物FX1。

实施例6：本发明化合物WK369抑制BCL6高表达卵巢癌细胞的迁移和侵袭

细胞在体外培养时会沿培养平面向细胞较少处运动。因此，可以在已经长满细胞的培养皿中人为“划”出一条“伤痕”，则“伤痕”左右两侧的细胞会向“伤痕”区域运动，最终重新迁移至该区域，即所谓的“伤痕愈合”。根据运动至“伤痕”区域的细胞数量及“伤痕愈合”程度，即可判断细胞的横向迁移能力。

Transwell迁移实验采用Transwell小室检测细胞侵袭浸润情况。Transwell1小室底部所铺的透水聚碳酸酯薄膜上有大量直径8μm的微孔。实验时，将Transwell小室放入24孔板中，聚碳酸酯薄膜将整个孔分为上、下两室，Transwel1小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛有上层无血清培养液，下室内盛有下层有血清培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，Transwell小室上室预先铺有一层胶原基质Matrigel，将细胞接种在上室内后，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的血清可以诱导上室内的细胞向下迁移，使得从薄膜的上室面移动到下室面。但肿瘤细胞若要运动至下室必须先溶解胶原基质，再通过溶解出的空洞运动，这一过程，与肿瘤细胞在体内的侵袭浸润过程相似，可以用来反映肿瘤细胞的侵袭浸润能力。

技术方法：

1.划痕法横向迁移检测法

将一定数量的肿瘤细胞接种至6孔板，细胞在37℃，5％C0₂的培养箱中培养24h，至细胞长至80％左右后，在长满细胞的孔中，用10μL的灭菌枪头沿培养孔直痕，划痕后用PBS洗两次，将划去的细胞洗净，然后分别向细胞培养孔中加入2mL含不同浓度(0μM、1μM、5μM、10μM)本发明化合物WK369的培养基或含相应浓度阳性化合物(10μM)的培养基，将培养板放入培养箱，继续常规培养12h左右，直至空白对照组划痕区长满细胞。显微镜下观察细胞向划线部分运动的情况，拍照统计分析不同剂量药物组迁移进入划线区域的细胞数量以确定药物对细胞迁移能力的影响

实验结果如图6所示，可见本发明化合物WK369浓度依赖性地抑制BCL6高表达卵巢癌细胞SKOV3和ES-2的迁移。其中，图6(A)和图6(B)分别为本发明化合物WK369对BCL6高表达卵巢癌耐药细胞SKOV3和ES-2迁移抑制的效果图，图6(C)和图6(D)为图6(A)和图6(B)的统计结果图。与对照组相比，本发明化合物WK369能够更为显著地抑制BCL6高表达卵巢癌细胞SKOV3和ES-2的迁移，并且具有浓度依赖性。

2.Transwell小室迁移实验

使用Transwell小室迁移实验检测本发明化合物WK369对BCL6高表达卵巢癌细胞SKOV3和ES-2侵袭能力的影响，本发明化合物WK369处理浓度分别为0μM、1μM、5μM、10μM，阳性化合物FX1处理浓度为10μM，首先过夜饥饿处理细胞，然后细胞重悬在无血清并溶有不同浓度WK369的基础培养基中，细胞以5×10⁴个/孔密度(各200μl)接种至Transwell小室的上室中。下室中则加入600μl含有对应浓度WK369的完全培养基。置于细胞培养箱中培养12h-24h。取出Transwell小室用棉签轻轻除去小室上表面未迁移的细胞，并用4％的多聚甲醛固定小室下表面细胞15分钟，接着用2‰结晶紫染液处理细胞4分钟，清洗小室，除去未结合于细胞的结晶紫，用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉，以便后续镜检。将自然干燥后的小室置于显微镜下拍照，统计多个视野的细胞数目。细胞迁移率(％)＝加药物细胞迁移数/对照组细胞迁移数×100％。

实验结果如图6(E)和图6(F)所示，本发明化合物WK369显著抑制BCL6高表达卵巢癌细胞SKOV3和ES-2的侵袭，并呈现浓度依赖性，根据图6(G)和图6(H)的统计结果显示，在药物浓度为1μM时，发生侵袭的细胞数目已显著减少；在5μM时，细胞的侵袭率已降至20％-30％左右；在10μM时，只有极少数的细胞发生侵袭。而阳性化合物FX1在高浓度条件下，抑制BCL6高表达卵巢癌细胞SKOV3和ES-2侵袭的效果也并不理想。因此，与阳性化合物相比，本发明化合物WK369能更显著地抑制BCL6高表达卵巢癌细胞SKOV3和ES-2的侵袭。

实施例7：本发明化合物WK369促进BCL6高表达卵巢癌细胞发生周期阻滞

利用细胞内DNA能够与荧光染料结合如PI的结合特性，不同细胞时期由于DNA含量不同从而结合的荧光染料的量也不同，利用流式细胞仪检测出的荧光强度也不同，从而反应细胞周期情况。

技术方法：

取对数期的BCL6高表达卵巢癌细胞SKOV3和ES-2接种于10cm皿，24h后即细胞贴壁后加入不用浓度的本发明化合物WK369，待药物处理24h后，离心收集细胞，用PBS清洗细胞两遍，吸净离心管残余的PBS后，每管加入100μL 75％的乙醇固定细胞，用移液枪吹打细胞使其充分重悬，4℃过夜。第2天，离心收集细胞，轻轻倒掉酒精，用1mLPBS重悬细胞离心清洗2遍，避光条件下加入1μL RNA酶(10mg/mL)和5μLPI(5mg/mL)混匀后室温避光孵育30min，再转移到5mL的流式管后即用流式细胞仪检测细胞周期。统计各个时期的细胞含量。

实验结果如图7所示，其中，图7(A)和图7(B)为与空白对照和阳性化合物FX1相比较，本发明化合物WK369在不同加药浓度下诱导BCL6高表达卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3发生细胞周期阻滞的流式细胞仪结果图；图7(C)和图7(D)分别为图7(A)和图7(B)的结果统计图，图7(E)和图7(F)分别为与空白对照和阳性化合物FX1相比较，本发明化合物WK369浓度依赖性地诱导BCL6高表达卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3周期相关调控蛋白CyclinB1、cdc25C、CyclinD1表达发生改变的电泳结果图，其中，GAPDH为内参。实验结果表明，本发明化合物WK369能浓度依赖性地诱导BCL6高表达卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3于G2M期发生周期阻滞，并且能够使相应的细胞周期调控蛋白CyclinB1、cdc25C、CyclinD1显著下调，效果显著优于阳性化合物。

实施例8：本发明化合物WK369促进BCL6高表达卵巢癌细胞发生细胞凋亡

流式细胞仪检测细胞凋亡—AnnexinV/PI双染色法：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35.8KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。利用AnnexinV-FITC作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidine Iodide，PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来，通过流式细胞仪可以检测凋亡细胞的比例。

技术方法：

取对数期的BCL6高表达卵巢癌细胞SKOV3和ES-2接种于6cm皿，24h后即细胞贴壁后加入不用浓度的本发明化合物WK369，待药物处理48h后消化离心收集细胞，用PBS清洗细胞两遍，吸净离心管残余的PBS，加入500μL的Binding buffer悬浮细胞，再加入5μLAnnexinV-FTIC和5μL PI混匀。另外，准备三管含有各组细胞的混合液，一管不染，一管只染Annexin V-FTIC，一管只染PI以作为单染。室温避光反应5～15分钟，在1小时内进行流式细胞仪的上机检测。

实验结果如图8为所示，图8(A)和图8(B)为与空白对照和阳性化合物FX1相比较，本发明化合物WK369在不同加药浓度下诱导BCL6高表达卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3发生细胞凋亡的流式细胞仪结果图；图8(C)和图8(D)为图8(A)和图8(B)的结果统计图；图8(E)和图8(F)分别为与空白对照和阳性化合物FX1相比较，本发明化合物WK369浓度依赖性地诱导BCL6高表达卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3凋亡相关调控蛋白PARP表达发生改变的电泳结果图，其中，GAPDH为内参。实验结果表明，与阳性化合物相比，式(I)所示的本发明化合物WK369能更显著地诱导BCL6高表达卵巢癌细胞ES-2和SKOV3发生细胞凋亡，使相应的细胞凋亡蛋白PARP全长蛋白显著下调，PARP截短体蛋白上调，并且具有浓度依赖性。

实施例9：本发明化合物WK369体内抑制小鼠生发中心的形成

生发中心反应是一种T细胞依赖性抗原免疫应答的过程，在这个过程中活化的B细胞经历克隆增殖、功能成熟到分化产生高亲和力抗体的浆细胞以及分化成记忆B细胞。有研究发现，BCL6在体液免疫生发中心的淋巴母细胞和中心细胞中高表达并发挥主要的调控作用，在这个过程中，BCL6基因的易位和点突变会导致BCL6蛋白的持续性高表达，进而抑制B淋巴细胞的凋亡分化，促使生发中心来源的淋巴瘤的发生。在大多数的抗体应答抗原蛋白的反应中，生发中心(GC)B细胞以细胞表面蛋白GL7、FAS高表达为特征。生发中心形成的最主要调控因子BCL6，是生发中心B细胞发育中所必须的转录抑制因子。在BCL6缺失的情况下，生发中心的形成被抑制。本实验采用小鼠体内生发中心形成模型，选取本发明化合物WK369来检测本发明化合物是否能通过抑制BCL6功能进而抑制生发中心形成，以进一步证明本发明化合物WK369可以在体内通过抑制BCL6的功能进而发挥相应生物功能。

技术方法：

1.动物免疫及给药：

(1)动物免疫：采用8-10周的C57/BL6，腹腔注射100μg 4-羟基-3-硝基苯基乙酰基(NP)偶联的鸡γ球蛋白(CGG)，免疫两天后开始给药，给药方式为腹腔注射；

(2)将免疫后的小鼠分为三组，分别为对照组，阳性给药组(FX1组)、实验组(本发明化合物WK369)。其中，阳性组和实验组的化合物溶于含1％DMSO的20％的环糊精，每天腹腔注射给药剂量为50mg/kg，对照组每天腹腔注射相同体积的溶剂(含1％DMSO的20％的环糊精)；

(3)给药12天，即免疫14天处死小鼠。

2.流式细胞仪检测本发明化合物抑制小鼠脾脏生发中心GCB细胞比例

(1)将小鼠脾脏置于70μm的cell strainer，用注射器内芯研磨。用MACS buffer(PBS+2％FBS)冲洗收集细胞悬液；

(2)1500rpm离心5min，去上清；

(3)加入红细胞裂解液ACKbuffer，每个脾脏2mL，处理2min；

(4)加入4倍体积的MACS buffer终止裂解，用70μm的cell strainer过滤去除杂质，1500rpm离心5min，去上清；

(5)MACS buffer重悬细胞，并进行细胞计数；

(6)将10⁶个细胞重悬到100μL的MACS buffer里，分别加入0.4μL的PerCP-Cy5.5-B220，BV421-FAS和APC-GL7抗体于4℃孵育40min。

(7)加入MACS buffer 1500rpm离心5min洗涤细胞，用500μL的MACS buffer重悬细胞并转移至流式管，上机检测。

实验结果如图9所示，图9(A)和图9(B)分别是在50mg/kg/d的给药剂量下，小鼠生发中心B细胞百分比的流式结果图和柱状统计图，结果表明在50mg/kg/d的给药剂量下，阳性化合物FX1和本发明化合物WK369均能抑制小鼠生发中心的形成，但与阳性化合物相比，实验组(本发明化合物)生发中心B细胞下降比例更为显著。表明本发明化合物WK369对小鼠生发中心的形成有显著的抑制作用，且效果优于阳性化合物。

实施例10：本发明化合物WK369体内抑制卵巢癌肿瘤的生长且无明显毒副作用

技术方法：

本实验选择人BCL6高表达卵巢癌耐药细胞株SKOV3进行实验，使用6-8周的具有免疫缺陷型的雄性裸鼠。操作流程如下：

1.大量扩增培养SKOV3细胞以保证足够的荷瘤实验用量，每只小鼠使用1000×10⁴细胞量，为保证荷瘤的成功率需保证细胞状态为最佳。

2.待细胞数量足够时，离心收集细胞，用PBS洗两遍以去除培养基中的血清以减少免疫排斥反应。将细胞与基质胶按1:1的比例混匀，转移至EP管内，放置于冰上以降低细胞的新陈代谢作用。

3.按1000×10⁴个卵巢癌细胞SKOV3/只/100μL皮下注射到6-8周免疫缺陷雌性裸鼠背部。

4.约一周后测量肿瘤的长和宽，按照公式：体积＝长×宽²×0.52计算肿瘤体积。待肿瘤长到100mm³左右时，将小鼠随机分为四组：空白对照组、阳性对照组(FX1-50mg/kg)、实验药物组(本发明化合物WK369-25mg/kg)和实验药物组(本发明化合物WK369-50mg/kg)，7只一组，每三天测量并记录小鼠体重以及肿瘤的长与宽的变化用于后续统计，给药频率为每天一次，每次腹腔注射100μL，待实验结束后剥离肿瘤，拍照，并进行qPCR实验、H&E染色、免疫组化实验。

实验结果如图10所示，经过连续约21天给药，本发明化合物有效抑制肿瘤的生长，且在本发明化合物WK36925mg/kg的给药剂量下效果已经显著优于阳性化合物FX1(50mg/kg)，在给药过程中，在50mg/kg的本发明化合物WK369组给药剂量下肿瘤增殖非常缓慢，效果显著优于本发明化合物WK36925mg/kg的给药剂量，说明本发明化合物WK369对肿瘤的抑制作用具有浓度依赖性(图10A，B，C)。在体内，与阳性化合物相比，本发明化合物WK369依然能够更好地上调BCL6下游基因的表达水平(图10D，10E，10F)。通过免疫组化结果显示，本发明化合物WK369能显著降低肿瘤增殖的标志物Ki67的表达(图10G，10H)。此外，在连续给药过程中，本发明化合物WK369处理组小鼠体重与空白对照组相比并没有明显变化(图10I)，也并未发现小鼠异常行为和不良反应，通过对小鼠主要脏器(包括心、肝、脾、肺、肾)进行HE染色，表明药物对小鼠主要脏器并没有明显毒性，其毒副作用比较低(图10J)。因此，可以得出结论，在体内动物模型中，本发明化合物WK369能够有效抑制BCL6高表达卵巢癌耐药细胞株SKOV3肿瘤的生长并上调BCL6下游的基因表达水平，而且并没有呈现明显的毒性。

实施例11：本发明化合物WK369体内抑制卵巢癌肿瘤的的腹腔内转移和远端脏器转移

卵巢癌是易扩散转移的肿瘤，因早期不易重视，一般确诊时大部分已到了晚期。卵巢癌发生转移最常见受累部位为肝表面、脾脏、肠系膜表面、肾脏、输卵管及其他盆腔腹膜等部位。卵巢癌腹腔移植瘤能够更好的模拟人卵巢癌腹腔扩散和腹水形成的生物学行为，主要用于腹腔治疗效果研究。由于在临床前研究中越来越多地使用腹腔内肿瘤模型，小动物活体光学成像系统(IVIS)被越来越多地用作监测疾病进展的手段。IVIS是一种利用荧光素酶催化荧光素反应产生的光的技术，其发光信号与体内和体外肿瘤细胞数量相关，灵敏度高，是跟踪肿瘤转移的理想信号。重要的是，IVIS允许在不需要牺牲动物的情况下进行持续监测。

技术方法：

本实验使用表达荧光素酶的BCL6高表达卵巢癌耐药细胞株ES-2，以及6-8周的BALB/c雌性小鼠，采用腹腔注射的方法，使肿瘤细胞进入小鼠腹腔内，成功构建卵巢癌腹腔移植肿瘤动物模型。操作流程如下：

1.构建稳定表达荧光素酶(Luciferase)的卵巢癌细胞株Es-2-luc。将表达萤火虫荧光素酶(Luciferase)的质粒(该质粒带有Puro抗性筛选标记)转入293T细胞株包装病毒，用病毒液感染ES-2细胞，加入Puro筛选稳转细胞系，稳转细胞可以表达荧光素酶，荧光素酶会与其底物荧光素发生反应发出荧光。

2.稳转细胞株构建好后，扩增至所需数量，扩增时期依然需要继续加入Puro维持筛选稳定表达荧光素酶的细胞。

3.细胞量足够后可以取一部分验证细胞是否稳定表达荧光素酶，若是阳性结果则可以使用胰酶消化细胞，离心去上清，PBS洗两遍，并使细胞密度为1×10⁸/mL。将细胞用PBS悬浮即可并放置于冰上以降低细胞的新陈代谢作用。

4.用酒精棉球擦拭裸鼠腹部，腹腔注射1000×10⁴个细胞的100μL细胞悬液，然后每隔三天用小动物活体成像系统IVIS检测肿瘤细胞的数目和位置(荧光的强度和位置)。

5.待肿瘤荧光强度后，开始对小鼠进行随机分组给药，分为2组：空白对照组(含10％DMSO的环糊精)和实验药物组(本发明化合物WK369-50mg/kg，用含10％DMSO的环糊精配制)，记第一天给药时间为0天，以后每10天对小鼠进行IVIS活体成像拍照观察肿瘤生长和转移情况。

6.给药第30天，用IVIS成像系统软件分析处理拍照数据后，处死小鼠，取肝、脾脏、肾脏、肠、卵巢等腹腔内器官拍照，记录肿瘤结节数，并作统计图。

7.记录小鼠实验期间的死亡情况，绘制小鼠存活统计图。

实验结果如图11所示，在卵巢癌腹腔肿瘤转移模型中，经过连续30天给药，生物荧光检测显示，本发明化合物WK369能有效抑制肿瘤的生长，肿瘤生长显著降低(图11A，11C)。并且本发明化合物WK369有效抑制卵巢癌的腹腔内扩散转移(图11B)，与对照组相比，本发明化合物WK369给药组小鼠肝、脾脏、肾脏、肠、卵巢等腹腔内器官表面的肿瘤结节数明显减少(图11D)。为了检测本发明化合物WK369能否延长小鼠的存活率，本发明进行存活率统计，结果表明，本发明化合物WK369能有效提高小鼠的存活率(图11E)。在连续给药过程中，并未发现小鼠异常行为和不良反应，表明药物并没有明显毒性，其毒副作用比较低。

上述实施例仅为了说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明保护范围内。

序列表

<110> 华东师范大学

<120> 小分子化合物WK369在制备治疗卵巢癌药物中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Ala Asp Ser Cys Ile Gln Phe Thr Arg His Ala Ser Asp Val Leu Leu

1 5 10 15

Asn Leu Asn Arg Leu Arg Ser Arg Asp Ile Leu Thr Asp Val Val Ile

20 25 30

Val Val Ser Arg Glu Gln Phe Arg Ala His Lys Thr Val Leu Met Ala

35 40 45

Cys Ser Gly Leu Phe Tyr Ser Ile Phe Thr Asp Gln Leu Lys Cys Asn

50 55 60

Leu Ser Val Ile Asn Leu Asp Pro Glu Ile Asn Pro Glu Gly Phe Cys

65 70 75 80

Ile Leu Leu Asp Phe Met Tyr Thr Ser Arg Leu Asn Leu Arg Glu Gly

85 90 95

Asn Ile Met Ala Val Met Ala Thr Ala Met Tyr Leu Gln Met Glu His

100 105 110

Val Val Asp Thr Cys Arg Lys Phe Ile Lys Ala Ser Glu Gly Ser Thr

115 120 125

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

His Ile Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Lys Glu Ala Gly Arg Ser Ile

1 5 10 15

His Glu Ile Pro Arg Glu Glu Leu

20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

aagcgccact gaatgaaact 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gtcgctgctc aatgtcaaga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cccttcccag aaaacctacc 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

aatcaaccca cagctgcac 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

ctgaagggtc cccaggtg 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

tagggcttcc tcttggagaa 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gtacgccaac acagtgctg 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

cgtcatactc ctgcttgctg 20

Claims (19)

1.WK369小分子化合物或其水合物或药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗BCL6异常表达的恶性肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述WK369的结构如式(1)所示：

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WK369用于制备BCL6抑制剂。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WK369用于抑制BCL6蛋白与转录共抑制子SMRT之间的相互作用以及抑制BCL6的转录抑制功能，上调BCL6下游基因的表达；其中，所述下游基因包括ATR、TP53、CDKN1A。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WK369用于抑制与BCL6异常表达相关的恶性肿瘤的增殖、生长、迁移、浸润、复发、耐药以及促进肿瘤周期阻滞和凋亡。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤包括卵巢癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、Ph+急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、小儿急性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤骨髓瘤、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WK369化合物用于在体外和/或体内选择性抑制BCL6异常表达卵巢癌细胞增殖和肿瘤生长。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WK369化合物用于在BCL6高表达卵巢癌细胞株、BCL6低表达卵巢癌细胞株和正常细胞株中，选择性抑制多株BCL6高表达卵巢癌细胞株SKOV3、ES-2、OVCAR8、CAOV3、MCAS、H08910PM的增殖和克隆形成。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WK369化合物在体外和/或体内选择性抑制BCL6高表达卵巢癌细胞的迁移、侵袭、转移。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WK369化合物在体外抑制BCL6高表达卵巢癌耐药细胞SKOV3和ES-2的迁移、侵袭。

10.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WK369化合物显著促进BCL6高表达卵巢癌细胞发生周期阻滞、凋亡。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WK369化合物显著促进BCL6高表达卵巢癌耐药细胞SKOV3和ES-2于G2/M期发生细胞周期阻滞。

12.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WK369化合物显著促进BCL6高表达卵巢癌耐药细胞SKOV3和ES-2发生早期和晚期细胞凋亡。

13.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WK369化合物用于抑制生发中心的形成。

14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WK369化合物在体内显著抑制小鼠生发中心形成以及减少生发中心B细胞的比例。

15.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WK369化合物用于在体内抑制BCL6高表达卵巢癌耐药细胞SKOV3的生长。

16.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WK369化合物在体内抑制BCL6高表达卵巢癌耐药细胞ES-2的腹腔内转移。

17.一种药物组合物，其特征在于，其包括如权利要求1中所述的式(I)所示的WK369化合物或其水合物或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

18.如权利要求17所述的组合物在制备治疗与BCL6过表达相关的恶性肿瘤疾病的增殖、生长、迁移、浸润、复发、耐药、促进肿瘤周期阻滞和凋亡药物中的应用。

19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤包括卵巢癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、Ph+急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、套细胞淋巴瘤骨髓瘤、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤。

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