CN112494499B - 海洋磷脂作为有效成分在制备预防和/或治疗心脏疾病药物中的应用 - Google Patents

海洋磷脂作为有效成分在制备预防和/或治疗心脏疾病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及海洋磷脂作为有效成分在制备预防和/或治疗心脏疾病药物中的应用，本发明分离得到5种磷脂类组分包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、神经鞘磷脂，本发明发现上述组分对心脏具有较好的保护和治疗作用；对花生四烯酸诱导的斑马鱼血栓、维拉帕米诱导的斑马鱼心力衰竭和特非那定诱导的斑马鱼心率失常，磷脂类组分显示出显著的心脏保护作用，能明显的减少斑马鱼淤血、心脏扩张和促使心率趋于正常。

Description

海洋磷脂作为有效成分在制备预防和/或治疗心脏疾病药物 中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及海洋磷脂作为有效成分在制备预防和/或治疗心脏疾病药物中的应用。
背景技术
心脏疾病是一种常发病，具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多”等特点，严重威胁人类健康。近年来，心脏病发病年龄趋于年轻化。目前，治疗心脏疾病药物存在肝毒性等安全性问题，对研发安全有效的心脏疾病药物需求迫切。
斑马鱼是心脏疾病药物发现早期快速筛选和靶点定位的重要模式生物。斑马鱼与人类基因有高度的相似性，具有脊椎动物大部分的组织器官，并与哺乳动物具有相似的心血管、神经以及代谢系统，可以提供广泛的信息来研究人类疾病相关的基因变异，有助于识别疾病的机制。另外，斑马鱼个体体积小，易于饲养，繁殖周期短，产卵量大，胚体透明，易于观察，便于实验操作。
中国专利文献CN1748706A(申请号：200410066337.9)公开了一种卵磷脂和类黄酮小分子的组合物、制备方法和它们的用途，公开了用卵磷脂和类黄酮小分子组成的组合物将人体细胞和组织中胆固醇，尤其血管内壁动脉粥样硬化斑块中胆固醇转运出体外，减少血管中斑块堵塞体积从而可在制备治疗心肌梗死、心绞痛等任何由于血管狭窄导致的缺血性病理改变；包括心力衰竭和猝死、脑组织缺血及脑部血管破裂造成的脑出血等，另外还包括充血性心力衰竭、高血压、冠心病引发的心率失常等疾病中应用。该专利文献公开的是一种卵磷脂和类黄酮小分子的组合物，而本发明是以海洋磷脂作为有效成分在制备预防和/或治疗心脏疾病药物中的应用。
中国专利文献CN1440240A(申请号：01812461.5)公开了用于预防和、或治疗血管疾病的制剂，所述制剂包括以下部分：a)部分，长链多不饱和脂肪酸；b)部分，磷脂，这部分含有至少两种不同的磷脂，所述磷脂选自磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺；c)部分，化合物，所述化合物是甲硫氨酸代谢中的因子，这部分含有选自叶酸、维生素B12、维生素B6、镁和锌中的至少一员。该专利文献公开是磷脂作为制剂的一部分在血管疾病中的应用，而本发明是以海洋磷脂作为有效成分在制备预防和/或治疗心脏疾病药物中的应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种海洋来源的磷脂作为有效成分在制备预防和/或治疗心脏疾病药物中的应用。
术语说明
海洋磷脂：所述海洋磷脂为从鱼、虾、贝等各种海洋生物中提取得到的天然磷脂类成分。
南美白对虾中磷脂类成分：总磷脂(PV)、磷脂酰胆碱(卵磷脂，PV-PC)、磷脂酰乙醇胺(PV-PE)、磷脂酰肌醇(PV-PI)、磷脂酰丝氨酸(PV-PS)、神经鞘磷脂(PV-SM)。
本发明的技术方案如下
海洋磷脂作为有效成分在制备预防和/或治疗相关心脏疾病药物中的应用。
根据本发明优选的，上述应用中，所述海洋磷脂为总磷脂(PV)、磷脂酰胆碱(PV-PC)、磷脂酰乙醇胺(PV-PE)、磷脂酰肌醇(PV-PI)、磷脂酰丝氨酸(PV-PS)、神经鞘磷脂(PV-SM)中的一种或两种以上。
根据本发明优选的，上述应用中，所述心脏疾病为心力衰竭；进一步优选的，所述海洋磷脂为神经鞘磷脂(PV-SM)。
根据本发明优选的，上述应用中，所述心脏疾病为心率失常，所述海洋磷脂为磷脂酰乙醇胺(PV-PE)和/或神经鞘磷脂(PV-SM)。
海洋磷脂作为有效成分在制备预防和/或治疗相关血栓性疾病药物中的应用。
根据本发明优选的，上述应用中，所述海洋磷脂为总磷脂(PV)、磷脂酰胆碱(PV-PC)、磷脂酰乙醇胺(PV-PE)、磷脂酰肌醇(PV-PI)、磷脂酰丝氨酸(PV-PS)、神经鞘磷脂(PV-SM)中的一种或两种以上；进一步优选的，所述海洋磷脂为磷脂酰乙醇胺(PV-PE)和/或神经鞘磷脂(PV-SM)。
根据本发明优选的，上述应用中，所述海洋磷脂来源于海洋中的甲壳类浮游动物和/或海洋中的软体动物。
根据本发明优选的，上述应用中，所述海洋磷脂来源于南美白对虾；进一步优选的，所述海洋磷脂来源于南美白对虾的虾头。
所述海洋磷脂的制备方法，包括如下步骤：
将海洋生物样品匀浆破碎，加入浓度为50％-95％乙醇搅拌提取得提取物，用正己烷-丙酮沉淀获得总磷脂成分(PV)；根据层析法将总磷脂成分进行分离，分别得到磷脂酰胆碱(PV-PC)、磷脂酰乙醇胺(PV-PE)、磷脂酰肌醇(PV-PI)、磷脂酰丝氨酸(PV-PS)和神经鞘磷脂(PV-SM)。
根据本发明优选的，所述海洋磷脂的制备方法，包括如下步骤：
将海洋生物样品匀浆破碎，加入样品8倍量体积的浓度为95％乙醇，搅拌提取2次，每次6小时，混合两次乙醇提取液，用旋转蒸发仪蒸干乙醇提取物；乙醇提取物先用净化剂溶解，所述净化剂为将质量分数为1％CaCl2溶液与无水乙醇按体积比1:20混合制得，再用4倍量净化剂的正己烷萃取两次，将正己烷层萃取物蒸干得到干燥物；将干燥物用正己烷配成0.5g/mL溶液，再加入正己烷10倍量的丙酮于-18℃下沉淀两次，每次沉淀12h；离心收取沉淀物，将沉淀物干燥获得总磷脂(PV)；进一步优选的，在磷脂标准品的指导下，用200-300目的硅胶柱色谱对总磷脂(PV)进行分离，洗脱溶剂为CH2Cl2：MeOH，体积比为1：(0-1)，分别得到磷脂酰胆碱(PV-PC)、磷脂酰乙醇胺(PV-PE)、磷脂酰肌醇(PV-PI)、磷脂酰丝氨酸(PV-PS)和神经鞘磷脂(PV-SM)。
根据本发明优选的，上述制备方法中，所述海洋生物样品为南美白对虾的虾头。
本发明技术方案的有益效果
1、本发明首次对海洋磷脂组分进行系统分离，并对分离得到的磷脂组分以斑马鱼为模型进行心脏活性的研究。
2、本发明在南美白对虾中分离得到5种磷脂类组分包括磷脂酰胆碱(卵磷脂，PV-PC)、磷脂酰乙醇胺(PV-PE)、磷脂酰肌醇(PV-PI)、磷脂酰丝氨酸(PV-PS)、神经鞘磷脂(PV-SM)，本发明发现上述组分对心脏具有较好的保护和治疗作用；对花生四烯酸诱导的血栓、维拉帕米诱导的斑马鱼心力衰竭和特非那定诱导的心率失常，磷脂类组分有显著的保护心脏的作用，能明显的减少淤血、心脏扩张和促使心率趋于正常。
附图说明
图1是PV、PV-PC、PV-PE、PV-PI、PV-PS和PV-SM对斑马鱼血栓影响的代表图；
图中：PV的低中高剂量组分别为PVL、PVM、PVH；
PV-PC的低中高剂量组分别为PV-PCL、PV-PCM、PV-PCH；
PV-PE的低中高剂量组分别为PV-PEL、PV-PEM、PV-PEH；
PV-PI的低中高剂量组分别为PV-PIL、PV-PIM、PV-PIH；
PV-PS的低中高剂量组分别为PV-PSL、PV-PSM、PV-PSH；
PV-SM的低中高剂量组分别为PV-SML、PV-SMM、PV-SMH；
##，P<0.01，与正常对照组相比；*，P<0.05，与模型对照组相比。
图2是PV、PV-PC、PV-PE、PV-PI、PV-PS和PV-SM对斑马鱼心力衰竭影响的代表图；
图中：a：心脏扩张面积；b：静脉淤血面积；
PV的低中高剂量组分别为PVL、PVM、PVH；
PV-PC的低中高剂量组分别为PV-PCL、PV-PCM、PV-PCH；
PV-PE的低中高剂量组分别为PV-PEL、PV-PEM、PV-PEH；
PV-PI的低中高剂量组分别为PV-PIL、PV-PIM、PV-PIH；
PV-PS的低中高剂量组分别为PV-PSL、PV-PSM、PV-PSH；
PV-SM的低中高剂量组分别为PV-SML、PV-SMM、PV-SMH；
##，P<0.01，与正常对照组相比；
**，P<0.01；*，P<0.05，与模型对照组相比。
图3是PV、PV-PC、PV-PE、PV-PI、PV-PS和PV-SM对斑马鱼心率失常影响的代表图；
##，P<0.01，与正常对照组相比；*，P<0.05，与模型对照组相比。
具体实施方式
下面结合实施例与附图对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
材料的来源
新鲜的南美白对虾为普通市售产品，储存于山东省科学院生物研究所实验室-20℃冰箱内；
斑马鱼为山东省科学院生物研究所药物筛选研究室提供，为普通市售产品。
链酶蛋白酶E购买于北京酷来搏科技有限公司，为普通市售产品。
实施例1
1.磷脂组分的制备
将200g南美白对虾的虾头用匀浆机匀浆破碎，加入原料8倍量体积的浓度为95％乙醇搅拌提取2次，每次6小时，混合两次提取液，用旋转蒸发仪蒸干得虾头乙醇提取物。
将上述乙醇提取物先用净化剂溶解，所述净化剂为将质量分数为1％CaCl2溶液与无水乙醇按体积比1:20混合制得，再用4倍量净化剂的正己烷萃取两次，将正己烷层萃取物蒸干称重得干燥物，将干燥物用正己烷配成0.5g/mL溶液，再加入正己烷10倍量的丙酮于-18℃下沉淀两次，每次沉淀12h，离心沉淀，将沉淀物干燥称重，获得总磷脂成分(PV)；在磷脂标准品的指导下，用硅胶(200–300目)柱色谱对PV进行分离，洗脱溶剂为CH2Cl2/MeOH(体积比为5：1)，得到PV-PE，PV-PC，PV-SM和组分1–7。在另一个硅胶(200–300目)柱上分离组分7，洗脱溶剂为CH2Cl2/MeOH(体积比为6：1)，得到PV-PI和PV-PS。
2.磷脂组分的定量
用硫氰铁铵分光光度法测定PV的含量和每种磷脂组分的纯度，在容量瓶中加入硫氰酸铵3.04g和氯化铁2.70g，用水溶解至100mL得到硫氰铁铵试剂。将PC，PE，PI，PS，SM的标准品溶解在氯仿中，制成浓度为0.1mg/mL的标准溶液。将PV、PV-PE、PV-PC、PV-SM、PV-PI、PV-PS的样品分别溶于氯仿中制备成0.25mg/mL的样品溶液。
通过检测磷脂标准溶液和硫氰铁铵试剂反应后配合物的最大吸收波长来确定测量波长。反应条件如下：在试管中加入2mL标准溶液和2mL硫氰铁铵试剂，涡旋振荡2min，放置5min，得到下层。在300–700nm下以氯仿作为空白对照溶液，确定最大吸收波长。基于吸光度(Y)对浓度(X)的回归分析，建立回归方程。方法如下：向试管中加入0.1、0.2、0.4、0.8、1.2mL标准溶液和2mL硫氰铁铵试剂，并补充氯仿，使氯仿相的最终体积为2mL。涡旋振荡2min，放置5min，得到下层。用氯仿作为空白对照溶液于最大吸收波长处获得吸光度。通过吸光度和回归方程对各磷脂组分进行定量。结果表明，PV的磷脂含量为45.7％；各种磷脂组分的纯度为75.5–88.1％，见表1。
表1.各磷脂组分的回归方程和纯度
Figure BDA0002834521470000051
实施例2
南美白对虾磷脂类组分对斑马鱼血栓、心力衰竭和心率失常的影响。
1.实验动物
本发明抗血栓实验和抗心力衰竭实验所用动物均为AB野生型斑马鱼，心率失常实验所用动物为心脏荧光转基因Tg(cmlc2:GFP)系斑马鱼。在28℃、黑暗/照明(10h：14h)光周期的条件下饲养，每天定时定量喂食丰年虾。交配放鱼时，按1:2的比例取健康成熟的雌雄斑马鱼，获得受精卵。1hpf(hours post fertilization)收集胚胎，用养鱼水对受精卵进行清洗。发育至3dpf(days post-fertilization)的AB野生型斑马鱼胚胎用于抗血栓实验，发育至48hpf的AB野生型斑马鱼胚胎用于抗心力衰竭实验，发育至48hpf的Tg(cmlc2:GFP)系斑马鱼胚胎用于抗心率失常的实验，所有胚胎放入28℃光照培养箱中培养。
2.分组与给药
2.1斑马鱼血栓实验
发育至3dpf的AB野生型斑马鱼胚胎，随机分为21组，即正常对照组，模型对照组，阳性对照组(阿司匹林，终浓度30μg/mL)和PV、PV-PC、PV-PE、PV-PI、PV-PS、PV-SM的低、中、高剂量组(终浓度分别为20、40、80μg/mL)，置于24孔板中每组2个复孔，每孔10枚胚胎，养鱼水2mL。6h后除了正常对照组外其余各组加入造模药花生四烯酸(终浓度80μM)，1h后用1mg/mL的邻联茴香胺染色液染色10min。养鱼水洗3次，将各组斑马鱼放在显微镜下观察静脉血栓形成情况并拍照；采用Image Pro Plus 5.0手动测量心脏中血栓面积。
2.2斑马鱼心力衰竭实验
发育至48hpf的AB野生型斑马鱼胚胎，加入1mg/mL的链酶蛋白酶E溶液脱去卵膜。将胚胎随机分为6组，即正常对照组，模型对照组，阳性对照组(地高辛，终浓度16μg/mL)和PV、PV-PC、PV-PE、PV-PI、PV-PS、PV-SM的低、中、高剂量组(终浓度分别为20、40、80μg/mL)，置于24孔板中每组2个复孔，每孔10枚胚胎，养鱼水2mL。4h后除了正常对照组外其余各组加入造模药维拉帕米(终浓度200μg/mL)，30min后利用显微镜观察斑马鱼心脏扩张和静脉淤血情况；采用Image Pro Plus 5.0手动测量心脏扩张和静脉淤血面积。
2.3斑马鱼心率失常实验
胚胎发育至48hpf的Tg(cmlc2:GFP)系斑马鱼胚胎，加入1mg/mL的链酶蛋白酶E溶液脱去卵膜。将胚胎随机分为6组，即正常对照组，模型对照组，阳性对照组(丹红注射液，终浓度9μL/mL)和PV、PV-PC、PV-PE、PV-PI、PV-PS、PV-SM的低、中、高剂量组(终浓度分别为20、40、80μg/mL)，置于24孔板中每组2个复孔，每孔10枚胚胎，加入含造模药特非那定(终浓度15μM)的养鱼水2mL；24h后利用荧光显微镜观察统计斑马鱼心率。
3.观察统计
各组指标均以
Figure BDA0002834521470000061
表示，使用SPSS13.0统计软件进行统计描述，多个样本均数采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。
4.结果分析
4.1各磷脂组分对斑马鱼血栓形成的影响
斑马鱼尾静脉中形成的血栓导致心脏红细胞的减少，因此，使用心脏红细胞的染色面积来评估血栓形成的程度；本发明的实验结果表明，见图1，模型组心脏中红细胞的染色面积显著降低是正常组的52.55％。在花生四烯酸造模之前给予磷脂可增加心脏中红细胞的染色面积，特别是PV、PV-PE、PV-SM低、中、高剂量组的红细胞的染色面积达到正常组的79.55％-101.38％，PV-PI和PV-PS高剂量组的红细胞的染色面积达到正常组的82.38％和87.15％，PV-PS中剂量组心脏中红细胞的染色面积达到正常组的84.48％，均大于阳性对照组的76.65％(P<0.05)，PV-PC组心脏中红细胞的染色面积没有显著增大，相比其他磷脂组活性较弱。
4.2各磷脂组分对斑马鱼心力衰竭的影响
在抗心力衰竭活动实验中，实验结果见图2，维拉帕米用作模型药物，与正常对照组相比，模型对照组的斑马鱼心脏明显增大达到58740.28μm2(正常组为37203.71μm2)，静脉严重充血达到23882.40μm2(正常组为9240.57μm2)(P<0.01)。预先给予磷脂的各组均不同程度的缓解心脏扩张和静脉充血，这表明磷脂可以改善斑马鱼幼鱼的心功能。特别是，PV-SM低中高剂量组的心脏扩张面积为38845.86、41291.86、38887.86μm2；静脉淤血面积为9029.14、7526.14、7969.25μm2，疗效优于其他磷脂组和阳性对照组(心脏扩张面积和静脉淤血面积分别为47254.00μm2、18069.60μm2)(P<0.05)。
4.3各磷脂组分对斑马鱼心律失常的影响
在抗心律失常活性实验中，实验结果见图3，特非那定被用作模型药物，模型对照组的心率显著下降到94.00次/分(正常组为152.67次/分)(P<0.01)。此外，在特非那定诱发后，心脏跳动较弱，心房和心室不规则收缩和扩张。给予磷脂成分后，PV-PE和PV-SM组的心率增加，尤其是PV-PE高剂量组和PV-SM中剂量组活性较强，分别达到138.00和127.43次/分，并表现出强有力心跳(P<0.05)。而PV-PI和PV-PS高剂量组显示了诱导心律失常的作用，心率降低到84.57和87.00次/分。
5.结论
PV在斑马鱼活性实验中显示出一定的心脏保护活性，值得注意的是，PV-PE和PV-SM具有明显的抗血栓形成和抗心律失常活性，同时PV-SM具有显著的抗心衰的作用；由于某些磷脂组分的活性强于总磷脂(PV)，因此分离磷脂以获得单一组分进行药物研究，有望开发作为预防和/或治疗为心脏疾病的药物。

Claims (3)

1.海洋磷脂作为有效成分在制备预防和/或治疗心脏疾病药物中的应用，所述海洋磷脂为磷脂酰乙醇胺，不含有磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸；
所述心脏疾病为心力衰竭、心率失常、心脏血栓；
所述海洋磷脂的制备方法，包括如下步骤：将海洋生物样品匀浆破碎，加入样品8倍量体积的浓度为95%乙醇，搅拌提取2次，每次6小时，混合两次乙醇提取液，用旋转蒸发仪蒸干乙醇提取物；乙醇提取物先用净化剂溶解，所述净化剂为将质量分数为1%CaCl2溶液与无水乙醇按体积比1:20混合制得，再用4倍量净化剂的正己烷萃取两次，将正己烷层萃取物蒸干得到干燥物；将干燥物用正己烷配成0.5g/mL溶液，再加入正己烷10倍量的丙酮于-18℃下沉淀两次，每次沉淀12h；离心收取沉淀物，将沉淀物干燥获得总磷脂；在磷脂标准品的指导下，用200-300目的硅胶柱色谱对总磷脂进行分离，洗脱溶剂为CH2Cl2：MeOH，体积比为1：（0-1），得到磷脂酰乙醇胺；
所述海洋生物样品为南美白对虾的虾头。
2.海洋磷脂作为有效成分在制备预防和/或治疗心脏疾病药物中的应用，所述海洋磷脂为神经鞘磷脂，不含有磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸；
所述心脏疾病为心力衰竭、心率失常、心脏血栓；
所述海洋磷脂的制备方法，包括如下步骤：将海洋生物样品匀浆破碎，加入样品8倍量体积的浓度为95%乙醇，搅拌提取2次，每次6小时，混合两次乙醇提取液，用旋转蒸发仪蒸干乙醇提取物；乙醇提取物先用净化剂溶解，所述净化剂为将质量分数为1%CaCl2溶液与无水乙醇按体积比1:20混合制得，再用4倍量净化剂的正己烷萃取两次，将正己烷层萃取物蒸干得到干燥物；将干燥物用正己烷配成0.5g/mL溶液，再加入正己烷10倍量的丙酮于-18℃下沉淀两次，每次沉淀12h；离心收取沉淀物，将沉淀物干燥获得总磷脂；在磷脂标准品的指导下，用200-300目的硅胶柱色谱对总磷脂进行分离，洗脱溶剂为CH2Cl2：MeOH，体积比为1：（0-1），得到神经鞘磷脂；
所述海洋生物样品为南美白对虾的虾头。
3.海洋磷脂作为有效成分在制备预防和/或治疗心脏疾病药物中的应用，所述海洋磷脂为磷脂酰乙醇胺和神经鞘磷脂，不含有磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸；
所述心脏疾病为心力衰竭、心率失常、心脏血栓；
所述海洋磷脂的制备方法，包括如下步骤：将海洋生物样品匀浆破碎，加入样品8倍量体积的浓度为95%乙醇，搅拌提取2次，每次6小时，混合两次乙醇提取液，用旋转蒸发仪蒸干乙醇提取物；乙醇提取物先用净化剂溶解，所述净化剂为将质量分数为1%CaCl2溶液与无水乙醇按体积比1:20混合制得，再用4倍量净化剂的正己烷萃取两次，将正己烷层萃取物蒸干得到干燥物；将干燥物用正己烷配成0.5g/mL溶液，再加入正己烷10倍量的丙酮于-18℃下沉淀两次，每次沉淀12h；离心收取沉淀物，将沉淀物干燥获得总磷脂；在磷脂标准品的指导下，用200-300目的硅胶柱色谱对总磷脂进行分离，洗脱溶剂为CH2Cl2：MeOH，体积比为1：（0-1），分别得到磷脂酰乙醇胺、神经鞘磷脂；
所述海洋生物样品为南美白对虾的虾头。
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