CN112494515A - 一种调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶及其制备方法和应用,属于生物医药领域。所述的银纳米水凝胶由银纳米粒子和黏膜粘附凝胶组成。该银纳米水凝胶含有无机银纳米粒子、天然高分子多糖、多醛基高分子材料和脱乙酰高分子材料。该银纳米水凝胶可以调节黏膜的菌群丰度,抑制其他细菌增殖,同时能促进厌氧消化链球菌等免疫激活菌增殖,从而增强免疫应答。同时,该凝胶还可粘附在人体黏膜上,实现在患处长时间滞留,持续调节人体共生菌群。该银纳米水凝胶可生物降解,生物相容性优异,安全无毒副作用,且具有制备简便,持续高效等优点。本发明对于调节共生菌群,激活人体免疫,辅助抗癌等生物医用领域具有重大的社会和经济意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
免疫疗法是一种通过调动人体免疫系统来消除癌症的治疗方式。这一方法对于高抗原负载肿瘤的治疗有着重要意义,但较低的响应率成为限制免疫疗法发挥功效的主要阻碍,上调免疫治疗响应率是提高免疫疗法效果的重要突破口之一。
有证据表明,微生物菌群和某些癌症发病的空间位置高度重合,且与宿主免疫系统的效应性之间联系紧密。具有免疫激活效果的细菌,可以有效上调宿主免疫反应强度。由此可见,调控菌群或成为肿瘤免疫诱导策略的一种途径。
以口腔鳞状细胞癌为例,口腔鳞状细胞癌是常见的高抗原负载肿瘤之一,局部复发率较高,常发生颈部淋巴结转移,预后较差。据统计,每年约有540000例口腔鳞状细胞癌确诊,约有50%的患者在确诊时表现为晚期且伴有淋巴结转移。在过去的半个世纪里,5年内总生存率在50%左右。尽管在各报道中不同地域、不同时间段内鳞癌的发病构成比有所差异,但总体上看鳞癌是口腔颌面部最为常见的恶性肿瘤。临床鳞癌的治疗手段多为外科手术、诱导放疗,生物治疗(中药或靶向),必不可少的还有术后的康复治理,例如赝复、牙种植等。外科手术造成较大的创面和组织器官缺失,虽然后术后的头颈部修复重建外科手术可以解决手术遗留的大范围组织器官缺损的修复问题,但是冗长的治疗周期和较高的费用给患者带来巨大的生理和经济负担。且由于鳞癌易转移,转移灶有一定程度的不可知性,手术清扫的择区有一定困难。与此同时,化疗放疗以及其他传统癌症治疗手段因为靶向性差,不良反应强,效果不尽人意。近期,由于口腔鳞状细胞癌的高抗原负载,免疫疗法成为其治疗的新突破口。然而一些研究表明,口腔鳞状细胞癌的响应性很低,只有14.6%。与此同时,口腔鳞癌的位置与口腔菌群的空间分布高度重叠。因此,调控口腔菌群有望为增强免疫疗法在口腔鳞状细胞癌中的效果提供帮助。
传统的调控菌群口腔护理物一般不具有菌种特异性。中国发明专利CN111840126A公开了一种具有抑菌作用的口腔护理剂,包括溶菌酶和蒙脱石。具体公开了一种溶菌酶生物牙膏,包括溶菌酶0.4%,蒙脱石1%,摩擦剂,润湿剂,粘合剂,表面活性剂,防腐剂,甜味剂,增稠剂和发泡剂,其余为去离子水。溶菌酶的抑菌谱广,无选择杀伤性,对于口腔有益菌群也具有杀伤作用,且成分复杂,不适用医疗用途。中国发明专利CN108324681A公开了一种治疗口腔念珠菌感染的制霉菌素口腔凝胶剂。该口腔凝胶由制霉菌素、凝胶基质羟乙基纤维素、凝胶增强剂丙烯酸树脂组成。该凝胶采用传统抗生素,长期使用易产生耐药菌种,且抑菌谱缺乏特异性,无法实现对整体黏膜菌群的调控。上述两种口腔护理凝胶功能单一,应用场景单一,无抑菌之外的其他功能。中国发明专利CN108158978A公开了一种高分子水性凝胶,该凝胶是由卡波姆、甘油、聚山梨酯、纯化水等原料药制成,采用NaOH溶液调节pH,上述组合物经化学工艺方法混合后制成凝胶。该水性凝胶制备工艺相对复杂,仅起到一个物理阻隔吸附的作用,且黏附性太强致异物感强烈,用户体验感有待加强。
因此,临床亟待发展一种可特异性、持续性调控人体共生菌群的黏膜护理剂产品,该产品具有疗效好、独创性调控黏膜菌群、增强人体免疫力等特点,并可不断衍生出其他更丰富的多元化的应用。
发明内容
在恶性肿瘤响应性低、阻碍免疫疗法效果的背景下,本发明的目的在于针对目前凝胶类产品功能单一、无法特异性调控共生菌群的缺陷,提供一种可以应用于肿瘤预防或治疗的调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶及其制备方法。该水凝胶可生物降解,生物相容性优异,安全无毒副作用,且具有制备简便,持续高效等优点。
本发明的目的采用以下技术方案实现:
一种调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶,由银纳米粒子和黏膜粘附水凝胶组成。其中,所述的银纳米粒子由硝酸银和天然高分子多糖在紫外光(UV)下合成得到;所述的天然高分子多糖包括淀粉、纤维素、葡聚糖等。所述的黏膜粘附水凝胶由脱乙酰高分子材料与多醛基高分子材料构建而成;所述的脱乙酰高分子材料为聚糖类天然高分子,包括纤维素、透明质酸、壳聚糖、肝素等;所述的多醛基高分子材料由天然高分子经醛基修饰改性后得到,包括以丁香醛、香草醛及其衍生物为单体聚合成的高分子材料、聚醛葡聚糖等。
所述的调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶具有调控人体黏膜共生菌群的功能,银纳米粒子可特异性抑制大肠杆菌、苏云金杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌的生长,但是不影响厌氧消化链球菌增殖,从而调控人体黏膜共生菌群组成。
所述的调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶可与患处组织形成化学键而实现黏附,将其粘附于患处可长时间滞留发挥调节菌群、激活免疫应答作用。
所述的调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶可用于制备黏膜护理剂。具体的,所述的黏膜护理剂为调节共生菌群的黏膜护理剂或激活免疫的黏膜护理剂。
所述的调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶还可用于制备辅助抗癌药物。
所述的调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶的制备方法,包括如下步骤:
将硝酸银和天然高分子多糖溶于去离子水中,紫外光照射后离心得到银纳米粒子,将银纳米粒子分散在脱乙酰高分子材料溶液中得到溶液A。将天然高分子多糖溶于去离子水中形成天然高分子多糖溶液,加入强氧化剂进行反应得到多醛基高分子溶液B。溶液A与溶液B混合得到银纳米水凝胶。
硝酸银和天然高分子多糖的质量比优选为1:10~5:1,硝酸银和天然高分子多糖溶于去离子水中形成的溶液的浓度优选为0.2~1wt%;脱乙酰高分子溶液的浓度优选为0.5~2wt%;溶液A中银纳米粒子的浓度优选为0.2~1.2mg/mL。天然高分子多糖溶液的浓度优选为1~5wt%;强氧化剂与天然高分子多糖的质量比优选为1:5~1:10之间,反应的条件优选为搅拌6~24h;溶液B中多醛基高分子的浓度为1~5wt%。溶液A与溶液B两者的体积比优选为1:2~3:1。
本发明具有以下优点和有益效果:
(1)一种调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶,利用无机银纳米粒子的生物特性,协同改性水凝胶的结构特性,可在患处原位快速成膜,在患处黏膜组织以形成化学键的方式实现长效滞留,粘附性能优异。
(2)无机银纳米粒子还可调控黏膜菌群,选择性抑制除了免疫激活菌厌消化链球菌属之外其他菌种的生长,激活宿主免疫系统,大幅提高宿主免疫力,可解决高抗原负载肿瘤响应率低的问题,可用于癌症免疫疗法的辅助治疗。
(3)本发明还可生物降解,生物相容性优异,安全无毒副作用,且具有制备简便,对设备要求低,持续高效等优点。本发明对于调节共生菌群,激活人体免疫,辅助抗癌等生物医用领域具有着实际重大的社会和经济意义。
附图说明
图1是调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶的工作原理图。
图2是黏膜粘性水凝胶合成图。
图3是调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶粘附性评价实验结果图。
图4是调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶调节菌群实验结果图。
图5是厌氧消化链球菌激活免疫效果图。
图6是调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶生物安全性实验结果图。
具体实施方式
本发明工作原理(图1)如下:银纳米粒子可以帮助免疫激活菌成为优势菌种,抑制患处其他微生物生长,从而增强免疫应答。同时,由壳聚糖和聚醛葡聚糖制备而成,可粘附在黏膜患处的黏膜粘附水凝胶可保证银纳米粒子的滞留,持续调节黏膜菌群。
以下实施例用于进一步说明本发明,但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶制备方法
将AgNO3和葡聚糖以1:10~5:1的比例溶于去离子水中形成0.2~1wt%溶液。室温UV照射后离心得到银纳米粒子,分散在0.5~2wt%壳聚糖溶液中得到溶液A,溶液A中银纳米粒子的浓度为0.2~1.2mg/mL。将葡聚糖溶于去离子水中形成1~5wt%溶液,加入与葡聚糖质量比为1:5~1:10之间的KIO4,搅拌12h后形成含聚醛葡聚糖1~5wt%的溶液B。如图2所示,将溶液A和溶液B以体积比1:2~3:1之间混合即可得到银纳米水凝胶。
实施例2调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶患处滞留效果
饲养6周龄雌性C57BL/6小鼠,灌服含4-NQO 100μg/mL的饮水16周,建立小鼠口腔鳞状细胞癌原位模型。
将10mg花氰染料Cy5和1g的壳聚糖配制成1wt%的Cy5-壳聚糖溶液搅拌过夜。在150mL去离子水中加入0.68g AgNO3和0.35g葡聚糖T100,室温UV照射,搅拌反应12h后5000g离心得到AgNP,分散在1wt%Cy5-壳聚糖溶液中得到溶液A,调整溶液A中银纳米粒子的浓度为0.6mg/mL。将1g葡聚糖T100溶解于50mL去离子水中,加入0.1g KIO4,搅拌12h后形成溶液B。将溶液A和溶液B以体积比1:2混合即可得到花氰染料Cy5标记的银纳米水凝胶。
将花氰染料Cy5标记的银纳米水凝胶涂抹于小鼠患处,并在体内进行荧光成像,测量荧光强度随时间的变化。结果如图3所示,即使在24h后,口腔内仍能观察到强的Cy5荧光(图3左)。24h后处死小鼠,取舌,在粘膜组织表面观察到一层厚度约为50μm的水凝胶(图3右)。实验结果表明调节菌群激活免疫应答的银纳米粒子水凝胶具有良好的黏附滞留效果。
实施例3调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶调节菌群效果
在150mL去离子水中加入0.57g AgNO3和0.25g葡聚糖T100,室温UV照射,搅拌反应12h后5000g离心得到AgNP。
在5mL去离子水中加入10g尿素,悬浮液置于氧化铝坩埚中。将混合物加热至550℃,反应3小时,冷却至25℃,用去离子水洗涤三次,得到C3N4纳米颗粒。
13g FeCl3·6H2O和6.5g FeCl2·4H2O溶于80mL去离子水中,将氮气充入上述溶液中0.5h。在80℃下滴加加入45mL NH3·H2O,然后加入用15mL去离子水溶解的7.5g柠檬酸。95℃反应90min,得到的Fe3O4纳米颗粒用透析袋(MWCO:14000Da)纯化。
纤维素、ZnO、石墨烯纳米粒子均从市场购入。
将100mL 5mM的HAuCl4溶液与300mL 2mM的冰冻NaBH4溶液混合,滴加50mL PVA(1%)。室温搅拌3h后,煮沸1h,5000g离心得到AuNP。
壳聚糖溶于体积分数1%醋酸形成0.175wt%溶液,用10N NaOH调pH至4.7。取500μL上述壳聚糖溶液,磁力搅拌加入100μL 0.291wt%TPP,5000g离心后得到壳聚糖纳米粒子。
将浓度均为10μg/mL的8种不同类型的纳米颗粒(AgNP、AuNP、Fe3O4、纤维素、C3N4、ZnO、石墨烯、壳聚糖纳米粒子),分别与苏云金杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、核梭杆菌、厌氧消化链球菌等不同细菌共培养。细菌共培养均使用平台期菌液100μL,50mL对应培养基(苏云金杆菌、枯草杆菌使用MRS培养基;大肠杆菌、金黄色葡萄球菌使用LB培养基;核梭杆菌、厌氧消化链球菌使用BHI培养基),调节纳米粒子浓度为30mg/L,在37℃下共培养。将细菌与纳米材料共孵育6h后,测定OD600值,监测细菌的增殖情况。结果如图4所示,银纳米粒子可显著抑制除厌氧消化链球菌外的多种细菌的增殖,而对厌氧消化链球菌的生长无显著影响。因此,银纳米粒子可抑制其他微生物的生长,使厌氧消化链球菌在菌群中获得生长优势。
实施例4厌氧消化链球菌激活免疫效果
在6只6周龄C3H小鼠皮下接种SCC7细胞(100μL,1×106/mL)。待肿瘤长到100mm3后,将6只小鼠随机分为A、B两组。A组小鼠瘤内注射106CFU的厌氧消化链球菌,B组小鼠瘤内注射等体积的PBS,培养一周后,通过流式细胞术检测引流淋巴结内DC细胞的活化水平,测定3个生物重复。实验结果如图5所示,T细胞和树突状细胞显著上调。这一结果表明,厌氧消化链球菌激活抗原呈递细胞,招募肿瘤杀伤T细胞,并减少肿瘤定植后的免疫抑制。包括T细胞、M1巨噬细胞。说明瘤内注射厌氧消化链球菌可激活SCC7荷瘤C3H小鼠的免疫系统。
实施例5调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶生物安全性
在300mL去离子水中加入1.73g AgNO3和0.67g葡聚糖T100,室温UV照射,搅拌反应12h后5000g离心得到AgNP,分散在1wt%壳聚糖溶液中得到溶液A,调整溶液A中银纳米粒子的浓度为0.5mg/mL。将1g葡聚糖T100溶解于40mL去离子水中,加入0.153g KIO4,搅拌12h后形成溶液B。将溶液A和溶液B以体积比1:5混合即可得到银含量为68μg/mL的银纳米水凝胶。
将6只雌性C57BL/6小鼠分为两组。取银含量为68μg的银纳米水凝胶100μL均匀涂抹于3只小鼠口腔。将同体积100mol/L的磷酸盐缓冲液均匀地涂抹于其他3只小鼠的口腔。三天后,通过心脏取出小鼠血液进行分析。用全自动生化分析仪检测血糖、肌酐、谷丙转氨酶、天冬氨酸转氨酶水平。血液常规采用全自动血细胞计数仪进行数据采集。结果如图6所示,各项指标无显著性差异,调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶生物安全性良好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶,其特征在于,所述的调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶由银纳米粒子和黏膜粘附水凝胶组成。
2.根据权利要求1所述的调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶,其特征在于,所述的银纳米粒子由硝酸银和天然高分子多糖在紫外光下合成得到。
3.根据权利要求2所述的调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶,其特征在于,所述的天然高分子多糖包括淀粉、纤维素、葡聚糖。
4.所述的根据权利要求1所述的调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶,其特征在于,所述的黏膜粘附水凝胶由脱乙酰高分子材料与多醛基高分子材料构建而成。
5.根据权利要求4所述的调节菌群激活免疫应答的银纳米水凝胶,其特征在于,
所述的脱乙酰高分子材料为聚糖类天然高分子;
所述的多醛基高分子材料由天然高分子经醛基修饰改性后得到。
6.权利要求1-5任一项所述的银纳米水凝胶在制备黏膜护理剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述的黏膜护理剂为调节共生菌群的黏膜护理剂或激活免疫的黏膜护理剂。
8.权利要求1-5任一项所述的银纳米水凝胶在制备辅助抗癌药物中的应用。
9.权利要求1-5任一项所述的银纳米水凝胶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:将硝酸银和天然高分子多糖溶于去离子水中,紫外光照射后离心得到银纳米粒子,将银纳米粒子分散在脱乙酰高分子材料溶液中得到溶液A;将天然高分子多糖溶于去离子水中形成天然高分子多糖溶液,加入强氧化剂进行反应得到多醛基高分子溶液B;将溶液A与溶液B混合得到银纳米水凝胶。
10.根据权利要求9所述的银纳米水凝胶的制备方法,其特征在于,脱乙酰高分子材料溶液的浓度为1~5wt%,溶液A中银纳米粒子的浓度为0.2~1.2mg/mL;溶液B中多醛基高分子的浓度为1~5wt%;溶液A与溶液B两者的体积比为1:2~3:1。
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