CN112494430A - 药物组合物的制备方法及药物组合物 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种制备药物组合物的方法，该方法包括在溶剂中提供在25℃下在水中的溶解度为1mg/ml或更低的药物化合物，所述溶剂能够使所述药物化合物至少部分地溶解在所述溶剂中，提供纳米结构化的纤维素的水性分散体，以及在反溶剂过程中将所述药物化合物与所述纳米结构化的纤维素的水性分散体组合，以提供平均直径为50nm或更小的纳米级药物颗粒，从而提供一种药物组合物。本申请还提供了药物组合物，以及药物组合物的用途。

Description

药物组合物的制备方法及药物组合物

技术领域

本申请涉及制备药物组合物的方法，并涉及药物组合物。本申请还提供了用于稳定在水中具有低溶解度的药物化合物的方法。

背景技术

目前，水不溶性药物在销售的药物市场中约占40％。药物的水不溶性在体内引起一系列问题，例如生物利用度低，过量使用药物和药物浪费。期望改善此类药物的溶解和生物利用度。

发明内容

已经发现如何改善水溶性差的药物的溶解度和生物利用度。当将纳米结构化的纤维素用作药物化合物的基质时，其可以稳定该化合物并防止化合物沉淀，从而使化合物保留在分散体中。使用分散体防止或大大降低了药物在重力作用下的团聚、聚集、凝结和/或固定。药物化合物的溶解率增加，这可以增强化合物向靶标的递送。

这使得能够提供用于多种用途的多种类型的药物组合物，例如口服，局部或可注射的组合物。

本申请提供了一种制备药物组合物的方法，该方法包括：

-在溶剂中提供在25℃下在水中的溶解度为1mg/ml或更低的药物化合物，该溶剂能够使该药物化合物至少部分地溶解在其中，

-提供纳米结构化的纤维素的水性分散体，以及

-在反溶剂过程中将药物化合物与纳米结构化的纤维素的水性分散体组合，以提供平均直径为50nm或更小的纳米级药物颗粒，

从而提供一种药物组合物，其水含量优选在92-99.95％(w/w)的范围内。

本申请还提供了用于稳定在水中具有低溶解度的药物化合物的方法。

本申请还提供了药物组合物，其包含在25℃下在水中的溶解度为1mg/ml或更低的药物化合物的纳米级药物颗粒，所述纳米级药物颗粒具有50nm或更小的平均直径，并且位于纳米结构化纤维素基质中，所述药物组合物的水含量优选在92-99.95％(w/w)的范围内。

本申请还提供了所述药物组合物作为药剂的用途，优选用于稳定在25℃下在水中的溶解度为1mg/ml或更低的药物化合物。

本申请还提供了所述药物组合物作为药剂的用途，优选用于增强在25℃下在水中的溶解度为1mg/ml或更低的药物化合物的生物利用度。

本申请还提供了纳米结构化纤维素用于稳定在水中具有低溶解度的药物化合物的用途。

本申请还提供了纳米结构化纤维素用于增强在水中具有低溶解度的药物化合物的生物利用度的用途。

主要实施方式在独立权利要求中限定。在从属权利要求中公开了各种实施方式。除非另有明确说明，否则权利要求书和说明书中记载的实施方式和实施例可以相互自由组合。

不受任何特定理论的束缚，发明人认为纳米结构纤维素的大比表面积和网络结构将为难溶性药物化合物核提供更多的位点，这将防止药物化合物颗粒过度生长并使药物化合物纳米颗粒在水溶液中更稳定。药物化合物之间的相互作用可以是静电吸附和氢键。制备过程有利于纳米化以及最初以较大颗粒形式存在的纳米级药物颗粒分散成许多较小的纳米颗粒，并将它们保持为这种形式，这种形式可以认为是纳米复合形式。

实施方式中使用的纳米结构化的纤维素还提供清除羟基自由基的活性，这有助于保护药物化合物并将其保持为稳定的活性形式。

因此，可以获得提供药物的稳定性、生物利用度和溶解率更好的药物制剂。可以制备新的药物制剂种类，其可以使用新的给药途径、剂量和方案。

所获得的药物组合物可以具有非常高的水含量，最高达99.95％，这使得能够为水溶性差的化合物提供多种不同种类的药物制剂。

附图说明

图1显示了通过反溶剂重结晶过程形成CNC/药物纳米复合物的示意图；

图2显示了柚皮素的化学结构；

图3显示了制备CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的构思；

图4显示了制备CNF/AZI纳米复合物的构思；

图5显示了CNC、原始NG、CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的FTIR谱图；

图6显示了CNC、原始NG、CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的XRD图谱；

图7显示了以下的TEM图像：(a)，(b)通过传统的反溶剂重结晶过程生成的NG颗粒，(c)CNC/NG纳米复合物，(d)CNC/CTAB/NG纳米复合物；

图8显示了原始NG、NG颗粒(传统的反溶剂重结晶过程)，CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的溶解率；

图9显示了原始NG、NG颗粒(传统的反溶剂重结晶过程)、CNC、CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的OH·清除活性；

图10显示了阿奇霉素的化学结构；

图11显示了CNF和CNC在水性体系中的分散性和稳定性：(a)左侧为0.1％CNC，右侧为0.1％CNF，(b)左侧为1.5％CNC(液体)，右侧为1.5％CNF(凝胶)；

图12显示了以下的TEM图像：(a)CNF，条为20μm；(b)CNF，条为0.5μm；(c)CNC，条为0.5μm；

图13显示了CNC和CNF的FTIR谱图；

图14显示了CNC和CNF的XRD图谱；

图15显示了CNF、原始AZI和CNF/AZI纳米复合物的FTIR谱图；

图16显示了AZI和CNF/AZI纳米复合物的XRD图谱；

图17显示了以下的TEM图像：(a)原始AZI，(b)AZI颗粒(反溶剂重结晶过程)，(c)纯CNF，以及(d)CNF/AZI纳米复合物；

图18显示了CNF和CNC的OH·清除率；

图19显示了原始AZI、AZI颗粒(传统的反溶剂重结晶过程)、CNF/AZI和CNC/AZI纳米复合物的溶解率。

具体实施方式

在该说明书中，除非另有特别说明，否则百分数值是基于重量(w/w)。如果给出任何数值范围，则该范围也包括上限值和下限值。开放式术语“包括”还包括封闭式术语“由……组成”作为一种选择。

与难溶性药物有关的主要问题之一是生物利用度非常低，水溶性差的药物通常需要高剂量才能达到治疗性血浆浓度。也并非总是可以使用油基载体。例如，由于高熔点，有些化合物在油中的溶解性也很差，因此它们不适用于脂质类药物的输送。

肠腔中经常会产生药物过饱和，这种过饱和可能在制剂分散和消化过程中逐渐形成。这可能导致药物沉淀。一旦药物化合物以结晶形式沉淀，通常会导致吸收不完全。

药物的溶解度可以定量和定性地来定义。定量溶解度定义为制备饱和溶液所需的溶质颗粒的毫克数。定性溶解度定义为两相混合在一起形成均匀溶液的情况。

引入新方法，例如组合化学和高通量筛选，新开发的活性剂可能具有更高的分子量和增加的亲脂性，从而导致活性剂的水溶性降低。

在某些实例中，活性化合物表现出低溶解度，例如，当活性化合物具有5个或超过5个碳原子，log P值为2或大于2时，或者当化合物的分子量大于500道尔顿时。上面提到的这些实例称为利宾斯基规则(Lipinski rule)，表明活性化合物为非水性或水溶性差的。

溶解度低于1mg/ml的化合物面临重大障碍，通常甚至低于10mg/ml的化合物也存在与溶解相关的配制困难。那些确实进入市场的水溶性差的化合物，由于吸收水平低以及口服递送时食物摄入的影响，往往表现出次优的性能。

生物制药药物分类可以基于识别药物溶解和胃肠道渗透性作为控制药物吸收速率和程度的基本参数。

美国药典(United States Pharmacopeia，USP 23)和BP对溶解度进行了分类，不考虑所使用的溶剂，仅在定量方面进行了分类。

表1.USP和BP溶解度标准。

适用于本发明方法和组合物的药物化合物可归为极微溶和/或几乎不溶，例如每份溶质(药物化合物)需要至少1000份溶剂，例如每份溶质需要至少5000份溶剂或每份溶质需要至少10000份溶剂。也可以适用微溶的化合物。

另一种分类是生物制药分类系统(BCS)，其中药物分类为BCS-1至BCS-IV。BCS是根据溶解度、渗透性和溶出度标准对药物进行分类的科学框架。根据BCS，药物(drugsubstances)分类如下：

·I类：高渗透性和高溶解度

·II类：高渗透性和低溶解度

·III类：低渗透性和高溶解度

·IV类：低渗透性和低溶解度。

适用于本发明方法和组合物的药物化合物可以归为BCS分类的IV类化合物，任选地也可以属于II类化合物。通常，改善属于BCS-IV的药物的参数被认为是非常具有挑战性的任务。

出于分类目的，当最高剂量强度可在pH范围为1至7.5的<250ml水中溶解时，美国监管机构食品与药品管理局(FDA)认为该药物为高可溶性药物。基于质量平衡或与静脉内参考剂量相比，当确定人体吸收程度大于给药剂量的90％时，FDA就认为该药物具有高渗透性。

已经发现，通过使用纳米结构化的纤维素作为基质、赋形剂和/或载体材料，可以形成具有药物化合物的特定的纳米复合物结构，优选在纳米结构化的纤维素基质中包含纳米颗粒形式的药物化合物的纳米复合物。即使使用最初水溶性差和/或生物利用度差的化合物，这些纳米复合物也可以提高药物化合物的溶解率和生物利用度。与相应的未配混药物颗粒相比，在10分钟时的溶解率可以快50％，甚至快90％。结果表明，在10分钟时的溶解率可以为至少50％，至少70％，至少80％或至少85％，以及在120分钟时至少90％，至少95％或甚至至少99％。与具有未配混药物的基质相比，溶解率快50％或更高，甚至快90％或更高。在一个实施方式中，药物化合物在10分钟内从纳米结构化的纤维素基质中溶出的溶解率为50％或更高，例如在10分钟内为50-90％。

本申请提供了稳定药物化合物或增强药物化合物的生物利用度的方法和组合物。更具体地，本申请提供了用于稳定在水中具有低溶解度，优选为1mg/ml或更低的药物化合物的方法，该方法包括用本文所述的方法制备药物组合物以稳定药物化合物。

本申请还提供了用于增强在水中具有低溶解度，优选为1mg/ml或更低的药物化合物的生物利用度的方法，该方法包括用本文所述的方法制备药物组合物。

本申请还提供了纳米结构化的纤维素用于稳定药物化合物的用途。本申请还提供了纳米结构化的纤维素用于增强药物化合物的生物利用度的用途。

本申请提供了一种制备药物组合物或药物产品的方法，该方法包括：

-在溶剂中提供在25℃下在水中的溶解度为1mg/ml或更低的药物化合物，该溶剂能够使该药物化合物至少部分地溶解在其中，

-提供纳米结构化的纤维素的水性分散体，以及

-在反溶剂过程中将药物化合物与纳米结构化的纤维素的水性分散体组合，以提供平均直径为50nm或更小的纳米级药物颗粒，

从而提供药物组合物。

本申请还提供了用所述方法获得的药物组合物或药物产品。药物产品是独立的产品，其可以以即用形式提供，例如被包装，并入载体或赋形剂中，和/或以其他形式准备以备使用。方法的中间产品不包括在定义中。

产品可以为水含量在92-99.95％(w/w)范围内的形式，这是非常高的水含量，因此获得的组合物或产品适用于不同的给药类型。组合物可以以流动的分散体形式存在，但也可以以水凝胶形式存在。在一个实例中，纳米结构化的纤维素的分散体包括水凝胶。

例如，可注射组合物的水含量可以在92-99.95％(w/w)的范围内，以及/或者纳米结构化的纤维素的含量在0.05-8％(w/w)的范围内。纳米结构化的纤维素的含量可以在1–8％(w/w)的范围内，例如1–7％(w/w)或1–6％(w/w)，尤其是当希望组合物为水凝胶形式时。

在纳米结构化的纤维素主要作为分散剂提供的具体实施方式中，纳米结构化的纤维素的含量可以在0.05-0.5％(w/w)的范围内，例如在0.05-0.4％(w/w)的范围内或在0.1-0.5％(w/w)的范围内，在该范围内不会形成凝胶。在这些情况下，水含量可以在99.4-99.95％(w/w)的范围内，例如99.5-99.95％(w/w)。例如，纳米结构化的纤维素的含量也可以为0.05-1.4％(w/w)，0.1-1.4％(w/w)，0.05-3％(w/w)，0.1-3％(w/w)，0.5-3％(w/w)或1-5％(w/w)。可以根据预期用途选择合适的浓度。该组合物可以包含纳米结构化的纤维素作为组合物中唯一的聚合物材料，并且该组合物可以基本上仅包含药物化合物、纳米结构化的纤维素和水或由它们组成。在一些情况下，可包含优选地对组合物的结构没有影响的少量的本领域常规的添加剂，例如着色剂、防腐剂或类似试剂，优选地，这些添加剂的量小于或等于0.5％(w/w)，例如小于或等于0.2％(w/w)，或者小于或等于0.1％(w/w)。

可以相应地计算或调节水含量，例如通过将纳米原纤纤维素和药物组分以及可能的任何添加剂的百分比求和，其中剩余的可以是水。

药物化合物在水中可以具有低溶解度和/或可以具有低生物利用度。低溶解度可指本文公开的任何低溶解度，例如在25℃下的溶解度为1mg/ml或更低，0.6mg/ml或更低，或者0.3mg/ml或更低。所述药物化合物在25℃下在水中的溶解度可以为0.1mg/ml或更低，这意味着非常低的溶解度，导致在涉及水性环境的大多数应用中出现问题。对于非常难溶的化合物，在25℃下的溶解度甚至可以更低，例如0.05mg/ml或更低，或者0.02mg/ml或更低。溶解度可以通过使用任何合适的方法或标准来确定，例如USP 25，其为转盘法。在许多情况下，化合物的溶解度是通过计算确定的，例如使用ALOGPS软件(例如ALOGPS 2.1)计算的。

水溶性差的药物化合物的实例包括在水中的溶解度为0.214mg/ml(ALOGPS)的柚皮素；在25℃下在水中的溶解度为0.514mg/ml(BCS-II，ALOGPS)的阿奇霉素；瑞格列奈(repaglinide)，其是两性离子药物的例子，具有37mg/l的差水溶性；阿扎那韦(atazenavir)，其作为游离碱几乎不溶于水(<1mg/l)，并且在临床前动物模型中显示出差的口服生物利用度。此外，卡洛芬在水中的溶解度非常低，为0.00379mg/ml(3.79μg/ml)，以及伊曲康唑，其中性pH下的溶解度为1μg/l(0.001μg/ml)。水溶性差和/或生物利用度差的药物的其他例子包括卡马西平，加巴喷丁，莫达非尼，吡罗昔康，咖啡因，喜树碱，长春西汀，非诺贝特，他克莫司，洛匹那韦/利托那韦，纳比隆，尼莫地平，非诺贝特，依曲韦林，卟啉类，米诺地尔，肽类和蒽环类，环孢霉素A，地西泮，棕榈酸地塞米松，依托咪酯，氟比洛芬，前列腺素-E1，丙泊酚，全氟萘烷和全氟三丙胺，维生素A、D、E和K，在胃肠道中产生乳剂或微乳剂的口服产品，如环孢菌素，骨化三醇(Calcitrol)，氨苯吩嗪(Clofazimine)，度骨化醇(Doxercalciferol)，卓那比醇(Dronabionol)，度他雄胺，异维A酸(Isotretionoin)，利托那韦，帕立骨化醇，黄体酮，沙奎那韦，西罗莫司，维甲酸(Tritionoin)，提普那韦，丙戊酸和抗癌药物，例如紫杉醇。

本文描述的药物组合物中可以包含上述的一种或多种和/或其他药物化合物。药物化合物可以包含或可以不包含以下中的一种或多种：抗肿瘤剂，抗癌剂，抗菌剂，例如抗生素、抗病毒剂，抗炎剂，抗过敏剂和镇痛剂(止痛剂)，例如阿片类或非甾体抗炎药和/或本文公开的其他试剂。在一个实例中，药物化合物不是镇痛化合物，尤其是当药物组合物为可注射形式时。药物化合物可以是药剂，即药化合物，但是该术语还可以包括其他适用的生物活性物质或试剂，例如植物来源的生物活性剂，例如黄酮类等。

纳米结构化的纤维素(例如纳米晶体纤维素或纳米原纤纤维素)可用于通过使用反溶剂重结晶工艺(如图1示意性所示)与药物化合物形成纳米复合物结构。

如本文所讨论的可能难溶于水的药物化合物可以最初以粉末形式或颗粒形式提供，例如以干形式提供。药物化合物也可以以溶液或分散体的形式提供，或者可以将干形式形成为溶液或分散体，优选用合适的溶剂来形成溶液或分散体，所述合适的溶剂可以包含水或者可以是水以外的溶剂，例如有机溶剂，或含有有机溶剂的水溶液、分散体或乳液。溶剂可以使药物化合物至少部分地溶解在溶剂中。药物化合物可以在溶剂中提供给该方法。有机溶剂的实例包括甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、1-辛醇、丙二醇、甲苯、丙酮、1,4-二噁烷、乙酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙腈、氯仿、正己烷、环己烷、二甲基亚砜(DMSO)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、二甲基甲酰胺(DFM)及其混合物。溶剂可以是例如乙醇，例如无水乙醇。可以根据所使用的化合物，例如根据化合物的溶解度来选择溶剂。乙醇，尤其是无水乙醇可能是大多数化合物的合适溶剂。获得了通常为药物的药物化合物在溶剂中的溶液。

反溶剂重结晶过程涉及添加反溶剂以产生过饱和。在没有合适载体的情况下，例如，如果溶剂中的药物与水合并，则药物颗粒将聚集，形成可溶性差的形式，该形式的生物利用度通常也很差。然而，在本发明的情况下，该过程可以被控制并且获得纳米尺寸的药物颗粒，其在最终产品中表现出改善的稳定性和生物利用度。当本文所述的纳米结构化的纤维素作为载体来提供时，形成并维持药物-纳米结构化的纤维素的纳米复合物。发现该药物在该结构中没有沉淀和/或聚集，而是被有效地稳定和释放，使得具有良好的生物利用度。此类纳米复合物可用作用于不同给药方式的药物组合物和剂型。在图3中使用柚皮素作为示例性药物化合物描述了该过程，在图4中使用阿奇霉素作为示例性药物化合物描述了该过程。图3的过程使用CNC作为载体，图4的过程使用CNF作为载体。

在该方法中，如实施例中所述，在反溶剂过程中，将合适溶剂中的药物化合物加入纳米结构化的纤维素中。获得该化合物的过饱和浓度。纳米结构化的纤维素的水性分散体用作反溶剂。在该过程中，药物化合物以过饱和的浓度形成核，然后继续生长为平均直径等于或小于50nm，例如等于或小于40nm，等于或小于30nm，或者等于或小于20nm的纳米颗粒。更特别地，纳米颗粒是在成核过程中获得的。所获得的纳米颗粒不以聚集体形式存在，而是分开的。药物化合物以非晶态而不是高度结晶形式存在于纳米颗粒中。纳米颗粒的尺寸和形状可以从最终产物中进行显微检测，例如通过使用电子显微镜进行检测，例如如图7、12和17所示。

溶剂中的药物化合物可以与纳米结构化的纤维素的水性分散体以混合的方式组合，例如通过使用混合器、搅拌器、分散器、均化器等装置来进行混合，所述装置也可以用于处理纳米结构化的纤维素。

在一个实施方式中，纳米结构化的纤维素包括纳米原纤纤维素，其平均原纤直径可以为200nm或更小，例如在1-200nm的范围内。

在一个实施方式中，纳米原纤纤维素当分散在水中时提供在1000–100000Pa·s范围内、例如在5000-50000Pa·s范围内的零剪切粘度，和在1–50Pa范围内、例如在3–15Pa范围内的屈服应力，这些测量结果是通过使用旋转流变仪在22℃±1℃下，稠度为0.5重量％(w/w)的条件下在水性介质中确定的。

在一个实施方式中，纳米结构化的纤维素包括纳米晶体纤维素。纳米晶体纤维素的平均原纤直径可以在2-40nm的范围内，例如2-20nm，平均原纤长度是100nm或更长，最高达几微米，例如在100-400nm的范围内。通常，10％或更少的材料具有小于5μm的粒度。可以通过酸水解由纤维素制备纳米晶体纤维素，所述酸水解去除无定形区域以获得纤维素的晶体区域。因此，纳米晶体纤维素实际上由晶体纤维素组成，并且其缺乏纤维素的无定形区域。另一方面，纳米原纤纤维素包括作为直段的结晶部分和无定形部分，其在原纤中产生扭结。即使两种纳米结构化的纤维素材料都具有共同的特征和特性，但由于结构上的差异，两种材料也可能表现出某些不同的特性。

已发现在纳米结构化的纤维素分散体中，难溶性药物化合物也可以得到稳定，并且其生物利用度可以提高，即使在稀分散体中(每100μl分散体/组合物中最高达1％(w/w)或最高达1mg药物化合物的量)也如此。

药物化合物的含量可以为每100μl药物组合物具有0.05–1mg的药物化合物。在一个实例中，药物化合物的含量为每100μl药物组合物具有0.1-0.7mg的药物化合物，例如每100μl药物组合物具有0.1-0.5mg的药物化合物。

药物化合物的含量可以为药物组合物的0.05-1％(w/w)，例如0.1-1％(w/w)。在一个实例中，药物化合物的含量在0.1-0.7％(w/w)的范围内，例如在0.1-0.5％(w/w)的范围内。

药物组合物可以作为药物产品或药物制剂提供，其可以分散体或水凝胶的形式存在。在一个实例中，该方法包括冷冻干燥所获得的药物组合物。

该方法可以包括将获得的药物组合物包装到小瓶、胶囊或注射器中。该药物组合物可以例如以口服剂型、栓剂、敷料、可注射剂型或植入物的形式或作为其一部分来提供或存在。

可以例如通过包封或以其他方式覆盖纳米结构化的纤维素的水性分散体(优选水凝胶)来提供口服剂型。这可能是必要的，因为纳米结构化的纤维素分散体或水凝胶可能不能以其原样来提供或使用的形式存在。然而，可以提供凝胶或分散体形式的药物组合物，其可以通过使用施用器来口服给药，所述施用器诸如注射器，包装，例如可撕包装，其可以由塑料、纸或其层压材料的膜、片或其他挠性结构形成。

封装是指用于将药物包封在称为胶囊的相对稳定的壳中的一系列剂型和技术，例如允许其口服或用作栓剂。胶囊的两种主要类型包括硬壳胶囊和软壳胶囊。硬壳胶囊通常含有干燥的粉状成分或通过例如挤出或滚圆过程制造的小丸。它们分为两部分：较小直径的“主体”被填充，然后使用较大直径的“盖”密封。软壳胶囊主要用于油和溶解或悬浮在油中的活性成分。本发明的组合物可以包括在两种类型的胶囊中。

两种形式的胶囊都可以由胶凝剂的水溶液制成，胶凝剂例如动物蛋白，例如明胶，或植物多糖或其衍生物，例如角叉菜胶以及改性形式的淀粉和纤维素。可以将其他成分添加到胶凝剂溶液中，包括降低胶囊硬度的增塑剂(例如甘油或山梨糖醇)，着色剂，防腐剂，崩解剂，润滑剂和表面处理。

纳米原纤纤维素

用于形成水凝胶的起始材料可以是纳米原纤纤维素，也称为纳米纤维素，其是指分离的纤维素原纤或衍生自纤维素原料的原纤束。纳米原纤纤维素是基于自然界中丰富的天然聚合物。纳米原纤纤维素具有在水中形成粘性水凝胶的能力。纳米原纤纤维素的生产技术可以基于使纤维原料崩解，例如研磨纸浆纤维的水性分散体以获得纳米原纤化的纤维素。在研磨或均质化过程后，得到的纳米原纤纤维素材料是稀的粘弹性水凝胶。

由于崩解条件，所获得的材料通常以相对低的浓度均匀地分布在水中的形式存在。起始材料可以是浓度为0.2-10％(w/w)，例如0.2–5％(w/w)的水性凝胶。纳米原纤纤维素可以直接由纤维原料的崩解获得。市售的纳米原纤纤维素水凝胶的一个例子是UPM的

由于其纳米级结构，纳米原纤纤维素具有独特的性质，该性质使得常规非纳米原纤纤维素无法提供的功能成为可能。可以制备表现出与常规产品或使用常规纤维素材料的产品的性能不同的材料和产品。然而，由于纳米级结构，纳米原纤纤维素也是具有挑战性的材料。例如，纳米原纤纤维素的脱水或处理可能是困难的。

纳米原纤纤维素可以由植物来源的纤维素原料制备，或者也可以源自某些细菌发酵过程。纳米原纤纤维素优选由植物材料制备。该原料可以基于含纤维素的任何植物材料。在一个例子中，原纤是从非薄壁(non-parenchymal)植物材料获得的。在这种情况下，原纤可以从次生细胞壁获得。这种纤维素原纤的一种丰富来源是木纤维。纳米原纤纤维素可以通过对来自木材的纤维原料进行均质化制得，所述纤维原料可以是化学浆。纤维素纤维崩解以产生平均直径仅为数纳米的原纤，在大多数情况下该平均直径可以为200nm或更小，得到在水中的原纤分散体。来源于次生细胞壁的原纤基本为晶体，其结晶度至少为55％。这种原纤可以具有与源自初生细胞壁的原纤不同的性质，例如源自次生细胞壁的原纤的脱水可能更具挑战性。通常，在来自初生细胞壁的纤维素来源中，例如在甜菜、马铃薯块茎和香蕉轴(banana rachis)来源中，微原纤比来自木材的原纤更容易从纤维基质中释放出来，并且崩解所需的能量更少。然而，这些材料仍然有些不均匀，并且由大的原纤束组成。

非木材材料可以来自农业残留物、草或其他植物物质，例如从棉花、玉米、小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、亚麻、大麻、马尼拉麻、剑麻、黄麻、苎麻、洋麻、西沙尔麻落麻(bagasse)、竹或芦苇得到的秸秆、叶子、皮、种子、壳、花、蔬菜或果实。纤维素原料还可以源自产生纤维素的微生物。微生物可以是醋酸杆菌属(Acetobacter)，农杆菌属(Agrobacterium)，根瘤菌属(Rhizobium)，假单胞菌属(Pseudomonas)或产碱杆菌属(Alcaligenes)，优选是醋酸杆菌属，更优选是木醋杆菌(Acetobacter xylinumor)或巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)。

已经发现，从木纤维素获得的纳米原纤纤维素优选用于本文所述的医学或科学产品。木纤维素可大量获得，并且针对木纤维素开发的制备方法使得能够生产适用于该产品的纳米原纤材料。通过使植物纤维，特别是木纤维原纤化而获得的纳米原纤纤维素在结构上与从微生物获得的纳米原纤纤维素不同，并且具有不同的性质。例如，与细菌纤维素相比，纳米原纤化的木纤维素是均匀且更为多孔和疏松的材料，这在医学应用中是有利的。通常细菌纤维素以原样使用而不会像在植物纤维素中那样进行类似的原纤化，因此在这方面材料也有所不同。细菌纤维素是致密材料，容易形成小球体，因此该材料的结构是不连续的，因此不希望在医学应用中使用这种材料，特别是当需要材料的均质性时。

木材可以来自软木树如云杉、松树、冷杉、落叶松、花旗松或铁杉，或来自硬木树如桦树、白杨、杨树、桤木、桉树、橡树、山毛榉或刺槐，或者来自软木和硬木的混合物。在一个实例中，纳米原纤纤维素从木浆获得。纳米原纤纤维素可以从硬木浆获得。在一个实例中，硬木是桦木。纳米原纤纤维素可以从软木浆获得。在一个实例中，所述木浆是化学浆。化学浆对于本文公开的产品可能是期望的。化学浆是纯材料，可用于多种应用。例如，化学浆缺少机械浆中存在的沥青和树脂酸，并且它无菌程度更高或更容易灭菌。此外，化学浆柔性更高并提供例如在医学和科学材料中的有利性能。例如，可以制备非常均匀的纳米原纤纤维素材料，而无需过度的处理或不需要特定的设备或费力的处理步骤。

包括纤维素原纤和/或原纤束的纳米原纤纤维素的特征在于高的纵横比(长度/直径)。纳米原纤纤维素的平均长度(如原纤或原纤束之类的颗粒的中值长度)可以超过1μm，在大多数情况下为50μm或更小。如果初级原纤彼此没有完全分离，则缠结原纤的平均总长度可以例如在1–100μm，1–50μm或1–20μm的范围内。但是，如果纳米原纤材料高度原纤化，则初级原纤可能完全或几乎完全分离，平均原纤长度更短，例如在1–10μm或1-5μm的范围内。这尤其适用于天然级别的原纤，这些原纤不会例如在化学、酶促或机械作用下变短或消化。但是，强衍生的纳米原纤纤维素的平均原纤长度可以更短，例如在0.3–50μm，例如0.3–20μm，例如0.5–10μm或1–10μm的范围内。特别是变短的原纤，例如酶促消化或化学消化的原纤，或经过机械处理的材料所具有的平均原纤长度可以小于1μm，例如0.1–1μm，0.2–0.8μm或0.4–0.6μm。可以例如使用CRYO-TEM、SEM或AFM图像在显微镜下估计原纤的长度和/或直径。

对于高度原纤化的材料，纳米原纤纤维素的平均直径(宽度)小于1μm，或小于或等于500nm，例如在1-500nm的范围内，但优选小于或等于200nm，甚至小于或等于100nm或者小于或等于50nm，例如，在1–200nm，2–200nm，2–100nm或2–50nm，甚至2–20的范围内。本文公开的直径可以指原纤和/或原纤束的直径。最小的原纤为初级原纤的级别，平均直径通常一般在2-12nm的范围内。初级原纤可能有大约100-200nm长的直段，其后沿着原纤有明显的扭结。这些直段由高度结晶的纤维素域组成，弯曲部位由无定形部分形成。

原纤的尺度和尺寸分布取决于精制方法和效率。在高度精制的天然纳米原纤纤维素的情况中，平均原纤直径(包括原纤束)可以在2–200nm或5–100nm的范围内，例如在10–50nm的范围内。纳米原纤纤维素的特征在于具有大的比表面积和强的形成氢键的能力。在水分散体中，纳米原纤纤维素一般呈现为浅色或混浊的凝胶状材料。根据纤维原料，从植物(特别是木材)获得的纳米原纤纤维素也可含有少量的其它植物成分，特别是木成分，如半纤维素或木质素。其量取决于植物来源。

通常，根据TAPPI W13021，纤维素纳米材料可以分为几类，TAPPI W13021提供了纤维素纳米材料的标准术语。并非所有这些材料都是纳米原纤纤维素。两个主要类别是“纳米物体”和“纳米结构化材料”。纳米结构化材料包括直径为10–12μm且长径比(L/D)<2的“纤维素微晶”(有时称为CMC)，以及直径为10–100nm且长度为0.5–50μm的“纤维素微原纤”。纳米物体包括“纤维素纳米纤维”，其可以分为直径为3-10nm且L/D>5的“纤维素纳米晶体”(CNC)和直径为5–30nm且L/D>50的“纤维素纳米原纤”(CNF或NFC)。

可以基于三个主要特性对不同级别的纳米原纤纤维素进行分类：(i)尺寸分布，长度和/或直径；(ii)化学组成；和(iii)流变性质。这些性质不一定直接相互依赖。为了完整描述级别，可以同时使用这些性质。不同级别的实例包括天然(未化学改性和/或未酶促改性的)NFC、氧化NFC(高粘度)、氧化NFC(低粘度)、羧甲基化NFC和阳离子化NFC。在这些主要级别中，还存在一些子级别，例如：极好的原纤化与中等原纤化，高取代度与低取代度，低粘度与高粘度等。原纤化技术和化学预改性对原纤尺寸分布有影响。通常，非离子级别具有更宽的平均原纤直径(例如在10-100nm或10-50nm的范围内)，而化学改性级别则要细很多(例如在2-20nm的范围内)。改性级别的分布也更窄。某些改性，特别是TEMPO氧化，产生较短的原纤。

取决于原料来源，例如硬木浆与软木浆相比，最终纳米原纤纤维素产品中存在不同的多糖组成。通常，从漂白的桦木浆制备非离子级别，会产生高二甲苯含量(25重量％)。从硬木浆或软木浆制备改性级别。在这些改性级别中，半纤维素也与纤维素结构域一起被改性。该改性很可能是不均匀的，即，一些部分相比其他部分改性程度更高。因此，通常无法进行详细的化学分析，因为改性产物是不同多糖结构的复杂混合物。

在水性环境中，纤维素纳米原纤的分散体形成粘弹性水凝胶网络。该凝胶由分散和水合的缠结原纤在相对低浓度(例如0.05至0.2％(w/w))下就已经形成。NFC水凝胶的粘弹性可用例如动态振荡流变学测量来表征。

纳米原纤纤维素水凝胶表现出特有的流变性质。例如，纳米原纤纤维素水凝胶是剪切稀化或假塑性材料，可以认为是触变行为的特例，这意味着其粘度取决于使材料变形的速度或力。当在旋转流变仪中测量粘度时，观察到以下剪切稀化行为：随着剪切速率增加而粘度降低。水凝胶显示出塑性行为，这意味着在材料开始容易地流动之前需要一定的剪切应力(力)。该临界剪切应力经常被称作屈服应力。屈服应力可由用应力控制流变仪测定的稳态流动曲线确定。当将粘度相对于施加的剪切应力作图时，可看到在超过临界剪切应力后粘度急剧下降。零剪切粘度和屈服应力是描述材料悬浮能力的最重要流变参数。这两个参数非常清楚地区分了不同的级别，从而能对级别进行分类。

原纤或原纤束的尺寸取决于例如原料、崩解方法和崩解运行的次数。可采用任何合适的设备，如精制机、研磨机、分散器、均质机、磨碎机(colloider)、摩擦研磨机、销棒粉碎机(pin mill)、转子-转子解胶机、超声波破碎器、流化器(如微流化器、大流化器(macrofluidizer)或流化器型均质机)来对纤维素原料进行机械崩解。在存在足够的水以防止纤维间形成键的条件下进行崩解处理。本领域技术人员可以在不进行过度实验的情况下，例如通过选择合适的崩解设备，合适的起始材料，合适的化学、物理和/或酶处理，通过次数和/或过程中使用的能量以及所得产物的浓度和化学含量来调整制备具有所需流变性和原纤化度的纳米原纤纤维素的条件。

在一个实例中，通过使用具有至少一个转子、桨叶或类似移动机械构件的分散器进行崩解，所述分散器例如是具有至少两个转子的转子-转子分散器。在分散器中，当桨叶以由半径(到转轴的距离)确定的圆周速度和旋转速度以相反方向旋转时，分散体中的纤维材料被转子的桨叶或拱肋从相反方向反复撞击。由于纤维材料在径向上向外转移，其撞在一个接着一个以高圆周速度从相反方向过来的桨叶(即拱肋)的宽表面上；换而言之，其受到来自相反方向的多次连续冲击。同样，在桨叶的宽表面(即拱肋)的边缘处(其边缘与下一个转子桨叶的相对边缘形成桨叶间隙)，出现剪切力，其有助于纤维的崩解并使原纤脱离。撞击频率取决于转子的旋转速度、转子的数量、各转子中桨叶的数量和分散体通过装置的流速。

在转子-转子分散器中，纤维材料被引入通过反向旋转的转子，并且沿着相对于转子转轴的径向方向向外移动，以这种方式反复受到由不同的反向旋转转子引起的剪切和撞击力，并籍此而同时发生原纤化。转子-转子分散器的一个实例是Atrex设备。

适于崩解的设备的另一实例是销棒粉碎机，例如多重外周销棒粉碎机。该设备的一个示例包括外壳，且在所述外壳内具有装配有碰撞表面的第一转子；与第一转子同心并装配有碰撞表面的第二转子，该第二转子被设置为以与第一转子相反的方向旋转；或与第一转子同心并装配有碰撞表面的定子。该设备包括位于外壳中并向转子或转子和定子的中央开放的进料孔，和在外壳壁上并向最外部转子或定子的外周开放的出料孔。

在一个实例中，崩解通过使用均质机进行。在均质机中，纤维材料在压力的作用下进行均化。纤维材料分散体均化成纳米原纤纤维素是由分散体的强制通流引起的，这使得材料崩解为原纤。纤维材料分散体在给定的压力下通过窄通流间隙，其中，分散体线性速度的增加使分散体受到剪切力和撞击力，导致从纤维材料中移去原纤。纤维片段在原纤化步骤中崩解为原纤。

在本文中，术语"原纤化"一般指通过向颗粒作功(work)来机械崩解纤维材料，其中纤维素原纤从纤维或纤维片段中脱离。该功可基于各种作用，例如研磨、碾碎或剪切、或它们的组合，或者能够降低颗粒尺寸的其他相应的作用。表述“崩解”或“崩解处理”可与“原纤化”互换使用。

经历原纤化的纤维材料分散体是纤维材料和水的混合物，在本文中也被称为“浆(pulp)”。纤维材料分散体一般可指与水混合的整个纤维、从中分离的部分(片段)、原纤束或原纤，并且一般地，水性纤维材料分散体是这类物质的混合物，其中组分之间的比例取决于加工程度或处理阶段，例如取决于同一批次纤维材料通过处理的次数或“道数”。

表征纳米原纤纤维素的一种方式是使用含有所述纳米原纤纤维素的水性溶液的粘度。粘度可以是例如布氏粘度或零剪切粘度。如本文所述，比粘度用来区分纳米原纤纤维素与非纳米原纤纤维素。

在一个实例中，用布氏粘度计(布氏粘度)或者其他对应设备来测量纳米原纤纤维素的表观粘度。合适地，使用桨式转子(vane spindle)(73号)。有几种市售的布氏粘度计可用于测量表观粘度，它们都基于相同的原理。合适地，在设备中使用RVDV弹簧(RVDVspring)(布氏RVDV-III)。用水将纳米原纤纤维素的样品稀释至0.8重量％的浓度，并混合10分钟。稀释的样品物质添加到250mL烧杯中，将温度调节至20℃±1℃，如果需要的话进行加热并混合。使用10rpm的低转速。通常，布氏粘度可以在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm的条件下测量。

例如，在该方法中作为起始材料提供的纳米原纤纤维素可以通过其在水溶液中提供的粘度来表征。粘度描述了例如纳米原纤纤维素的原纤化程度。在一个实例中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供了在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少2000mPa·s，例如至少3000mPa·s的布氏粘度。在一个实例中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供了在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少10000mPa·s的布氏粘度。在一个实例中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供了在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少15000mPa·s的布氏粘度。所述纳米原纤纤维素在分散于水中时在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的布氏粘度范围的实例包括2000–20000mPa·s，3000–20000mPa·s，10000–20000mPa·s，15000–20000mPa·s，2000–25000mPa·s，3000–25000mPa·s，10000–25000mPa·s，15000–25000mPa·s，2000–30000mPa·s，3000–30000mPa·s，10000–30000mPa·s和15000–30000mPa·s。

纳米原纤纤维素还可以通过平均直径(或宽度)、或平均直径与粘度一起来表征，所述粘度例如是布氏粘度或零剪切粘度。在一个实例中，适用于本文所述产品的纳米原纤纤维素具有在1-200nm或1-100nm范围内的平均原纤直径。在一个实例中，所述纳米原纤纤维素具有在1-50nm范围内，诸如2-20nm或5-30nm的平均原纤直径。在一个实例中，所述纳米原纤纤维素具有在2-15nm范围内的平均原纤直径，例如在TEMPO氧化的纳米原纤纤维素的情况中便是如此。

可用多种技术，例如通过显微技术来确定原纤的直径。可通过对场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)、透射电子显微镜(TEM)(例如低温透射电子显微镜(cryo-TEM))或原子力显微镜(AFM)获得的图像进行图像分析来测定原纤粗度和宽度分布。通常，AFM和TEM最合适具有窄原纤直径分布的纳米原纤纤维素级别。

根据一个实例，在22℃，用装配有窄间隙叶片几何结构(直径28mm，长度42mm)的应力受控的旋转流变仪(AR-G2，英国TA仪器公司(TA Instruments,UK))，在直径为30mm的圆筒形样品杯中对纳米原纤纤维素分散体的流变粘度进行测量。在将样品装载到流变仪之后，使它们静止5分钟，之后开始测量。用逐渐增加的剪切应力(其与施加的扭矩成比例)来测量稳态粘度，并测量剪切速率(其与角速度成比例)。在达到恒定剪切速率之后或者在2分钟的最大时间之后，记录某一剪切应力下的报道粘度(＝剪切应力/剪切速率)。当超过1000s^-1的剪切速率时，停止测量。该方法可用于确定零剪切粘度。

在另一个实例中，水凝胶样品的流变学测量是用配备有20mm板几何结构的应力控制旋转流变仪(AR-G2，英国TA仪器公司)进行的。将样品以1mm的间隙装载到流变仪之后，不稀释，使它们静置5分钟，然后开始测量。在25℃，10rad/s频率和2％应变下，以0.001–100Pa范围内逐渐增加的剪切应力来测量应力扫描粘度。可以确定储能模量、损耗模量和屈服应力/断裂强度。

已经发现在注射后水凝胶保持其形状需要最低的粘度水平。这可通过储能模量为350Pa或更高，屈服应力/断裂强度为25Pa或更高来表征，这是在25℃，10rad/s频率和2％应变下，以0.001–100Pa范围内逐渐增加的剪切应力由应力控制的旋转流变仪测得的。本领域技术人员可以选择合适的制备方法和参数以获得这些特征，即使当使用不同类型的起始材料，例如化学改性或未改性的纤维素时也如此。

纳米原纤纤维素应具有足够的原纤化程度，以便获得所需的性质和效果。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素的平均原纤直径为1-200nm，和/或当分散在水中时，纳米原纤纤维素或药物组合物提供350Pa或更高的储能模量，例如在350-5000Pa的范围内，或优选为350-1000Pa，并且屈服应力为25Pa或更高，例如在25-300Pa的范围内，优选为25-75Pa，这是在25℃，10rad/s频率和2％应变下，以0.001–100Pa范围内逐渐增加的剪切应力由应力控制的旋转流变仪确定的。

在一个实例中，纳米原纤纤维素(例如作为方法中的起始材料提供的)当分散在水中时提供在1000–100000Pa·s范围内、例如在5000–50000Pa·s范围内的零剪切粘度(在小剪切应力下具有恒定粘度的“平台”)，和在1–50Pa范围内、例如在3–15Pa范围内的屈服应力(剪切稀化开始时的剪切应力)，这些测量结果是通过旋转流变仪在22℃±1℃，0.5重量％(w/w)的稠度条件下在水性介质中确定的。这种纳米原纤纤维素还可以具有200nm或更小的平均原纤直径，例如在1-200nm的范围内。

浊度是通常为肉眼不可见的个体颗粒(所有的悬浮或溶解固体)导致的流体的混浊或模糊。有几种测量浊度的实用方式，最直接的是测量光穿过水样柱时的衰减(即，强度的降低)。可以替代使用的杰克逊蜡烛法(单位：杰克逊浊度单位或JTU)本质上是反过来测量完全遮蔽穿过水柱所见的蜡烛火焰所需的水柱长度。

可以采用光学浊度测量仪器来定量测定浊度。存在一些市售用于定量测量浊度的浊度计。在本发明中，采用基于比浊法的方法。来自校准比浊计的浊度单位称作比浊法浊度单位(NTU)。用标准校准样品对测量设备(浊度计)进行校准和控制，然后对经稀释的NFC样品的浊度进行测量。

在一种浊度测量方法中，将纳米原纤纤维素样品在水中稀释至低于所述纳米原纤纤维素的胶凝点的浓度，测量稀释样品的浊度。测量纳米原纤纤维素样品的浊度时的所述浓度为0.1％。采用具有50ml测量容器的HACH P2100浊度计(Turbidometer)来进行浊度测量。确定纳米原纤纤维素样品的干物质，将0.5g样品(以干物质计算)装载到测量容器中，其用自来水填充至500g，并通过振荡剧烈混合约30秒。立即将水性混合物分入5个测量容器中，将它们插入浊度计中。对每个容器进行3次测量。从所获得的结果计算平均值和标准偏差，最终结果单位为NTU单位。

表征纳米原纤纤维素的一种方式是既限定粘度又限定浊度。低浊度表示原纤的小尺寸，例如小直径，因为小原纤对光的散射很差。一般而言，随着原纤化程度增加，粘度增加并且同时浊度降低。然而，这种情况在达到某个点后就不发生了。当进一步继续原纤化时，原纤最终开始破裂并且不能再形成牢固的网络。因此，在此点之后，浊度和粘度都开始下降。

在一个实例中，阴离子纳米原纤纤维素的浊度低于90NTU，例如3-90NTU，诸如5-60NTU，例如8-40NTU，这些数值是通过比浊法在0.1％(w/w)稠度下在水性介质中测得。在一个实例中，天然纳米原纤的浊度甚至可以高于200NTU，例如10-220NTU，诸如20-200NTU，例如50–200NTU，这些数值是通过比浊法在20℃±1℃，0.1％(w/w)稠度条件下在水性介质中测得。为了表征纳米原纤纤维素，这些范围可以与纳米原纤纤维素的粘度范围如零剪切粘度，储能模量和/或屈服应力结合。

纳米原纤纤维素可以是未改性的纳米原纤纤维素或包含未改性的纳米原纤纤维素。未改性的纳米原纤纤维素的排液明显比例如阴离子级别更快。未改性的纳米原纤纤维素通常具有在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的2000–10000mPa·s范围内的布氏粘度。纳米原纤纤维素优选具有合适的羧酸含量，例如在0.6-1.4毫摩尔COOH/克的范围内，例如在0.7-1.2毫摩尔COOH/克的范围内，或在0.7-1.0毫摩尔COOH/克的范围内，或在0.8–1.2毫摩尔COOH/克的范围内，该羧酸含量通过电导滴定法测定。

崩解的纤维类纤维素原料可以是改性的纤维原料。改性的纤维原料是指纤维受处理影响从而使纤维素纳米原纤更易于从纤维上脱离的原料。通常对液体中悬浮物(即浆料)形式存在的纤维类纤维素原料进行改性。

对纤维的改性处理可以是化学、酶促或物理改性处理。在化学改性中，纤维素分子的化学结构通过化学反应(纤维素的“衍生化”)改变，优选使纤维素分子的长度不受影响但将官能团添加至聚合物的β-D-吡喃葡萄糖单元。纤维素的化学改性以某一转化度发生，该转化度取决于反应物的剂量和反应条件，原则上化学改性不完全，这样纤维素将保持为原纤的固体形式并且不溶于水。在物理改性中，阴离子型、阳离子型或非离子型物质或其任意组合物理性地吸附在纤维素表面上。

改性后，纤维中的纤维素尤其可以带离子电荷。纤维素的离子电荷削弱了纤维的内部键，随后将促进其崩解为纳米原纤纤维素。可以通过对纤维素进行化学或物理改性来获得离子电荷。与起始原料相比，改性后的纤维可以具有更高的阴离子或阳离子电荷。用于形成阴离子电荷的最常用化学改性方法是氧化(其中羟基被氧化为醛基和羧基)，磺化和羧甲基化。可能需要化学改性引入基团，例如羧基，其可以参与纳米原纤纤维素和生物活性分子之间共价键的形成。进而，可以通过使阳离子基团(例如季铵基团)连接至纤维素来进行阳离子化，从而以化学方式产生阳离子电荷。

纳米原纤纤维素可包括化学改性的纳米原纤纤维素，例如阴离子改性的纳米原纤纤维素或阳离子改性的纳米原纤纤维素。在一个实例中，纳米原纤纤维素是阴离子改性的纳米原纤纤维素。在一个实例中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是氧化的纳米原纤纤维素。在一个实例中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是磺化的纳米原纤纤维素。在一个实例中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是羧甲基化的纳米原纤纤维素。通过纤维素的阴离子改性获得的材料可以称为阴离子纤维素，其是指与未改性的材料相比，通过改性增加了阴离子基团(例如羧基)的量或比例的材料。作为羧基的替代或者补充，还可以将其他阴离子基团引入纤维素，例如磷酸根基团或硫酸根基团。这些基团的含量可以在与本文关于羧酸公开的范围相同的范围内。

纤维素可以被氧化。在纤维素的氧化中，纤维素的伯羟基可以通过杂环硝酰基化合物，例如通过N-氧基介导的催化氧化(例如2,2,6,6-四甲基哌啶基-1-氧基自由基，通常称为“TEMPO”)进行催化氧化。纤维素β-D-吡喃葡萄糖单元的伯羟基基团(C6-羟基基团)被选择性地氧化为羧酸基团。还从伯羟基形成一些醛基。关于发现低的氧化程度不能实现足够有效的原纤化而较高的氧化程度在机械破坏处理之后引起纤维素的降解，纤维素可氧化到一定的水平，即通过电导滴定测定的氧化纤维素中的羧酸含量为0.5–2.0毫摩尔COOH/克浆料，或0.6–1.4毫摩尔COOH/克浆料，或0.8–1.2毫摩尔COOH/克浆料，优选1.0–1.2毫摩尔COOH/克浆料。当由此得到的氧化的纤维素的纤维在水中崩解时，它们提供个体化纤维素原纤的稳定透明分散体，该个体化纤维素原纤的宽度可以例如为3-5nm。当氧化的浆料作为起始介质时，可以得到在0.8％(w/w)稠度下测得的布氏粘度至少为10000mPa·s、例如在10000–30000mPa·s范围内的纳米原纤纤维素。

在本公开中无论何时提及催化剂“TEMPO”，很明显所有涉及“TEMPO”的测量和操作都等同地或者类似地适用于TEMPO的任意衍生物或者能够选择性催化纤维素中C6碳的羟基基团的氧化的任意杂环硝酰基自由基。

本文公开的纳米原纤纤维素的改性也可以应用于本文描述的其他原纤纤维素级别。例如，高度精制的纤维素或微原纤纤维素也可以被类似地化学改性或酶改性。但是，例如，材料的最终原纤化程度存在差异。

在一个实例中，这些化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少10000mPa·s的布氏粘度。在一个实例中，这些化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少15000mPa·s的布氏粘度。在一个实例中，这些化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少18000mPa·s的布氏粘度。所用的阴离子纳米原纤纤维素的例子的布氏粘度在13000–15000mPa·s或18000–20000mPa·s的范围内，或甚至最高达25000mPa·s，这取决于原纤化的程度。

在一个实例中，纳米原纤纤维素是TEMPO氧化的纳米原纤纤维素。该材料在低浓度下提供高粘度，例如在20℃±1℃，0.8％(w/w)稠度和10rpm条件下测得的至少20000mPa·s、甚至至少25000mPa·s的布氏粘度。在一个实例中，TEMPO氧化的纳米原纤纤维素在20℃±1℃，0.8％(w/w)稠度和10rpm条件下测得的布氏粘度在20000–30000mPa·s的范围内，例如25000–30000mPa·s。

在一个实例中，纳米原纤纤维素包含未化学改性的纳米原纤纤维素。在一个实例中，这种未化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少2000mPa·s，或至少3000mPa·s的布氏粘度。

用于增强制造工艺或者改进或调节产品性质的助剂可包含在纳米原纤纤维素分散体中。这些助剂可以溶于分散体的液相中，它们可以形成乳液或者它们可以是固体。助剂可以在制造纳米原纤纤维素分散体的过程中已经添加到原料中，或者添加到形成的纳米原纤纤维素分散体或凝胶中。助剂也可以添加到最终产品中，例如通过浸渍、喷洒、浸没、浸泡等方法添加到最终产品中。助剂通常不与纳米原纤纤维素共价结合，因此它们可以从纳米纤维素基质中释放出来。当使用NFC作为基质时，可以控释和/或缓释这些试剂。助剂的实例包括治疗剂(药剂)和影响产品性质或活性剂性质的其它试剂，例如缓冲剂、表面活性剂、增塑剂、乳化剂等。在一个实例中，分散体含有一种或多种盐，其可以加入以增强最终产品的性质或促进在制造过程中从产品中除去水。盐的例子包括氯化物盐，例如氯化钠、氯化钙和氯化钾。盐的含量可以为分散体中干物质的0.01-1.0％(w/w)。也可将最终产品浸入或浸泡在氯化钠溶液中，例如浸入或浸泡在约0.9％的氯化钠水溶液中。最终产品中所需的盐含量可以是湿产品体积的0.5-1％，例如约0.9％。可以提供盐、缓冲剂和类似试剂以获得生理条件。

可以包括多价阳离子以获得纳米原纤纤维素的非共价交联。一个实例提供了一种纳米原纤纤维素产品，其包含纳米原纤纤维素，特别是包含阴离子改性的纳米原纤纤维素，以及多价阳离子，例如多价金属阳离子，例如选自钙、钡、镁、锌、铝、金、铂和钛的阳离子，其中所述纳米原纤纤维素被所述多价阳离子交联。特别是钡和钙可能在生物医学应用中有用，并且特别是钡可以用于标记并可以用于检测注入的水凝胶。从水凝胶的干含量计算，多价阳离子的量可以在0.1–3％(w/w)的范围内，例如0.1–2％(w/w)。

一个实例提供了一种制备这种水凝胶的方法，该方法包括提供浆料，使浆料崩解直至获得纳米原纤纤维素，将纳米原纤纤维素形成为水凝胶。

可以将纳米原纤纤维素原纤化到所需的原纤化程度，并调节至所需的水含量，或进行其他改性，以使其形成具有如本文所述的所需性质的凝胶。在一个实例中，水凝胶中的纳米原纤纤维素是阴离子改性的纳米原纤纤维素。

用作医用或科学水凝胶的水凝胶需要是均匀的。因此，制备水凝胶的方法可以包括使包含纳米原纤纤维素的水凝胶均质化，优选用均质化装置如本文所述的那些进行均质化。利用这种优选的非原纤化均质化步骤，可以从凝胶中除去不连续区域。获得具有用于应用的更好性质的均匀凝胶。水凝胶可以进一步灭菌，例如通过使用加热和/或辐射，和/或通过添加灭菌剂，例如抗微生物剂来进行灭菌。

组合物的使用

本文公开的在纳米结构化的纤维素水凝胶中包含药物化合物的组合物可以以多种方法使用，所述方法包括向对象(例如人或动物对象)递送、注射、植入和/或以其他方式给予该组合物。对象可以是患者，特别是需要治疗的患者，所述治疗涉及组合物中包含的药物化合物。可能有必要识别或检测需要处理的对象。药物靶向(例如注射)的对象中可能有特定的靶标。所述方法包括以合适的形式(例如以可注射形式或可植入形式)提供在纳米原纤纤维素水凝胶中包含药物化合物的组合物。还可以提供口服剂型，例如封装在可生物降解的胶囊如软胶囊中。处理可以是治疗性处理，可以包括一种或多种药物化合物的持续给药，例如缓释或控释给药。类似地，待给予的药物制剂可以是持续释放的组合物或剂型，例如缓释或控释组合物或剂型。处理可以包括任何合适的治疗性处理，例如长期处理，或用一种或多种其他合适的药物化合物进行处理。所述药物组合物可以被提供用作处理对象的药剂，通常通过合适的途径和/或通过合适的给药方式，通过给药给对象来提供。

一个实例提供了所述药物组合物作为药剂以用于稳定25℃下在水中的溶解度为1mg/ml或更低的药物化合物的用途，例如在储存期间和/或当施用于对象时起到稳定作用。

一个实例提供了所述药物组合物作为药剂用于增强25℃下在水中的溶解度为1mg/ml或更低的药物化合物的生物利用度的用途，例如在施用于对象时起到增强作用。

一个实例提供了一种用于处理需要治疗的对象的方法，该方法包括：

-优选识别需要治疗或处理的对象，

-提供本文公开的在纳米结构化的纤维素水凝胶中包含药物化合物的组合物，和

-将组合物递送或施用于对象。

实施例

在这项研究中，纳米纤维素(纳米晶体纤维素CNC和纳米原纤纤维素NFC)分散体用作柚皮素(NG)和阿奇霉素(Azi)的载体，以提高其溶解率和抗氧化活性。基于CNF/Azi纳米复合物的形成，与原始Azi在水性溶液中的溶解相比，Azi的溶解明显增强。基于CNC载体和反溶剂重结晶工艺成功制备了CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物。

纯CNC由于具有大量的纤维素还原端，因此也具有良好的清除羟基自由基(OH·)的能力。此外，已证实NFC水凝胶可作为非水溶性或有限水溶性药物粉末(卡洛芬或美洛昔康)的基质，防止团聚和聚集。纳米纤维素分散体或水凝胶可以提高疏水性药物在水性体系中的生物利用度。

部分I：纤维素纳米晶体(CNC)作为柚皮素的纳米载体，以增强其溶解度和生物利 用度

1.背景

柚皮素(NG，4,5,7-三羟基黄烷酮，图2)是天然的二氢类黄酮化合物。NG提取自多种天然产物，例如葡萄柚、西红柿、葡萄和柑桔类果实。许多研究已经表明，NG在体内具有多种药理活性，包括自由基清除，抗肿瘤，抗细菌，抗病毒，抗炎，抗过敏和抑制血栓形成。然而，由于NG的水溶性差且脂溶性低，因此其在药物上的应用受到很大限制。

在这项研究中，CNC被用作NG的载体，以提高其溶解度和抗氧化活性。NG首先通过反溶剂重结晶进行纳米化，然后加载到CNC上以形成CNC/NG纳米复合物。此外，CNC涂有十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，以增加其在CNC/CTAB/NG纳米复合物的制备过程中的疏水性。通过傅立叶变换红外(FTIR)光谱，透射电子显微镜(TEM)和X射线衍射(XRD)分析对所得的CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物进行表征。还研究了溶解率和体外抗氧化活性(OH·自由基清除)。

2.研究目的

2.1CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的制备和表征；

2.2评估CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物中的NG在水性体系中的溶解度和抗氧化活性。

3.材料和方法

3.1实验材料和仪器

从纤维素实验公司(Cellulose Lab Inc.，加拿大弗雷德里克顿)以98％的冻干粉末形式获得纤维素纳米晶体(CNC)。柚皮素(NG)是从爱发生物技术有限公司(AifaBiotechnology Co.,Ltd，中国成都)以98％的纯度获得的。

主要实验仪器包括来自新智生物技术有限公司(Xinzhi Biotechnology Co.,Ltd.，中国浙江)的超声细胞破碎机D&DN JY99-IIDN，来自北京普华通用仪器有限公司(Beijing Puhua General Instrument Co.,Ltd.，中国北京)的紫外可见分光光度计TU-1810PC，来自赛默飞世尔公司(Thermo Fisher Company，美国沃尔瑟姆市)的傅里叶变换红外光谱仪Nicolet iS5，来自电子公司(Electronics Corporation，日本东京市)的透射电子显微镜JEM-2010，来自布鲁克公司(Bruker Company，德国卡尔斯鲁厄)的X射线衍射仪Bruker D8 Advance，以及来自马林基督公司(Marin Christ company，德国奥斯特罗德)的冷冻干燥机ALPHA1-2LDPLUS。

3.3实验方法

3.3.1CNC/NG纳米复合物的制备

在室温下和超声分散下，将原始NG粉末溶于无水乙醇中，形成浓度为25μg/ml的溶液。随后，在冰水浴中，在磁力搅拌下，将不同体积的NG乙醇溶液滴加到分散良好的CNC水溶液(60ml和0.2重量％)中，并保持10分钟。最后，将所得的CNC/NG纳米复合物悬浮液冷冻干燥，以备将来使用。

为了进行比较，在相同条件下将不同体积的NG乙醇溶液(25μg/ml)滴加到去离子水(60ml)中，以制备没有CNC的NG颗粒(传统的反溶剂重结晶过程)。

3.3.2CNC/CTAB/NG纳米复合物的制备

通过将某种CTAB粉末溶解在去离子水中来制备浓度为1mmol/l的CTAB溶液。在室温下，在磁力搅拌下，将10ml CTAB溶液滴加到100ml CNC水溶液(0.2重量％)中。将所得的CNC/CTAB混合物加热至60℃，并在摇床中保持30分钟，然后冷却至室温。获得的反应产物形成CTAB改性的CNC沉淀，供随后使用。

在冰水浴中，在剧烈搅拌下，将某种NG乙醇溶液(25μg/ml)滴加到CTAB改性的CNC水性悬浮液(60ml和0.2重量％)中，并保持10分钟。将所得的CNC/CTAB/NG纳米复合物悬浮液冷冻干燥以进一步使用。

3.3.3傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析

分析CNC、原始NG粉末、CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物样品并记录在NicoletiS5 FTIR光谱仪(赛默飞世尔公司，沃尔瑟姆，美国)上，收集在400cm^-1至4000cm^-1范围内的扫描。

3.3.4透射电子显微镜(TEM)观察

用去离子水将CNC、原始NG粉末、CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物样品稀释至0.01重量％，并将一滴稀释的分散体转移到碳涂覆的铜网上。然后将网在室温下风干过夜。使用在200keV的加速电压下操作的JEM 2010(S)TEM仪器(日本)进行TEM观察。

3.3.5X-射线衍射(XRD)分析

在Bruker D8 Advance粉末X射线衍射仪(德国)上获得CNC、原始NG粉末，CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物样品，该仪器在40kV的加速电压下操作，在3°到50°的2θ扫描范围内以每步0.02°/s的速度测量Cu Kα辐射的衍射强度。

3.3.6NG的体外溶解率

(1)标准NG曲线

将原始NG粉末溶解在无水乙醇中，以形成一系列浓度的NG溶液(2.4、3.6、4.8、6.0、7.2和8.4mg/ml)。然后，在290nm的波长下进行紫外(UV)吸收测量以确定NG溶液的浓度，并且可以获得标准NG曲线。

(2)体外溶解率

根据《2015年中国药典》(XC II)的方法确定溶解率。首先，将2mg NG样品置于100ml去离子水中，并在100rpm和37℃下搅拌。然后，在预定的时间(1、5、10、20、40、60、80、100、120分钟)取出5ml每种样品，并通过0.22μm膜过滤，以测量290nm波长下的UV吸收，从而确定NG浓度；同时，立即将5ml去离子水添加到溶解介质中以保持恒定体积。使用等式1计算NG的溶解率：

溶解率(％)＝(C_n×V₂+C₁×V₁+C₂×V₁+…+C_n-1×V₁)×100％/m

(1)

其中C₁、C₂、C_n-1、C_n是预定时间时的NG浓度，mg/ml；m是NG的总输入，mg；V1是固定采样体积，ml；V₂是溶解介质的总体积，ml。

3.3.7体外抗氧化活性

根据水杨酸羟基化方法，通过确定OH·清除活性来评估样品的体外抗氧化活性。在该方法中，使用芬顿(Fenton)反应生成OH·，然后用水杨酸对其进行捕获。该体系由1.8mM硫酸铁(2ml)，1.8mM水杨酸(1.5ml)和1ml样品溶液组成。最后，将0.1ml H₂O₂(0.03重量％)加入到混合物溶液中并开始反应，将混合物在37℃下温育30分钟。温育后，在510nm的波长下测量UV吸收。使用等式2计算OH·清除率：

OH·清除率(％)＝(A₀–A_i)×100％/A₀ (2)

其中A₀是对照的UV吸光度，代表生成的OH·的总量，Ai是样品的UV吸光度。

4.结果和讨论

4.1制备CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的构思

制备CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的流程图如图3所示。在传统的反溶剂重结晶过程中(图3，a)，在不同条件下将NG乙醇溶液滴加到去离子水中。随着反溶剂中NG剂量的增加，NG核在过饱和浓度下形成，然后继续生长为NG纳米颗粒。由于其疏水性，NG纳米颗粒会絮凝并形成NG聚集体，其难以分散在水溶液中。

作为载体，由于其大的表面积和丰富的氢键，CNC为NG核提供了更多的位点，从而形成了更小且均匀的NG纳米颗粒(图3，b)。此外，CNC的优异亲水性使CNC/NG体系非常稳定，从而降低了所得NG纳米颗粒的絮凝和聚集。使用聚合物和表面活性剂作为稳定剂可以抑制/降低疏水性灰黄霉素的颗粒生长，所述聚合物和表面活性剂例如聚(乙烯基吡咯烷酮)，羟丙基甲基纤维素，吐温80和十二烷基硫酸钠。

经过CTAB改性后，由于存在CTAB的长碳链，CNC变得更加疏水并与NG分子具有更好的相容性。通过静电和疏水相互作用将NG纳米颗粒加载到CNC上更容易(图3，c)，这可以进一步降低粒度并提高NG纳米颗粒的稳定性。

4.2CNC/NG纳米复合物制备的优化

4.2.1正交实验的因素和水平

基于先前的实验，发明人发现对于CNC/NG纳米复合物，四个因素对羟基自由基(OH·)的清除率有重要影响，包括pH值，溶剂和反溶剂的体积比，温度和NG浓度。在接下来的工作中，将为正交实验确定这四个因素及其不同水平，如表2所示。

表2正交实验的因素和水平

4.2.2正交实验的结果与分析

L16(4^5)表用于正交实验，OH·清除率用作CNC/NG纳米复合物的评价指标。正交实验的结果及分析如表3所示。

表3正交实验的结果与分析

根据正交实验的结果和分析，B₃A₄D₃C₃的组合是最佳选择，制备CNC/NG的详细条件如下：溶剂/反溶剂体积比为1：20；pH值为10；温度为0℃；NG浓度为10μg/ml。

然而，考虑到pH值10高于人体的正常pH值，根据pH对OH·清除率的影响趋势，将7.0-8.5的pH值用于之后的CNC/NG纳米复合物的制备。

4.3表征

4.3.1FTIR分析

CNC、原始NG、CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的FTIR光谱如图5所示。在3267cm^-1和1600cm^-1处的吸收峰是原始NG的典型峰，分别代表C-H伸缩和C＝O伸缩。CNC显示在3333cm^-1(O-H伸缩)，1060cm^-1(仲羟基)，1030cm^-1(伯羟基)处的典型峰，这与纤维素的特性一致。

相比之下，对于CNC/NG纳米复合物，在3333cm^-1、1060cm^-1和1030cm^-1处的吸收峰增强，表明在CNC与NG之间形成了氢键。此外，在CNC/NG纳米复合物中发现了典型的NG吸收峰。

对于CNC/CTAB/NG纳米复合物，与CNC/NG纳米复合物相比，在1030cm^-1和1060cm^-1处的吸收峰进一步增强，这可归因于CTAB的长烷基链附着到了CNC上。而且，在CNC/CTAB/NG纳米复合物中发现了NG的典型吸收峰，表明NG已成功加载到CNC上。

图5显示了CNC、原始NG、CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的FTIR谱图。

图6显示了CNC、原始NG、CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的XRD图谱。

CNC、原始NG、CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的XRD图谱如图6所示。如图所示，原始NG在2θ＝10.76°，15.92°，17.24°，18.15°，19.90°，20.52°，22.20°，23.80°，24.43°，25.34°和27.71°处显示出强烈的衍射峰，表明NG处于结晶状态。

相比之下，对于CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物，NG的强衍射峰消失了，表明NG从高结晶态转变为非晶态。基于CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的形成，NG的有效纳米化可能是NG晶态转变的原因。

4.3.3TEM分析

可以看出，用传统的反溶剂重结晶方法制得的NG颗粒呈针状，长度为0.8-1.0μm(图7a和b)。

图7显示了以下的TEM图像：(a)，(b)通过传统的反溶剂重结晶过程生成的NG颗粒，(c)CNC/NG纳米复合物，(d)CNC/CTAB/NG纳米复合物。

相比之下，基于CNC/NG纳米复合物的形成，NG颗粒被转化为许多小的纳米颗粒(图7c)。认为，由于其大的表面积和丰富的氢键，CNC为NG核提供了更多的位点，从而形成了更小且均匀的NG纳米颗粒。

此外，基于CNC/CTAB/NG纳米复合物的形成，NG颗粒进一步分散和纳米化(图7d)，这可以归因于CTAB改性后CNC的疏水性增加。由于增加的比表面积，疏水性药物的纳米化可以帮助提高其溶解率和生物利用度。

4.4体外溶解率

4.4.1标准NG曲线

制备了不同浓度的NG乙醇溶液(2.4～8.4μg/ml)，并测量了290nm下的UV吸收。绘制了NG的标准曲线。

显示NG的吸光度与浓度的关系式为Y＝0.00761X-0.0225，R²＝0.9955。NG的浓度与吸光度呈良好的线性关系，可用于确定NG浓度。

4.4.2体外溶解率

原始NG、NG颗粒(传统的反溶剂重结晶过程)、CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的溶解率如图8所示。原始NG的溶解率非常有限，在120分钟时仅为1.87％。NG颗粒(传统的反溶剂重结晶过程)的溶解率增加，在10分钟和120分钟时分别达到25.1％和35.2％。

相比之下，对于CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物，NG的溶解率明显增加。例如，CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物在10分钟时的溶解率分别达到53.6％和78.5％；随后，溶解率缓慢增加，在120分钟时分别达到92.6％和99.5％。溶解率与疏水性药物的生物利用度密切相关。在文献中，许多研究人员报告说，可以通过增加疏水性药物(例如槲皮素和姜黄素)的溶解率来有效提高其生物利用度。

图8显示了原始NG、NG颗粒(传统的反溶剂重结晶过程)、CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的溶解率。

4.5体外羟基自由基(OH·)清除活性

原始NG、NG颗粒(传统的反溶剂重结晶过程)、CNC、CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的OH·清除活性如图9所示。

可以观察到，纯CNC显示出良好的OH·清除效率。例如，在10至50μg/ml的浓度下，OH·清除率从17.1％至21.6％，这可归因于CNC中大量的还原端基。

原始NG的OH·清除率非常低，在浓度为50μg/ml时仅为6.7％，这是由于原始NG的疏水性所致。对于NG颗粒(反溶剂重结晶过程)，OH·清除率增加，当浓度为50μg/ml时达到11.2％。

图9显示了原始NG、NG颗粒(传统的反溶剂重结晶过程)、CNC、CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的OH·清除活性。

相比之下，对于CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物，当浓度为50μg/ml时，OH·清除率分别明显增加到41.2％和52.5％。这些结果表明CNC和CNC/CTAB作为载体可以有效地增强NG的溶解。此外，CNC/CTAB/NG纳米复合物显示出比CNC/NG纳米复合物更好的OH·清除率，这可以归因于CTAB改性的CNC的增强的相容性。

5.结论

5.1基于CNC载体和反溶剂重结晶过程成功制备了CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物。TEM和XRD分析表明，NG被有效地纳米化，良好地分散并且从高结晶态转变为非晶态。

5.2纯CNC由于具有大量的纤维素还原端，因此具有良好的清除羟基自由基(OH·)的能力。

5.3在CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物中，在120分钟时NG的溶解率相比于原始NG(1.87％)分别明显增加到92.6％和99.5％。结果，与原始NG相比，CNC/NG和CNC/CTAB/NG纳米复合物的OH·清除率明显提高。

基于这些实验结果，由于其制备方法简便且生物相容性好，CNC作为载体有望提高NG的生物利用度。

部分II:CNF作为阿奇霉素的纳米载体以增强其溶解度和生物利用度

1.背景

阿奇霉素(AZI，图10)是一种15元环的半合成大环内酯类抗生素，其特征是氮原子插入14元环中形成15元环。AZI对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有大环内酯类的强抗菌活性。在临床上，AZI已被广泛用于治疗呼吸道感染，皮肤和软组织感染以及泌尿和生殖系统感染。但是，像其他水不溶性药物一样，AZI在药学上的主要挑战是由于其疏水性而导致的其在水溶液中的不溶性以及口服生物利用度差。因此，AZI最重要的是增强其在水性体系中的药物释放和生物利用度。

在这项研究中，AZI被选作模型药物，UPM提供的纤维素纳米纤维(CNF)被用作药物载体。通过反溶剂重结晶过程制备CNF/AZI纳米复合物，以提高AZI的溶解度和生物利用度。图10显示了阿奇霉素的化学结构。

2.研究目的

2.1CNF/AZI纳米复合物的制备与表征；

2.2评价CNF/AZI纳米复合物中的AZI在水性体系中的溶解度

3.材料和方法

3.1材料和仪器

纤维素纳米纤维(CNF)以1.5％凝胶的形式从UPM获得。从纤维素实验公司(Cellulose Lab Inc.，加拿大弗雷德里克顿)以98％的冻干粉末形式获得纤维素纳米晶体(CNC)。阿奇霉素是从袁之生物技术有限公司(Yuanzhi Biotechnology Co.,Ltd.，中国南京)获得的，纯度为98％。

主要实验仪器包括来自新智生物技术有限公司(Xinzhi Biotechnology Co.,Ltd.，中国浙江)的超声细胞破碎机D&DN JY99-IIDN，来自北京普华通用仪器有限公司(Beijing Puhua General Instrument Co.,Ltd.，中国北京)的紫外可见分光光度计TU-1810PC，来自赛默飞世尔公司(Thermo Fisher Company，美国沃尔瑟姆市)的傅里叶变换红外光谱仪Nicolet iS5，来自电子公司(Electronics Corporation，日本东京市)的透射电子显微镜JEM-2010，来自布鲁克公司(Bruker Company，德国卡尔斯鲁厄)的X射线衍射仪Bruker D8 Advance，以及来自马林基督公司(Marin Christ company，德国奥斯特罗德)的冷冻干燥机ALPHA1-2LDPLUS。

3.2实验方法

3.2.1CNF/AZI纳米复合物的制备

在室温下和超声分散下，将原始AZI粉末溶于无水乙醇中，形成浓度为200μg/ml的溶液。随后，在冰水浴中，在磁力搅拌下，将3ml AZI乙醇溶液滴加到分散良好的CNF水性溶液(60ml，0.05重量％)中，并保持10分钟。最后，将所得的CNF/AZI纳米复合物悬浮液冷冻干燥，以备将来使用。

为了进行比较，在相同条件下将3ml AZI乙醇溶液(200μg/ml)滴加到去离子水(60ml)中，以制备AZI颗粒(传统的反溶剂重结晶过程)。

3.2.2表征

(1)傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析

在Nicolet iS5 FTIR光谱仪(赛默飞世尔公司，沃尔瑟姆，美国)上分析CNF、原始AZI粉末、CNF/AZI纳米复合物的样品，收集在400cm^-1至4000cm^-1范围中的扫描。

(2)透射电子显微镜(TEM)观察

用去离子水将CNF、原始AZI粉末、CNF/AZI纳米复合物样品稀释至0.01重量％，并将一滴稀释的分散体转移到碳涂覆的铜网上。然后将网在室温下风干过夜。使用在200keV的加速电压下操作的JEM 2010(S)TEM仪器(日本)进行TEM观察。

(3)X-射线衍射(XRD)分析

在Bruker D8 Advance粉末X射线衍射仪(德国)上分析CNF、原始AZI粉末、CNF/AZI纳米复合物样品，该仪器在40kV的加速电压下操作。在3°到50°的2θ扫描范围内以每步0.02°/s的速度测量Cu Kα辐射的衍射强度。

3.2.3体外羟基自由基(OH·)清除活性

根据水杨酸羟基化方法，通过确定OH·清除活性来评估样品的体外抗氧化活性。在该方法中，使用芬顿(Fenton)反应生成OH·，然后用水杨酸对其进行捕获。该体系由1.8mM硫酸铁(2ml)，1.8mM水杨酸(1.5ml)和1ml样品溶液组成。最后，将0.1ml H₂O₂(0.03重量％)加入到混合物溶液中并开始反应，将混合物在37℃下温育30分钟。温育后，在510nm的波长下测量UV吸收。使用等式1计算OH·清除率：

OH·清除率(％)＝(A₀–A_i)×100％/A₀ (1)

其中A₀是对照的UV吸光度，代表生成的OH·的总量，Ai是样品的UV吸光度。

3.2.4AZI的体外溶解率

(1)标准AZI曲线

在室温下和超声分散下，将原始AZI粉末溶于无水乙醇中，形成浓度为2mg/ml的溶液。随后，将盐酸(0.1M)添加到AZI溶液中以形成一系列具有不同浓度(16、32、48、64、80、96μg/ml)的AZI溶液。然后，将5ml的每种AZI样品和5ml的硫酸(73.5％)加入试管中并混合，之后，将所得混合物在室温下保持反应30分钟。最后，在482nm的波长下测量紫外吸收以确定AZI溶液的浓度，并且可绘出标准AZI曲线。

(2)体外溶解率

根据《2015年中国药典》(XC II)的方法确定溶解率。首先，将2mg AZI置于100ml去离子水中，并在100rpm和37℃下搅拌。在预定的时间(1、5、10、30、60、120分钟)取出3ml每种样品，并通过0.45μm膜过滤，得到滤液；同时，立即将3ml去离子水添加到溶解介质中以保持恒定体积。

然后，将2ml硫酸(73.5％)和2ml所得滤液加入试管中以形成混合物，并将混合物保持30分钟。最后，在482nm的波长下测量UV吸收以确定AZI浓度。使用等式2计算AZI的溶解率：

溶解率(％)＝(C_n×V₂+C₁×V₁+C₂×V₁+…+C_n-1×V₁)×100％/m (2)

其中C₁、C₂、C_n-1、C_n是预定时间时的AZI浓度，mg/ml；m是AZI的总输入，mg；V1是固定采样体积，ml；V₂是溶解介质的总体积，ml。

4.结果和讨论

4.1CNF的表征

在这项研究中，对来自UPM研发中心的CNF进行了分析，并将其与CNC进行了比较，包括在水性体系中的分散性和稳定性，FTIR分析，TEM观察和XRD分析。结果如下。

4.1.1CNF在水体系中的分散性和稳定性

如图11a所示，CNF易于以0.1重量％的浓度分散在去离子水中，但是CNF悬浮液的分散度和稳定性低于CNC悬浮液(纤维素实验公司，加拿大弗雷德里克顿，用硫酸水解法生产的)的分散度和稳定性。在图11b中，在1.5重量％的浓度下，CNF变成凝胶并且失去流动性；作为比较，CNC在浓度为1.5重量％时仍显示出良好的流动性和稳定性。

4.1.2CNF的TEM分析

图12a和12b显示，CNF具有典型的纤维素纳米纤维的特征，具有较大的长度和较小的直径(5-50nm)。CNF由于其长度长和柔韧性好而易于形成附聚物。相比之下，CNC是针状的，长度为100-400nm，宽度为5-40nm(图12c)。与CNF相比，CNC的长度较短且刚性强，易于分散以形成稳定的悬浮液。

4.1.3CNF的FTIR分析

对CNF和CNC的FTIR光谱进行了分析和比较，如图13所示。可以看出，CNF和CNC具有相似的化学结构(纤维素结构)。例如，在3333cm^-1，2890cm^-1，1060cm^-1和1030cm^-1处的吸收峰分别归因于O-H伸缩，C-H伸缩，仲羟基和伯羟基。CNF和CNC均由高纯度的原始纤维素纤维制成，因此它们具有相似的FTIR吸收。

4.1.4CNF的XRD分析

对CNF和CNC的XRD图谱进行了分析和比较，如图14所示。如图所示，观察到CNF在2θ＝15.5°，16.5°和22.8°处的弱衍射峰；相比之下，CNC在2θ＝12.5°，14.7°和22.7°处显示出强烈的衍射峰，表明CNC的结晶度高于CNF。据解释，对于CNC，通过酸水解去除了纤维素的无定形区域，并保留了结晶区域；然而，对于CNF，引入了剧烈的机械处理，包括挤出和撕裂，这会严重破坏纤维素的结晶区域。

4.2制备CNF/AZI纳米复合物的构思

图4显示了制备CNF/AZI纳米复合物的构思。在传统的反溶剂重结晶过程中(上侧路径)，将原始AZI溶于溶剂(无水乙醇)中，然后在不同的条件(浓度，体积比，温度和搅拌条件)下，将AZI乙醇溶液滴加到反溶剂(去离子水)中。随着去离子水中AZI剂量的增加，AZI将达到过饱和状态并形成许多AZI核。由于AZI的疏水性，这些AZI核将继续生长，并最终形成AZI纳米颗粒和聚集体，其难以进一步分散在水性溶液中。

当CNF用作载体时(下侧路径)，CNF的大比表面积和网络结构将为AZI核提供更多的位点，这将防止AZI颗粒过度生长并使AZI纳米颗粒在水溶液中更稳定。CNF和AZI之间的相互作用可能是静电吸附和氢键。

4.3CNF/AZI纳米复合物的表征

4.3.1FTIR分析

图15示出了原始AZI、CNF和CNF/AZI纳米复合物的FTIR光谱。结果显示，原始AZI在3486cm^-1，2969cm^-1和1720cm^-1处具有典型的峰，分别代表O-H伸缩，C-H伸缩和C＝O伸缩。在CNF FTIR结果中没有观察到AZI的典型吸收峰。

对于CNF/AZI纳米复合物，可以观察到3486cm^-1(O-H伸缩)，2969cm^-1(C-H伸缩)和1720cm^-1(C＝O伸缩)处的吸收峰，这可以归因于AZI(尽管强度降低)。这些结果表明AZI被成功地加载到CNF上并且AZI的化学结构没有改变。

4.3.2XRD分析

图16示出了CNF和CNF/AZI纳米复合物的XRD图谱。原始AZI在2θ＝8.0°，9.8°，16.9°，18.9°，20.7°，27.3°和42.3°处显示出强烈的衍射峰，表明其处于结晶状态。然而，AZI的特征衍射峰在CNF/AZI纳米复合物中消失了，这表明AZI从高结晶态转变为非晶态。基于CNF/AZI纳米复合物的形成，AZI的纳米化和良好的分散性可以是AZI状态转变的原因。疏水性药物的有效纳米化增强了水溶性和生物利用度。

4.3.3TEM分析

图17显示了原始AZI、CNF和CNF/AZI纳米复合物的TEM图像。条在a)中为2μm，在b)、c)和d)中为0.5μm。图17a示出了原始AZI处于结晶状态并且具有大的粒度(几微米)。通过传统的反溶剂沉淀法制备的AZI颗粒是聚集体(图17b)，由于AZI的疏水性，它们难以进一步分散在水溶液中。

相比之下，基于CNF/AZI纳米复合物的形成，AZI颗粒的聚集体很好地分散成了许多小而均匀的纳米颗粒(图17d)，这可以归因于CNF和AZI颗粒之间的氢键相互作用和静电相互作用。通过反溶剂重结晶方法制得的AZI纳米颗粒可以很容易地吸附到CNF表面上；此外，CNF网络可以帮助减少AZI纳米颗粒的絮凝。

4.4CNF的羟基自由基(OH·)清除活性

本发明人的先前研究表明，CNC具有良好的OH·清除活性。在本文中，研究了CNF的OH·清除活性，并将其与CNC进行比较，如图18所示。

可以看出，在相同条件下，CNF的OH·清除效率要低于CNC。例如，在10至30μg/ml的浓度下，CNF的OH·清除效率为5.6％至6.2％；相比之下，在相同浓度下，CNC的OH·清除效率在18.4％至22.1％的范围内。

可以解释为，纤维素还原端的量的差异导致OH·清除效率的差异。对于CNF，由于其长度较长且纤维横截面较小，因此暴露出的纤维素还原端较少。相比之下，对于CNC，由于其长度短且纤维横截面较大，因此暴露了大量的纤维素还原端。

4.5体外溶解率

4.5.1标准AZI曲线

制备了不同浓度的AZI乙醇溶液(8～48μg/ml)，并测量了482nm下的UV吸收，用于绘制AZI的标准曲线。计算AZI的标准曲线。公式如下：y＝22.996x-0.0821，R²＝0.9991，表明AZI的浓度和吸光度具有良好的线性关系。

4.5.2AZI的体外溶解率

原始AZI、AZI颗粒(传统的反溶剂重结晶过程)、CNC/AZI和CNF/AZI纳米复合物的溶解率如图19所示。可以看出，原始AZI的溶解率非常有限，在120分钟时仅为1.31％。通过反溶解重结晶过程，AZI的溶解率增加，在10分钟和120分钟时分别达到38.8％和52.2％。

相比之下，对于CNF/AZI和CNC/AZI纳米复合物，AZI的溶解率明显增加。例如，在CNF/AZI和CNC/AZI纳米复合物中，AZI在10分钟时的溶解率分别达到80.4％和85.1％；随后，溶解率缓慢增加，在120分钟时分别达到91.2％和96.3％。这些结果表明CNF或CNC作为载体可以有效地增强AZI的溶解。

5.结论

5.1基于CNF载体和反溶剂重结晶过程成功制备了CNF/AZI纳米复合物。TEM和XRD分析表明，AZI被有效地纳米化，良好地分散并且从高结晶态转变为非晶态。

5.2纯CNF的OH·清除效率(6.2％，30μg/ml)低于纯CNC的OH·清除效率(22.1％，30μg/ml)，这是由于在CNF中纤维素还原端的量少。

5.3基于CNF/AZI纳米复合材物的形成，在CNF/AZI纳米复合物中，在120分钟时的AZI溶解率相比于原始AZI(1.31％)明显增加到91.2％。

5.4由于其制备方法简便且生物相容性好，制备的CNF/AZI纳米复合物有望用于提高AZI的生物利用度。

Claims (18)

1.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括：

-在溶剂中提供在25℃下在水中的溶解度为1mg/ml或更低的药物化合物，所述溶剂能够使所述药物化合物至少部分地溶解在所述溶剂中，

-提供纳米结构化的纤维素的水性分散体，以及

-在反溶剂过程中将所述药物化合物与所述纳米结构化的纤维素的水性分散体组合，以提供平均直径为50nm或更小的纳米级药物颗粒，

从而提供一种药物组合物，其水含量优选在92-99.95％(w/w)的范围内。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述纳米结构化的纤维素包含纳米原纤纤维素，所述纳米原纤纤维素具有200nm或更小，例如在1–200nm范围内的平均原纤直径，优选所述纳米原纤纤维素当分散在水中时提供在1000–100000Pa·s范围内、例如在5000-50000Pa·s范围内的零剪切粘度，和在1–50Pa范围内、例如在3–15Pa范围内的屈服应力，这些数值是通过使用旋转流变仪在22℃±1℃下，稠度为0.5％(w/w)的条件下在水性介质中确定的。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述纳米结构化的纤维素包含纳米晶体纤维素，所述纳米晶体纤维素例如具有2-40nm的平均原纤直径，诸如2-20nm，以及具有100nm或更高的平均原纤长度，例如在100-400nm的范围内。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述药物组合物中纳米结构化的纤维素的含量在0.05-8％(w/w)的范围内，例如在0.05-0.5％(w/w)的范围内，或者在1–8％(w/w)的范围内。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述药物化合物在25℃下在水中的溶解度为0.6mg/ml或更低，0.3mg/ml或更低，例如在25℃下为0.1mg/ml或更低，和/或所述药物化合物具有低生物利用度。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，每100μl药物组合物中，所述药物化合物的含量在0.05-1mg的范围内，例如在0.1–0.7mg的范围内，例如在0.1–0.5mg的范围内。

7.一种用于稳定在水中具有1mg/ml或更低的低溶解度的药物化合物的方法，所述方法包括用前述权利要求中任一项所述的方法制备药物组合物。

8.一种药物组合物，其包含在25℃下在水中的溶解度为1mg/ml或更低的药物化合物的纳米级药物颗粒，所述纳米级药物颗粒具有50nm或更小的平均直径，并且位于纳米结构化的纤维素基质中，所述药物组合物的水含量优选在92-99.95％(w/w)的范围内。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其中，所述纳米结构化的纤维素包含纳米原纤纤维素，所述纳米原纤纤维素具有200nm或更小，例如在1–200nm范围内的平均原纤直径，优选所述纳米原纤纤维素当分散在水中时提供在1000–100000Pa·s范围内、例如在5000-50000Pa·s范围内的零剪切粘度，和在1–50Pa范围内、例如在3–15Pa范围内的屈服应力(剪切稀化开始时的剪切应力)，这些数值是通过使用旋转流变仪在22℃±1℃下，稠度为0.5％(w/w)的条件下在水性介质中确定的。

10.如权利要求8所述的药物组合物，其中，所述纳米结构化的纤维素包含纳米晶体纤维素，所述纳米晶体纤维素例如具有2-40nm的平均原纤直径，诸如2-20nm，以及具有100nm或更高的平均原纤长度，例如在100-400nm的范围内。

11.如权利要求8-10中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物中纳米结构化的纤维素的含量在0.05-8％(w/w)的范围内，例如在0.05-0.5％(w/w)的范围内，或者在1–8％(w/w)的范围内。

12.如权利要求8-11中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物化合物在25℃下在水中的溶解度为0.6mg/ml或更低，0.3mg/ml或更低，例如在25℃下为0.1mg/ml或更低，和/或所述药物化合物具有低生物利用度。

13.如权利要求8-12中任一项所述的药物组合物，其中，每100μl药物组合物中，所述药物化合物的含量在0.05-1mg的范围内，例如在0.1–0.7mg的范围内，例如在0.1–0.5mg的范围内。

14.如权利要求8-13中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物化合物在10分钟内从纳米结构化的纤维素基质中溶出的溶解率为50％或更高，例如在10分钟内为50-90％。

15.如权利要求8-14中任一项所述的药物组合物，其通过如权利要求1-7中任一项所述的方法得到。

16.如权利要求8-15中任一项所述的药物组合物，其被包装到小瓶、胶囊或注射器中。

17.如权利要求8-16中任一项所述的药物组合物作为药剂的用途，优选用于增强在25℃下在水中的溶解度为1mg/ml或更低的药物化合物的生物利用度。

18.纳米结构化的纤维素在用于稳定在25℃下在水中的溶解度为1mg/ml或更低的药物化合物中的用途，优选通过如权利要求1-7中任一项所述的方法来进行。

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