KR20210032280A - 약학적 조성물의 제조 방법 및 약학적 조성물 - Google Patents

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황 샹
하이츄 쑹
유룽 왕
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Abstract

본 발명은 약학적 화합물을 일정 부분 이상 용매에 용해할 수 있는 용매 중에 25℃에서 수 용해도가 1 mg/ml 이하인 약학적 화합물을 제공하는 단계, 나노구조형 셀룰로스의 수성 분산물을 제공하는 단계, 및 약학적 조성물을 나노구조형 셀룰로스의 수성 분산물과 반용매 공정으로 조합하여 평균 직경이 50 nm 이하인 나노크기의 약학적 입자를 제공하는 단계를 포함하는, 약학적 조성물을 제조하기 위해 약학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약학적 조성물 및 약학적 조성물의 용도를 제공한다.

Description

약학적 조성물의 제조 방법 및 약학적 조성물 {METHOD FOR PREPARING PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION}
본 발명은 약학적 조성물의 제조 방법, 및 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 수 용해도가 낮은 약학적 화합물의 안정화 방법을 제공한다.
현재, 수-불용성 약물이 시판 중인 약물의 약 40%를 차지하고 있다. 약물의 수-불용성은 낮은 생체이용성, 약물의 과다 사용 및 약물 낭비와 같은 일련의 문제들을 초래한다. 이에 이러한 약물의 용해 및 생체이용성의 개선이 요망되고 있다.
수용성이 좋지 않은 약제의 용해 및 생체이용성을 개선하기 위한 방법들 개발되었다. 나노구조형 셀룰로스 (nanostructured cellulose)를 약학적 화합물의 매트릭스로 사용할 경우, 화합물이 안정화되고, 화합물의 석출이 방지되어, 화합물을 분산물 형태로 유지할 수 있다. 이러한 분산물을 이용해, 약제의 중력에 의한 응결 (agglomeration), 응집 (aggregation), 응고 및/또는 마운팅 (mounting)을 크게 줄일 수 있다. 약학적 화합물의 용해율이 증가하여, 화합물의 타겟 전달을 높일 수 있다.
이는 경구, 국소 또는 주사용 조성물과 같은 다양한 용도로 사용하기 위한 다양한 타입의 약학적 조성물을 제공가능하게 한다.
본 발명은,
- 25℃에서 1 mg/ml 이하의 수 용해도를 가진 약학적 화합물을 약학적 화합물을 일정 부분 이상 용매에 용해시킬 수 있는 용매 중에 제공하는 단계,
- 나노구조형 셀룰로스의 수성 분산물을 제공하는 단계, 및
- 약학적 화합물과 나노구조형 셀룰로스의 수성 분산물을 반용매 (anti-solvent) 공정으로 조합하여, 평균 직경이 50 nm 이하인 나노크기의 약학적 입자를 제공하는 단계를 포함하는,
약학적 조성물, 바람직하게는 수분 함유율이 92-99.95% (w/w) 범위인 약학적 조성물을 제공하기 위한, 약학적 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 수 용해도가 낮은 약학적 화합물의 안정화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 나노구조형 셀룰로스 매트릭스 내에, 25℃에서 수 용해도가 1 mg/ml 이하인 약학적 화합물로 된 나노크기의 약학적 입자를 포함하며, 나노크기의 약학적 입자가 50 nm 이하의 평균 직경을 가지는, 바람직하게는 수분 함유율이 92-99.95% (w/w) 범위인, 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 바람직하게는 25℃에서 수 용해도가 1 mg/ml 이하인 약학적 화합물을 안정화하기 위해 약제로서 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 바람직하게는 25℃에서 수 용해도가 1 mg/ml 이하인 약학적 화합물의 생체이용성을 강화하기 위해 약제로서 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 수 용해도가 낮은 약학적 화합물을 안정화하기 위한 나노구조형 셀룰로스의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 수 용해도가 낮은 약학적 화합물의 생체이용성을 강화하기 위한 나노구조형 셀룰로스의 용도를 제공한다.
주요 구현예들은 독립항으로 특정된다. 다양한 구현예들은 종속항으로 기술된다. 청구항 및 설명에 기술된 구현예들 및 실시예들은 명시적으로 달리 언급되지 않은 한 자유롭게 상호 조합 가능하다.
임의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은, 나노구조형 셀룰로스의 넓은 비표면적과 네트워크 구조가 난용성 약물 화합물 핵 (compound nuclei)에 대해 더 많은 부위 (site)를 제공할 것이며, 이는 약물 화합물 입자의 과다 성장을 방지하여 약물 화합물 나노입자를 수용액에서 더 안정적이게 만들 것이라고, 생각하였다. 약물 화합물들 간의 상호작용은 정전 흡착 (electrostatic adsorption) 및 수소 결합일 수 있다. 본 제조 공정은 처음에 큰 입자로 존재하지만 더 작은 복수의 나노입자로의 나노화 및 나노크기의 약물 입자의 분산을 촉진하고, 나노복합체 형태 (nanocomposite form)로서 간주될 수 있는 상기한 형태로 유지되게 한다.
구현예들에서 사용되는 나노구조형 셀룰로스는 하이드록시 라디칼 소거 활성 (hydroxyl radical scavenging activity)을 또한 제공하여, 약학적 화합물을 보호하고 이것이 안정한 활성 형태로 유지되도록 돕는다.
따라서, 약물의 우수한 안정성, 생체이용성 및 용해율을 제공하는 약물 제형을 수득할 수 있다. 새로운 투여 경로, 용량 및 용법을 이용할 수 있는, 새로운 유형의 약물 제형을 제조할 수 있다.
수득되는 약학적 조성물은 수분 함유율이 최대 99.95%로 매우 높을 수 있으며, 그래서 수 용해도가 좋지 않은 화합물에 대해 다양한 여러가지 유형의 약학적 제형을 제공할 수 있다.
도 1은 반용매 재결정화 공정에 의한 CNC/약물 나노복합체의 제조 공정을 도식적으로 예시한 것이다.
도 2는 나린제닌의 화학 구조를 도시한 것이다.
도 3은 CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 제조 원리를 도시한 것이다.
도 4는 CNF/AZI 나노복합체의 제조 원리를 도시한 것이다.
도 5는 CNC, 오리지널 NG, CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 FTIR 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 6은 CNC, 오리지널 NG, CNC/NG, 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 XRD 패턴을 도시한 것이다.
도 7은 (a), (b) NG 입자 대 전통적인 반용매 재결정화 공정, (c) CNC/NG 나노복합체, (d) CNC/CTAB/NG 나노복합체의 TEM 이미지를 도시한 것이다.
도 8은 오리지널 NG, NG 입자 (전통적인 반용매 재결정화 공정), CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 용해율을 나타낸 것이다.
도 9는 오리지널 NG, NG 입자 (전통적인 반용매 재결정화 공정), CNC, CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 OHㆍ 소거 활성을 나타낸 것이다.
도 10은 아지트로마이신의 화학 구조를 도시한 것이다.
도 11은 수성 시스템 중의 CNF 및 CNC의 분산성 및 안정성을 나타낸 것이다: (a) 좌측 0.1% CNC, 우측 0.1% CNF, (b) 좌측 1.5% CNC (액체), 우측 1.5% CNF (겔).
도 12는 TEM 이미지를 나타낸 것이다: (a) CNF, 막대 20 ㎛; (b) CNF, 막대 0.5 ㎛; (c) CNC, 막대 0.5 ㎛.
도 13은 CNC 및 CNF의 FTIR 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 14는 CNC 및 CNF의 XRD 패턴을 도시한 것이다.
도 15는 CNF, 오리지널 AZI 및 CNF/AZI 나노복합체의 FTIR 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 16은 AZI 및 CNF/AZI 나노복합체의 XRD 패턴을 도시한 것이다.
도 17은 TEM 이미지를 나타낸 것이다: (a) 오리지널 AZI, (b) AZI 입자 (반용매 재결정화 공정), (c) 퓨어 (pure) CNF, 및 (d) CNF/AZI 나노복합체.
도 18은 CNF 및 CNC의 OHㆍ 소거율을 나타낸 것이다.
도 19는 오리지널 AZI, AZI 입자 (전통적인 반용매 재결정화 공정), CNF/AZI 및 CNC/ AZI 나노복합체의 용해율을 나타낸 것이다.
본 명세서에서, % 값은, 구체적으로 달리 명시되지 않은 한, 중량 (w/w)을 기준으로 한다. 임의의 수치 범위가 제공된다면, 범위는 또한 상한 값과 하한 값을 포함한다. 또한, 열린 개념의 용어 "포함한다"는 하나의 옵션으로서 닫힌 개념의 "로 이루어진"을 포함한다.
난용성 약물과 관련된 주된 문제들 중 하나는 매우 낮은 생체이용성이다. 난용성 약물은 치료학적 혈장 농도에 도달하기 위해 종종 고 용량으로 사용되어야 한다. 오일-기반의 담체를 늘 사용가능한 것은 아니다. 예를 들어, 고 융점으로 인해 오일에도 용해되지 않는 일부 화합물들이 존재하므로, 지질-기반의 전달도 원활하게 이용가능한 것은 아니다.
종종 장 내강에서 약물의 과포화가 형성되는데, 이는 제형의 분산 및 소화 과정 중에 발생할 수 있다. 이는 약물 석출로 이어질 수 있다. 약학적 화합물이 결정질 형태로 석출되면, 일반적으로 불완전한 흡수가 이루어질 것이다.
약물 제품의 용해도는 정량적으로 및 정성적으로 정의할 수 있다. 정량적인 용해도는 용액을 포화하기 위해 필요한 용질 입자의 mg으로 정의된다. 정성적인 용해도는 2가지 상을 혼합해 균질한 용액을 형성하는 것으로서 정의된다.
조합 화학 (combinatorial chemistry) 및 고성능 스크리닝과 같은 새로운 방법의 도입으로 새롭게 개발된 활성 물질들은 더욱 높은 분자량과 증가된 친지성을 가질 수 있으며, 따라서 활성 물질의 수 용해도가 떨어질 수 있다.
활성 화합물이 탄소 원자를 5개 미만으로 가지고 log P가 2 이상인 경우, 또는 화합물의 분자량이 500 Da보다 높을 경우와 같이, 활성 화합물의 용해도가 낮은 몇가지 예들이 있다. 이러한 전술한 예들은 활성 화합물을 비-수성 또는 수-난용성 화합물로서 결정하는 리핀스키의 규칙에 따라 참조한다.
용해도가 1 mg/ml 미만인 화합물은 심각한 문제에 직면하며, 종종 용해도가 10 mg/ml 미만인 화합물은 용해와 관련된 제형화에 어려움을 겪게 된다. 시판되는 이러한 수-난용성 화합물은 대개 낮은 흡수율 및 경구 전달시 식품 섭취 효과로 인해 최적에 미치지 못하는 성능을 나타내는 경향을 보인다.
생물약제학 약물 분류는 약물 흡수율 및 수준을 제어하는 기본 파라미터로서 약물 용해 및 위장 투과성을 파악하는 것을 토대로 할 수 있다.
미국 약전 (USP 23) 및 BP에서는 정량화 측면에서 사용 용매와 관계없이 용해도를 분류한다.
표 1. USP 및 BP 용해도 기준.
기술 용어 용질 당 필요한 용매 비율 수중 g/l
매우 잘 용해됨 1 미만 > 1000
잘 용해됨 1 - 10 1000 - 100
용해됨 10 - 30 100 - 33
약간 용해됨 30 - 100 33 - 10
용해되기 어려움 100 - 1000 10 - 1
용해되기 매우 어려움 1000 - 10,000 1 - 0.1
거의 용해되지 않음 10,000 이상 0.1 미만
본 방법 및 조성물에 적합한 약학적 화합물은, 용질 (약학적 화합물) 1부 당 용매 1000부 이상이 필요한, 예를 들어 용질 1부 당 용매 5000부 이상 또는 용질 1부 당 용매 10000부 이상이 필요한 것과 같이, 용해되기 매우 어려움 및/또는 거의 용해되지 않음으로 분류될 수 있다. 또한, 용해되기 어려운 화합물에도 적용될 수 있다.
생물약제학 분류 시스템 (BCS)의 또 다른 분류에서, 약물은 BCS-I 내지 BCS-IV로 분류된다. BCS는 용해성, 투과성 및 용해 기준에 따라 약물 물질을 분류하는 과학적 프래임워크이다. BCS에 따라, 약물 물질은 다음과 같이 분류된다:
- 클래스 I: 고 투과성 및 고 용해성
- 클래스 II: 고 투과성 및 저 용해성
- 클래스 III: 저 투과성 및 고 용해성
- 클래스 IV: 저 투과성 및 저 용해성
본 방법 및 조성물에 적합한 약학적 화합물은 BCS 분류에서 클래스 IV 화합물로서, 선택적으로 또한 클래스 II 화합물로도 분류될 수 있다. 일반적으로, BCS-IV에 속하는 약물의 파라미터의 개선은 것은 매우 어려운 도전 과제로 여겨진다.
분류 목적으로, 미국 식약청 (FDA)에서는, 최고 용량이 pH 1 내지 7.5 범위에서 물 <250 ml에 용해가능한 경우, 고 용해성으로 간주한다. 인간에서 흡수 정도가 중량 기준으로 또는 정맥내 참조 용량과 비교해 투여 용량의 >90%인 것으로 확인되는 경우, FDA에서는 이 약물 물질을 고 투과성으로 간주한다.
나노구조형 셀룰로스를 매트릭스, 비히클 및/또는 담체 물질로서 사용함으로써, 약학적 화합물과의 특수 나노복합체 구조, 바람직하게는 나노구조형 셀룰로스 매트릭스 내 나노입자 형태로 약학적 화합물을 포함하는 나노복합체를 형성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 나노복합체는, 본래 수-난용성 및/또는 생체이용성이 좋지 않은 화합물을 사용한 경우에도, 약학적 화합물의 용해율과 생체이용성을 높일 수 있다. 용해율은 대응되는 비-복합 약물 입자 (uncompounded drug particle)와 비교해 10분 이내에 50%, 심지어 90%로 더 높을 수 있다. 용해율은 10분 이내에 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 85%, 그리고 120분 이내에 적어도 90%, 적어도 95% 또는 심지어 적어도 99%일 수 있는 것으로 확인되었다. 비-복합 약물을 함유한 매트릭스와 비교해, 용해율은 50% 이상, 심지어 90% 이상 더 높을 수 있다. 일 구현예에서, 나노구조형 셀룰로스 매트릭스로부터 약학적 화합물의 용해율은 10분 이내에 50-90% 범위와 같이 10분 이내에 50% 이상이다.
본 발명은 약학적 화합물을 안정화하기 위한 또는 약학적 화합물의 생체이용성을 강화하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은, 약학적 조성물을 본원에 기술된 방법으로 제조하여 약학적 화합물을 안정화하는 것을 포함하는, 수 용해도가 낮은, 바람직하게는 수 용해도가 1 mg/ml 이하인 약학적 화합물의 안정화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 약학적 조성물을 본원에 기술된 방법으로 제조하는 것을 포함하는, 수 용해도가 낮은, 바람직하게는 수 용해도가 1 mg/ml 이하인 약학적 화합물의 생체이용성을 강화하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적 화합물을 안정화하기 위한 나노구조형 셀룰로스의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 약학적 화합물의 생체이용성을 강화하기 위한 나노구조형 셀룰로스의 용도를 제공한다.
본 발명은, 약학적 조성물을 제공하기 위해,
- 약학적 화합물을 일정 부분 이상 용매에 용해할 수 있는 용매 중에 25℃에서 수 용해도가 1 mg/ml 이하인 약학적 화합물을 제공하는 단계,
- 나노구조형 셀룰로스의 수성 분산물을 제공하는 단계, 및
- 상기 약학적 화합물을 나노구조형 셀룰로스의 수성 분산물과 반용매 공정으로 조합하여 평균 직경이 50 nm 이하인 나노크기의 약학적 입자를 제공하는 단계
를 포함하는, 약학적 조성물 또는 약학적 산물의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 이러한 방법으로 제조된 약학적 조성물 또는 약학적 산물을 제공한다. 약학적 산물은, 포장된, 담체 또는 비히클 내에 병합된 및/또는 사용되도록 준비된, 레디 포 유즈 (ready for use)로서 제공될 수 있는, 분리된 산물이다. 공정의 중간산물은 정의에서 제외된다.
본 산물은 수분 함유율이 매우 높은, 즉 92-99.95% (w/w) 범위의 수분 함유율을 가진 형태일 수 있으며, 그래서 수득되는 조성물 또는 산물은 다양한 타입의 투여에 적합하다. 조성물은 유동 분산물 (flowing dispersion)로서 제공될 수 있지만, 또한 하이드로겔로서 제공될 수도 있다. 일 예로, 나노구조형 셀룰로스의 분산물은 하이드로겔을 포함한다.
예를 들어, 주사가능한 조성물은 수분 함유율이 92-99.95% (w/w) 범위일 수 있으며, 나노구조형 셀룰로스의 함유율은 0.05-8% (w/w) 범위일 수 있다. 나노구조형 셀룰로스의 함유율은, 특히 조성물이 하이드로겔 형태인 것이 바람직한 경우에, 1-8% (w/w) 범위, 예를 들어 1-7% (w/w) 또는 1-6% (w/w)일 수 있다.
나노구조형 셀룰로스가 주로 분산물로서 제공되는 특정 구현예에서, 나노구조형 셀룰로스의 함유율은 0.05-0.5% (w/w) 범위, 예를 들어 0.05-0.4% (w/w) 또는 0.1-0.5% (w/w) 범위일 수 있으며, 이는 겔을 형성하지 않는다. 이러한 경우에, 수분 함유율은 99.4-99.95% (w/w) 범위, 예를 들어 99.5-99.95% (w/w) 범위일 수 있다. 나노구조형 셀룰로스의 함유율은 또한 예를 들어 0.05-1.4% (w/w), 0.1-1.4% (w/w), 0.05-3% (w/w), 0.1-3% (w/w), 0.5-3% (w/w) 또는 1-5% (w/w) 범위일 수 있다. 적정 농도는 의도한 용도에 따라 선택할 수 있다. 조성물은 조성물의 유일한 폴리머 물질로서 나노구조형 셀룰로스를 포함할 수 있으며, 조성물은 약학적 화합물(들)만 실질적으로 포함하거나 또는 나노구조형 셀룰로스로 구성될 수 있다. 이러한 경우에, 바람직하게는 조성물의 구조에는 영향을 미치지 않는, 착색제(들), 보존제(들) 등과 같은 당해 기술 분야에서 통상적인 첨가제들이 최소량으로, 바람직하게는 0.5% (w/w) 이하, 예를 들어 0.2% (w/w) 이하 또는 0.1% (w/w) 이하의 함량으로 포함될 수 있다.
수분 함유율은, 예를 들어, 나노피브릴 (nanofibrillar) 셀룰로스 및 약학적 성분과, 잠재적으로 임의의 첨가제의 %를 합하여, 계산하거나 또는 조정할 수 있으며, 나머지는 물일 수 있다.
약학적 화합물은 수용성 및/또는 생체이용성이 낮을 수 있다. 낮은 용해성은 본원에 언급된 임의의 낮은 용해성, 예를 들어 25℃에서 1 mg/ml 이하, 0.6 mg/ml 이하 또는 0.3 mg/ml 이하를 지칭할 수 있다. 약학적 화합물은 25℃에서 수 용해도가 0.1 mg/ml 이하일 수 있으며, 이는 수성 환경을 수반하는 대부분의 용도에서 문제가 되는 매우 낮은 용해성을 의미한다. 용해성이 매우 좋지 않은 화합물의 경우, 25℃에서 0.05 mg/ml 이하 또는 0.02 mg/ml 이하와 같이, 용해성이 심지어 더 낮을 수 있다. 용해성은 회전 디스크 방법인 USP 25와 같은 임의의 적절한 방법 또는 표준 방법을 이용해 결정할 수 있다. 다수의 경우에, 화합물의 용해성은 ALOGPS 소프트웨어 (예, ALOGPS 2.1)를 이용하는 등의 컴퓨터를 사용해 결정한다.
수-난용성 약학적 화합물의 예로는, 수 용해도가 0.214 mg/ml인 나린제닌 (naringenin)(ALOGPS), 25℃에서 수 용해도가 0.514 mg/ml인 아지트로마이신 (azithromycin)(BCS-II, ALOGPS), 37 mg/l로 수-난용성인 양쪽성 약물의 일 예로서 레파글리니드 (repaglinide), 유기 염기로서 물에 거의 녹지 않으며 (<1 mg/l) 전임상 동물 모델에서 경구 생체이용성이 좋지 않은 것으로 입증된 아타제나비르 (atazenavir) 등이 있다. 나아가, 카프로펜 (carprofen)도 수 용해도가 0.00379 mg/ml (3.79 ㎍/ml)로 매우 낮으며, 이트라코나졸 역시 중성 pH에서 용해도가 1 ㎍/l (0.001 ㎍/ml)이다. 그외 수 용해도 및/또는 생체이용성이 좋지 않은 약물의 예로는, 카르밤아제핀 (carbamazepine), 가바펜티닌 (gabapentinin), 모다피닐 (modafinil), 피록시캄 (piroxicam), 카페인 (caffeine), 캄프토테신 (camptothecin), 빈포세틴 (vinpocetine), 페노피브레이트 (fenofibrate), 타크롤리무스 (Tacrolimus), 로피나비르 (Lopinavir)/리토나비르 (Ritonavir), 나빌론 (Nabilone), 니모디핀 (Nimodipine), 페노피브레이트 (Fenofibrate), 에트라비린 (Etravirine), 포르피린 (porphyrins), 미녹시딜 (minoxidil), 펩타이드 및 안트라사이클린 (anthracyclines), 사이클로스포린 A (Cyclosporine A), 디아제팜 (Diazepam), 덱사메타존 팔미테이트 (Dexamethazone palmitate), 에토미데이트 (Etomidate), 플루르비프로펜 (Flurbiprofen), 프로스타글란딘-E1 (Prostaglandin-E1), 프로포폴 (Propofol), 퍼플루로데칼린 (perflurodecalin) 및 퍼플루로트리프로필아민 (perflurotripropylamine), 비타민 A, D, E 및 K, 위장관에서 에멀젼 또는 마이크로에멀젼을 형성하는 경구 제품, 예를 들어 사이클로스포린 (cyclosporin), 칼시트롤 (Calcitrol), 클로파지민 (Clofazimine), 도세르칼시페롤 (Doxercalciferol), 드로나비오놀 (Dronabionol), 두타스테리드 (Dutasteride), 이소트레티오노인 (Isotretionoin), 리토나비르 (Ritonavir), 파리칼시톨 (Paricalcitol), 프로게스테론 (Progesterone), 사퀴나비르 (Saquinavir), 시롤리무스 (Sirolimus), 트리티오노인 (Tritionoin), 티프라나비르 (Tipranavir), 발프로익산 (Valproic acid), 및 항암제, 예를 들어 팩티탁셀 (pactitaxel) 등이 있다.
전술한 하나 이상의 약학적 화합물 및/또는 기타 약학적 화합물(들)이 본원에 기술된 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 약학적 화합물은 항종양제, 항암제, 항세균제, 예를 들어 항생제, 항바이러스제, 항염증제, 항알레르기제 및 진통제 (analgesic agent 또는 painkiller), 예를 들어 오피오이드 또는 비스테로이드계 항염증제, 및/또는 본원에 기술된 기타 물질(들)을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 일 예로, 약학적 화합물은 진통성 화합물이 아니며, 특히 약학적 조성물이 주사가능한 형태인 경우 진통성 화합물이 아니다. 약학적 화합물은 약제, 즉 약물 화합물일 수 있지만, 이 용어는 기타 적용가능한 생리활성 물질 또는 제제, 예를 들어 식물 유래의 생리활성 물질, 예를 들어 플라보노이드 등을 포함할 수 있다.
나노구조형 셀룰로스, 예를 들어 나노결정 셀룰로스 또는 나노피브릴 셀룰로스는 도 1에 개략적으로 도시된 바와 같이 반용매 재결정화 공정을 이용해 약학적 화합물과의 나노복합체 구조를 형성하는데, 이용할 수 있다.
본원에 언급된 바와 같이 수-난용성일 수 있는 약학적 화합물은 처음에 분말 형태 또는 입자 형태, 예를 들어 건조된 형태로 제공될 수 있다. 약학적 화합물은 또한 용액 또는 분산물로 제공될 수 있거나, 또는 건조된 형태를 바람직하게는 물을 포함할 수 있거나 또는 물 이외의 것, 예를 들어 유기 용매 또는 유기 용매를 함유한 수성 용액, 분산물 또는 에멀젼을 포함할 수 있는, 적절한 용매를 사용해 용액 또는 분산물로 제조할 수도 있다. 용매는 약학적 화합물을 일정 부분 이상 용매에 용해할 수 있다. 약학적 화합물은 상기한 방법으로 용매 중에 제공될 수 있다. 유기 용매의 예로는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, 1-옥타놀, 프로필렌 글리콜, 톨루엔, 아세톤, 1,4.다이옥산, 에틸 아세테이트, 이소프로필 미리스테이트, 아세토니트릴, 클로로포름, n-헥산, 사이클로헥산, 다이메틸 설폭사이드 (DMSO), N-메틸-2-피롤리돈 (NMP), 다이메틸 포름아미드 (DFM) 및 이의 혼합물 등이 있다. 용매는 예를 들어 무수 에탄올과 같은 에탄올일 수 있다. 용매는 사용되는 화합물에 따라, 예를 들어 화합물의 용해도에 따라 선택할 수 있다. 에탄올, 특히 무수 에탄올이 대부분의 화합물들에 적합한 용매일 수 있다. 용매 중의 약학적 화합물, 일반적으로 약물의 용액이 제공된다.
반용매 재결정화 공정은 반용매를 첨가하여 과포화를 달성하는 과정을 수반한다. 적절한 담체의 사용없이, 예를 들어 용매 중의 약물을 물과 조합하게 되면, 약물 입자들이 응집하여, 통상적으로 생체이용성이 좋지 않은 난용성 형태가 형성될 것이다. 그러나, 이 경우에, 공정을 조절하여, 나노크기의 약물 입자를 수득할 수 있으며, 그래서 최종 산물에서 안정성 및 생체이용성의 개선이 달성된다. 본원에 기술된 나노구조형 셀룰로스가 담체로서 제공되는 경우, 약물-나노구조형 셀룰로스 나노복합체가 만들어지고, 유지된다. 이러한 구조에서 약물은 석출 및/또는 응집되지 않고, 효과적으로 안정화 및 방출되어, 우수한 생체이용성이 달성되는 것으로, 확인되었다. 이러한 나노복합체는 여러가지 투여 타입의 약학적 조성물 및 투약 형태로 사용할 수 있다. 이러한 공정은 약물 화합물의 예로서 나린제닌을 이용하는 도 3에, 약물 화합물의 예로서 아지트로마이신을 이용하는 도 4에 기술된다. 도 3의 공정은 담체로서 CNC를 사용하고, 도 4의 공정은 담체로서 CNF를 사용한다.
이러한 방법에서, 적절한 용매 중의 약학적 화합물을 실시예들에 기술된 바와 같이 반용매 공정으로 나노구조형 셀룰로스에 첨가한다. 화합물의 과포화 농도를 달성한다. 나노구조형 셀룰로스의 수성 분산물이 반용매로서 작용한다. 이러한 공정에서, 약학적 화합물은 과포화 농도에서 핵을 형성하게 되고, 이후 평균 직경 또는 50 nm 이하, 예를 들어 40 nm 이하, 30 nm 이하 또는 20 nm 이하의 나노입자로 계속 성장하게 된다. 구체적으로, 결정핵 생성 공정에서 나노입자가 수득된다. 수득된 나노입자는 응집체로서 존재하지 않으며, 오히려 분리된 형태로 존재한다. 약학적 화합물은 고도의 결정질 형태가 아니라 비정질 상태의 나노입자로 존재한다. 나노입자의 크기 및 형태는 예를 들어 도 7, 12 및 17에 도시된 바와 같이 전자 현미경을 사용함으로써 최종 산물로부터 미시적으로 검출할 수 있다.
용매 중의 약학적 화합물은, 나노구조형 셀룰로스의 수성 분산물과, 나노구조형 셀룰로스를 처리하는데 사용할 수도 있는, 믹서, 교반기, 분산기 (disperser), 호모게나이저 또는 유사 장치를 사용함으로써와 같이, 혼합 (mixing)하여 조합할 수 있다.
일 구현예에서, 나노구조형 셀룰로스는, 피브릴 평균 직경이 200 nm 이하, 예를 들어 1-200 nm 범위일 수 있는, 나노피브릴 셀룰로스를 포함한다.
일 구현예에서, 나노피브릴 셀룰로스는, 22℃±1℃에서 수성 매질 중의 컨시스턴시 (consistency) 0.5 중량% (w/w)에서 회전형 레오미터 (rotational rheometer)에 의한 측정시, 물에 분산시, 1000-100000 Pa·s 범위, 예를 들어 5000-50000 Pa·s 범위의 제로 전단 점도 (zero shear viscosity), 및 1-50 Pa 범위, 예를 들어 3-15 Pa 범위의 항복 응력을 제공한다.
일 구현예에서, 나노구조형 셀룰로스는 나노결정 셀룰로스 (nanocrystalline cellulose)를 포함한다. 나노결정 셀룰로스는 2-40 nm, 예를 들어 2-20 nm 범위의 평균 피브릴 직경과, 100 nm 이상, 최대 수 ㎛, 예를 들어 100-400 nm 범위의 평균 피브릴 길이를 가질 수 있다. 통상적으로, 물질의 10% 이하가 5 ㎛ 미만의 입자 크기를 가진다. 나노결정 셀룰로스는, 비정질 영역을 제거하여 셀룰로스의 결정질 영역을 수득하는, 산 가수분해에 의해 셀룰로스로부터 제조할 수 있다. 따라서, 나노결정 셀룰로스는 사실상 결정형 셀룰로스로 구성되며, 셀룰로스의 비정질 영역은 결핍되어 있다. 나노피브릴 셀룰로스는 한편으로 직선 세그먼트 (straight segment)로서 결정질 파트와, 피브릴에 킹크 (kink)를 제공하는 비정질 파트를 모두 포함한다. 이들 2가지 나노구조형 셀룰로스 물질이 공통적인 특징 및 특성을 가짐에도 불구하고, 또한 구조적 차이로 인해, 이들 2가지 물질은 일부 서로 다른 특성을 나타낼 수도 있다.
100 ㎕ 당 약학적 화합물 최대 1% (w/w) 또는 최대 1 mg 함량인 분산물/조성물 형태에서, 나노구조형 셀룰로스 분산물, 심지어 희석된 분산물에서, 난용성 약학적 화합물이 안정화되고 이의 생체이용성이 증가될 수 있는 것으로, 확인되었다.
약학적 화합물의 함량은 약학적 조성물 100 ㎕ 당 0.05-1 mg 범위일 수 있다. 일 예로, 약학적 화합물의 함량은 약학적 조성물 100 ㎕ 당 0.1-0.7 mg 범위, 예를 들어 약학적 조성물 100 ㎕ 당 0.1-0.5 mg 범위이다.
약학적 화합물의 함량은 약학적 조성물의 0.05-1% (w/w) 범위, 예를 들어 0.1-1% (w/w) 범위일 수 있다. 일 예로, 약학적 화합물의 함량은 0.1-0.7% (w/w) 범위, 예를 들어 0.1-0.5% (w/w) 범위이다.
약학적 조성물은, 분산물로서 또는 하이드로겔로서 존재할 수 있는, 약학적 산물 또는 약학적 제형으로서 제공될 수 있다. 일 예로, 본 방법은 수득한 약학적 조성물을 냉동-건조하는 것을 포함한다.
본 방법은 수득한 약학적 조성물을 바이얼, 캡슐 또는 시린지에 패킹하는 것을 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 예를 들어 경구 투약, 좌제, 드레싱, 주사가능한 투약 또는 임플란트의 형태로 또는 일부로서 제공되거나 또는 존재할 수 있다.
경구 투약 형태가, 예를 들어 나노구조형 셀룰로스의 수성 분산물, 바람직하게는 하이드로겔을 캡슐화하거나 또는 커버링함으로써, 제공될 수 있다. 나노구조형 셀룰로스 분산물 또는 하이드로겔이 그대로 제공되거나 또는 사용될 수 있는 형태가 아닐 수 있으므로, 이러한 것이 필요할 수 있다. 그러나, 애플리케이터, 예를 들어 시린지, 패키지, 예를 들어 플라스틱, 페이퍼 또는 이의 라미네이트 (laminate)로 된 멤브레인, 시트 또는 가요성 구조체로부터 제조될 수 있는, 찢을 수 있는 패키지를 사용함으로써, 경구 이용할 수 있는, 겔 또는 분산물 형태로 약학적 조성물을 제공하는 것도 가능하다.
캡슐화는, 예를 들어 경구 섭취하거나 또는 좌제로서 사용될 수 있게 하는, 캡슐로서 알려진 비교적 안정적인 셸 안에 약제를 봉입하기 위해 사용되는 다양한 투약 형태 및 기법을 지칭한다. 캡슐제의 주된 2가지 타입으로는 경질 캡슐제 (hard-shelled capsules) 및 연질 캡슐제를 포함한다. 경질 캡슐제는 일반적으로 건조한 분말 성분 또는 예를 들어 압출 또는 구체화 (spheronization) 공정에 의해 제조된 미니어처 펠렛을 함유할 수 있다. 이는 절반 2개로 제조된다: 더 작은 직경의 "본체"에 충진한 다음 이를 더 큰 직경의 "캡"으로 밀봉하며, 이는 오일과 오일 중에 용해 또는 현탁되는 활성 성분에 주로 사용된다. 본 조성물은 2가지 타입의 캡슐제에 수용될 수 있다.
이들 2가지 형태의 캡슐제는 동물 단백질, 예를 들어 젤라틴 또는 식물 다당류 또는 이의 유도체, 예를 들어 카라기난 및 전분 및 셀룰로스의 변형된 형태와 같은, 겔화제의 수용액으로부터 제조될 수 있다. 겔화제 용액에는, 캡슐의 경도를 낮추기 위해 글리세린 또는 소르비톨과 같은 가소제, 착색제, 보존제, 붕해제, 윤활제 및 표면 처리제 등의 기타 성분들이 첨가될 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스
하이드로겔을 제조하기 위한 출발 물질은, 나노셀룰로스로도 지칭되는, 나노피브릴 셀룰로스일 수 있으며, 이는 셀룰로스 원료 물질로부터 유래된 분리된 셀룰로스 피브릴 또는 피브릴 번들을 지칭한다. 나노피브릴 셀룰로스는 자연계에 풍부한 천연 폴리머를 기반으로 한다. 나노피브릴 셀룰로스는 수중에 점성의 하이드로겔을 형성할 수 있다. 나노피브릴 셀룰로스 제조 기법은 펄프 섬유의 수성 분산물의 분쇄 (grinding) 등의, 섬유성 원료 물질을 분해 (disintegrating)하여 나노피브릴화된 셀룰로스를 수득하는 공정을 기반으로 할 수 있다. 분쇄 또는 균질화 공정 후, 수득되는 나노피브릴 셀룰로스 물질은 점탄성 하이드로겔 희석물 (dilute viscoelastic hydrogel)이다.
통상적으로, 수득되는 물질은, 분해 조건으로 인해, 물에 균질하게 분산된 상대적으로 저 농도로 존재한다. 출발 물질은 0.2-10% (w/w), 예를 들어 0.2-5% (w/w) 농도에서 수성 겔일 수 있다. 나노피브릴 셀룰로스는 섬유성 원료 물질의 분해로부터 직접 수득할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔의 일 예는 UPM 사의 GrowDex®이다.
나노피브릴 셀룰로스는, 이의 나노크기 구조로 인해, 통상적인 비-나노피브릴 셀룰로스에 의해 제공될 수 없는, 기능성을 수행할 수 있는 독특한 특성을 가진다. 통상적인 셀룰로스 물질을 이용해 통상적인 산물 또는 산물과는 다른 특성을 보이는 물질 및 산물을 제조하는 것도 가능하다. 그러나, 나노크기의 구조로 인해, 나노피브릴 셀룰로스는 또한 곤란한 물질 (challenging material)이다. 예를 들어, 나노피브릴 셀룰로스의 탈수 (dewatering) 또는 취급이 어려울 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스는 식물 기원의 셀룰로스 원료 물질로부터 제조할 수 있거나, 또는 특정 박테리아 발효 공정으로부터 파생될 수 있다. 나노피브릴 셀룰로스는 바람직하게는 식물 물질로 만들어진다. 원료 물질은 셀룰로스를 함유한 임의의 식물 물질을 기초로 할 수 있다. 일 예로, 피브릴은 식물의 비-실질 물질로부터 유래된다. 이 경우에, 피브릴은 2차 세포벽으로부터 수득할 수 있다. 이러한 셀룰로스 피브릴이 풍부한 한가지 소스는 목재 섬유 (wood fibre)이다. 나노피브릴 셀룰로스는 화학 펄프일 수 있는 목재-유래 섬유성 원료 물질을 균질화함으로써 제조할 수 있다. 셀룰로스 섬유를 분해하여, 평균 직경이 수 nm에 불과한, 대부분의 경우 200 nm 이하일 수 있는 피브릴을 제조하며, 이는 수중 피브릴 분산물로 제공된다. 2차 세포벽으로부터 기원하는 피브릴은 기본적으로 결정화도가 적어도 55%인 결정형이다. 이러한 피브릴은 1차 세포벽으로부터 기원하는 피브릴과는 다른 특성을 가질 수 있으며, 예를 들어 2차 세포벽으로부터 기원한 피브릴은 탈수가 더 어려울 수 있다. 일반적으로, 사탕무, 감자 덩이줄기 및 바나나 꽃대와 같은 1차 세포벽으로부터 유래되는 셀룰로스 소스의 경우, 목재 유래 피브릴과 비교해 섬유 매트릭스로부터 마이크로피브릴을 분리하기 더 용이하며, 분해하는데 에너지가 더 적게 든다. 그러나, 이들 물질들은 여전히 다소 이질적 (heterogeneous)이며, 거대 피브릴 번들로 구성된다.
비-목재 물질은 농업 잔류물, 풀 또는 기타 식물 물질, 예를 들어 목화, 옥수수, 밀, 귀리, 호밀, 보리, 벼, 아마, 삼, 마닐라 삼, 사이잘 삼, 황마, 모시풀, 케나프 (kenaf), 바가스, 대나무 또는 갈대로부터 유래된 짚 (straw), 잎, 나무 껍질, 종자, 겉껍질 (hull), 꽃, 야채 (vegetables) 또는 열매로부터 유래할 수 있다. 셀룰로스 원료 물질은 또한 셀룰로스를 생산하는 미생물로부터 유래할 수도 있다. 미생물은 아세토박터 (Acetobacter), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 리조븀 (Rhizobium), 슈도모나스 (Pseudomonas) 또는 알칼리게네스 (Alcaligenes) 속의 것일 수 있으며, 바람직하게는 아세토박터 속, 더 바람직하게는 아세토박터 크실리누모르 (Acetobacter xylinumor) 또는 아세토박터 파스테리아누스 (Acetobacter pasteurianus) 종의 미생물일 수 있다.
목재 셀룰로스로부터 수득되는 나노피르릴 셀룰로스가 본원에 언급된 의학적 또는 과학적 생산물에 바람직한 것으로 밝혀졌다. 목재 셀룰로스는 다량으로 이용가능하며, 목재 셀룰로스에 대해 개발된 제조 방법들은 생산물에 적합한 나노피브릴 물질을 제조가능하게 해준다. 식물 섬유, 특히 목재 섬유를 피브릴화함으로써 수득되는 나노피브릴 셀룰로스는, 미생물로부터 수득되는 나노피브릴 셀룰로스와 구조적으로 상이하며, 서로 다른 특성을 가진다. 예를 들어, 박테리아 셀룰로스와 비교해, 나노피브릴화된 목재 셀룰로스는 균질하며, 다공성이 높고 느슨한 물질이며, 이는 의학적 용도로 유용하다. 박테리아 셀룰로스는 통상적으로 식물 셀룰로스에서와 비슷한 피브릴화 없이 그대로 사용되므로, 이 물질은 이런 측면에서 상이하다. 박테리아 셀룰로스는 농밀한 물질로, 소형 스페로이드를 쉽게 형성하며, 따라서 물질의 구조가 불연속적이며, 의학적 용도, 특히 물질의 균질성이 요구되는 경우에는 이러한 물질을 사용하기 바람직하지 않다.
목재는 가문비나무, 소나무, 전나무, 낙엽송, 더글러스-퍼 (douglas-fir) 또는 솔송나무 (hemlock)와 같은 침엽수 (softwood tree), 또는 자작나무, 백양 (aspen), 포플러, 앨더 (alder), 유칼립투스, 참나무, 너도밤나무 또는 아카시아와 같은 활엽수로부터 유래할 수 있거나, 또는 침엽수와 활엽수의 혼합물로부터 유래할 수 있다. 일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스는 목재 펄프로부터 수득한다. 나노피브릴 셀룰로스는 활엽수 펄프로부터 수득할 수 있다. 일 예에서, 활엽수는 자작나무이다. 나노피브릴 셀룰로스는 침엽수 펄프로부터 수득할 수 있다. 일 예에서, 목재 펄프는 화학 펄프 (chemical pulp)이다. 화학 펄프는 본원에 기술된 생산물에 바람직할 수 있다. 화학 펄프는 순수한 물질이며, 매우 다양한 용도로 사용할 수 있다. 예를 들어, 화학 펄프에는 기계 펄프 (mechanical pulp)에 존재하는 피치 (pitch) 및 수지산 (resin acid)이 없으며, 더욱 무균성 (sterile)이거나 또는 쉽게 살균 처리가 가능하다. 나아가, 화학 펄프는 보다 유연하며, 예를 들어 의료 및 과학 재료에 유익한 특성을 제공한다. 예를 들어, 매우 균질한 나노피브릴 셀룰로스 물질은 과도한 가공없이 또는 특수 장치나 노동 집약적인 가공 단계 없이 제조할 수 있다.
셀룰로스 피브릴 및/또는 피브릴 번들을 비롯한 나노피브릴 셀룰로스는 높은 종횡비 (길이/직경)를 특징으로 한다. 나노피브릴 셀룰로스의 평균 길이 (피브릴 또는 피브릴 번들과 같은 입자의 길이 중앙값)는 1 ㎛를 초과할 수 있으며, 대부분의 경우 50 ㎛ 이하이다. 엘리멘터리 피브릴 (elementary fibril)들이 서로 완전히 분리되어 있지 않다면, 엉켜있는 피브릴 (entangled fibril)은 평균 총 길이가 예를 들어 1-100 ㎛, 1-50 ㎛ 또는 1-20 ㎛ 범위일 수 있다. 그러나, 나노피브릴 물질이 고도로 피브릴화된다면, 엘리멘터리 피브릴들은 완전히 또는 거의 완전히 분리될 수 있으며, 평균 피브릴 길이는 1-10 ㎛ 또는 1-5 ㎛와 같이 더 짧다. 이는 특히 예를 들어 화학적으로, 효소적으로 또는 기계적으로 단축 또는 분해 처리되지 않은 천연 등급의 피브릴에 특히 해당된다. 그러나, 현저하게 유도체화된 나노피브릴 셀룰로스는 0.3-50 ㎛, 예로, 0.3-20 ㎛, 예를 들어 0.5-10 ㎛ 또는 1-10 ㎛ 범위와 같이 더 짧은 평균 피브릴 길이를 가질 수 있다. 특히 효소적으로 또는 화학적으로 분해 처리된 피브릴 또는 기계적으로 처리된 물질과 같이 단축화된 피브릴은 0.1-1 ㎛, 0.2-0.8 ㎛ 또는 0.4-0.6 ㎛과 같이 1 ㎛ 미만의 평균 피브릴 길이를 가질 수 있다. 피브릴 길이 및/또는 직경은 현미경 분석으로, 예를 들어 CRYO-TEM, SEM 또는 AFM 이미지를 이용해 추정할 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스의 평균 직경 (너비)은 1-500 nm 범위와 같이 1 ㎛ 미만 또는 500 nm 이하이며, 바람직하게는 200 nm 이하, 심지어 100 nm 이하 또는 50 nm 이하, 예를 들어 1-200 nm, 2-200 nm, 2-100 nm 또는 2-50 nm 범위이며, 고도로 피브릴화된 물질의 경우 심지어 2-20 nm이다. 본원에 언급된 직경은 피브릴 및/또는 피브릴 번들을 지칭할 수 있다. 가장 작은 피브릴은 엘리멘터리 피브릴 크기이며, 평균 직경은 전형적으로 2-12 nm 범위이다. 엘리멘터리 나노피브릴은 약 100-200 nm 길이의 직선 세그먼트 다음에 피브릴을 따라 샤프 킹크 (sharp kink)를 가질 수 있다. 이러한 직선 세그먼트는 고도의 결정질 셀룰로스 도메인들로 구성되며, 밴딩 부위는 비정질 파트에 의해 형성된다.
피브릴의 치수 및 크기 분포는 리파이닝 방법 및 효율에 따라 결정된다. 고도로 리파이닝된 천연 나노피브릴 셀룰로스의 경우, 피브릴 번들을 비롯하여, 평균 피브릴 직경은 2-200 nm 또는 5-100 nm 범위, 예를 들어 10-50 nm 범위일 수 있다. 나노피브릴 셀룰로스는 높은 비표면적과 강한 수소 결합력을 특징으로 한다. 수 분산물에서, 나노피브릴 셀룰로스는 전형적으로 연한 또는 흐린 겔-유사 물질로서 보인다. 섬유 원료 물질에 따라, 식물, 특히 목재로부터 수득되는 나노피브릴 셀룰로스는 또한 헤미셀룰로스 또는 리그닌과 같은 기타 식물 성분, 특히 목재 성분을 소량 함유할 수 있다. 함량은 식물 소스에 따라 결정된다.
일반적으로, 셀룰로스 나노물질은 셀롤로스 나노물질에 대한 표준 용어를 제시하는 TAPPI W13021에 따른 카테고리로 분류될 수 있다. 이들 물질들이 모두 나노피브릴 셀룰로스인 것은 아니다. 주 카테고리 2종은 "나노 물체 (Nano objects)"와 "나노 구조 물질 (Nano structured material)"이다. 나노 구조 물질은 직경이 10-12 ㎛이고 길이:직경의 비가 (L/D) <2인 "셀룰로스 미세결정" (때때로 CMC로 지칭됨)과, 직경이 10-100 nm이고 길이가 0.5-50 ㎛인 "셀룰로스 마이크로피브릴"을 포함한다. 나노 물체는, 직경이 3-10 nm이고 L/D가 >5인 "셀룰로스 나노결정" (CNC)과 직경이 5-30 nm이고 L/D가 >50인 "셀룰로스 나노피브릴" (CNF 또는 NFC)로 나눌 수 있는, "셀룰로스 나노섬유"를 포함한다.
여러가지 등급의 나노피브릴 셀룰로스는 3가지 주요 특성에 따라 분류할 수 있다: (i) 크기 분포, 길이 및 직경, (ii) 화학적 조성, 및 (iii) 유변학적 특성. 이들 특성이 반드시 서로 직접적으로 의존적인 것은 아니다. 등급을 충분히 기술하기 위해, 특성들을 동시에 이용할 수 있다. 여러가지 등급의 예로는 천연 (화학적으로 또는 효소적으로 비-변형된) NFC, 산화된 NFC (고 점성), 산화된 NFC (저 점성), 카르복시메틸화된 NFC 및 양이온성화된 NFC 등이 있다. 이러한 주요 등급내에는, 또한 하위-등급 (sub-grade)이, 예를 들어 고도로 피브릴화된 것 대비 중간 수준으로 피브릴화된 것, 고 치환도 대 저 치환도, 저 점성 대 고 점성 등이 존재한다. 피브릴화 기법과 화학적 예비-변형이 피브릴 크기 분포에 영향을 미친다. 전형적으로, 비-이온성 등급이 더 넓은 평균 피브릴 직경 (예, 10-100 nm 또는 10-50 nm 범위)을 가지는 반면, 화학적으로 변형된 등급은 더 좁다 (lot thinner)(예, 2-20 nm 범위). 변형된 등급 역시 분포 범위가 더 좁다. 특정 변형, 특히 TEMPO-산화로 더 짧은 피브릴이 제조된다.
원료 소스에 따라, 예를 들어 활엽수 펄프 대 침엽수 펄프에 따라, 최종 나노피브릴 셀룰로스 생산물에는 서로 다른 다당류 조성이 존재하게 된다. 통상적으로, 비-이온성 등급은 표백 처리된 자작나무 펄프 (bleached birch pulp)로부터 제조되며, 크실렌 함량이 높게 (25 중량%) 수득된다. 변형된 등급은 침엽수 또는 활엽수 펄프로부터 제조된다. 이러한 변형된 등급의 경우, 셀룰로스 도메인과 더불어 헤미셀룰로스도 변형된다. 거의 아마도, 변형은 균질하지 않으며, 즉 일부분은 다른 것보다 더 변형된다. 따라서, 변형된 산물은 여러가지 다당류 구조들로 된 복합적인 혼합물이므로, 상세한 화학적인 분석이 일반적으로 가능하지 않다.
수성 환경에서, 셀룰로스 나노피브릴의 분산물은 점탄성 하이드로겔 네트워크를 형성한다. 이 겔은 분산 및 수화된 엉켜있는 피브릴에 의해 예를 들어 0.05-0.2% (w/w)의 비교적 낮은 농도에서도 이미 형성된다. NFC 하이드로겔의 점탄성은 예를 들어 동적 진동 유변학적 측정 (dyna-mic oscillatory rheological measurements)으로 특정할 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔은 특징적인 유변학적 특성을 나타낸다. 예를 들어, 이는 전단-박화 (shear-thinning) 또는 유사가소성 (pseudoplastic) 물질이며, 요변성 거동의 특수 사례로서 간주될 수 있는데, 이는 이의 점성이 물질이 변형되는 속도 (또는 힘)에 의해 좌우되는 것을 의미한다. 회전 레오미터에 의해 점성을 측정할 경우, 전단-박화 거동은 전달 속도 증가에 따라 점성이 감소하는 것으로 보인다. 하이드로겔은 소성 거동을 나타내는데, 이는 물질이 쉽게 흐르기 시작하기 전에 특정 전단 응력 (힘)이 필요하다는 것을 의미한다. 이러한 임계 전단 응력을 종종 항복 응력이라 한다. 항복 응력은 응력 조절 레오미터를 사용해 측정된 정지상 유도 곡선 (steady state flow curve)으로부터 결정할 수 있다. 점성을 적용된 전단 응력의 함수로서 그래프로 작성하였을 때, 임계 전단 응력을 넘어선 다음 점성은 급격하게 감소하는 것으로 보인다. 제로 전단 점도와 항복 응력은 물질의 현탁 분말 (suspending power)을 설명하기 위한 가장 중요한 유변학적 파라미터이다. 이들 2가지 파라미터는 매우 명확하게 서로 다른 등급을 구분하므로, 등급을 분류할 수 있다.
피브릴 또는 피브릴 번들의 치수는, 예를 들어, 원료 물질, 분해 방법 및 분해 횟수에 따라 결정된다. 셀룰로스 원료 물질의 기계적 분해는 리파이너 (refiner), 분쇄기, 분산기 (disperser), 호모게나이저, 콜라이더 (colloider), 마찰 분쇄기 (friction grinder), 핀 밀 (pin mill), 로터-로터 분산기 (rotor-rotor dispergator), 초음파 발생기 (ultrasound sonicator), 마이크로유화기 (microfluidizer), 마크로유화기 (macrofluidizer) 또는 유화기-타입의 호모게나이저와 같은 유화기 (fluidizer) 등의 임의의 적절한 장치를 사용해 수행할 수 있다. 분해 처리는 섬유들 간의 결합을 방지하기 위해 물이 충분히 존재하는 조건에서 수행된다. 당해 기술 분야의 당업자는 과도한 실험없이, 예를 들어 적절한 분해 장치, 적절한 출발 물질, 적절한 화학적, 물리적 및/또는 효소적 처리, 공정에 사용되는 통과 횟수 및/또는 에너지뿐 아니라 수득되는 산물의 농도 및 화합물 함유율을 선택함으로써, 원하는 유변학적 특성 및 피브릴화 정도를 가진 나노피브릴 셀룰로스를 제조하기 위한 조건을 조정할 수 있다.
일 예에서, 분해는 하나 이상의 로터, 블레이드 또는 비슷하게 움직이는 기계 부품을 가진 분산기, 예를 들어 2 이상의 로터를 가진 로터-로터 분산기를 사용해 수행한다. 분산기에서, 분산물 내 섬유 물질은, 블레이드가 회전 속도로, 그리고 반대 방향으로 반경 (회전 축까지의 거리)에 의해 결정되는 주변 속도 (peripheral speed)로 회전할 때, 반대 방향으로부터 이를 타격하는 로터의 리브 (rib) 또는 블레이드에 의해 반복적으로 충격을 받게 된다. 섬유 물질은 반경 방향으로 바깥쪽으로 이동하므로, 블레이드의 넓은 표면, 즉 리브에 충돌해, 반대 방향으로부터 높은 주변 속도로 차례대로 오게 되며; 다시 말해, 반대 방향으로부터 연속적인 충격을 수차례 받게 된다. 또한, 블레이드의 넓은 표면, 즉 리브의 에지에서, 에지는 다음 로터 블레이드의 맞은편 에지와 블레이드 갭을 형성하며, 전단력이 발생되어, 섬유 분해 및 피브릴의 탈착에 기여하게 된다. 충격 횟수는 로터의 회전 속도, 로터의 개수, 각 로터의 블레이드 개수 및 디바이스 전체에서의 분산물의 유속에 의해 결정된다.
로터-로터 분산기 (rotor-rotor dispergator)에서, 섬유 물질은, 물질이 여러가지 역-회전 로터의 작용에 의해 전단력 및 충격력에 반복적으로 노출되면서 동시에 피브릴화되는 방식으로, 로터의 회전 축에 대해 반경 방향으로 바깥쪽으로 역-회전 로터를 통해 도입된다. 로터-로터 분산기의 일 예는 Atrex 디바이스이다.
적합한 분해용 디바이스에 대한 다른 예는 다중-주변 핀 밀 (multi-peripheral pin mill)과 같은 핀 밀이다. 이러한 디바이스의 일 예는 하우징과 내부에 충돌 표면이 구비된 제1 로터; 제1 로터와 반대 반향으로 회전하게 배치되며, 제1 로터와 중심이 동일하고 충돌 표면이 구비된 제2 로터; 또는 제1 로터와 중심이 동일하며 충돌 표면이 구비된 스테이터 (stator)를 포함한다. 디바이스는 로터들 또는 로터 및 스테이터의 센터에의 개구부 및 하우징 내 공급 오리피스와, 그리고 최외측 로터 또는 스테이터의 주변부에의 개구부 및 하우징 벽부 상의 배출 오리피스를 포함한다.
일 예에서, 분해는 호모게나이저를 사용해 수행된다. 호모게나이저에서, 섬유 물질은 압력 작용에 의해 균질화를 거치게 된다. 섬유 물질 분산물에서 나노피브릴 셀룰로스로의 균질화는 분산물의 강제된 스루-플로우 (forced through-flow)에 의해 유발되며, 그래서 섬유 물질이 피브릴로 분해된다. 섬유 물질 분산물은 좁은 스루-플로우 갭을 통해 소정의 압력 하에 통과하게 되며, 이곳에서 분산물의 선형적인 속도 증가로 인해 분산물에 전단력과 충격력이 가해져, 섬유 물질로부터 피브릴의 해리 (removal)가 이루어진다. 섬유 단편들은 피브릴화 단계에서 피브릴로 분해된다.
본원에서, 용어 "피브릴화"는 일반적으로 입자에 적용되는 작업에 의해 기계적으로 섬유 물질을 분해하여, 셀룰로스 피브릴이 섬유 또는 섬유 단편들로부터 분리되는 것을 의미한다. 이러한 작업은 분쇄, 파쇄 또는 전단 및 이들의 조합, 또는 입자의 크기를 줄이는 다른 상응하는 작동과 같은 다양한 작용을 기반으로 할 수 있다. "분해" 또는 "분해 처리"라는 표현은 "피브릴화"와 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
피브릴화를 거친 섬유 물질 분산물은 섬유 물질과 물의 혼합물이며, 본원에서 "펄프"로도 지칭된다. 섬유 물질 분산물은 일반적으로 홀 섬유 (whole fiber), 이로부터 분리된 일부분 (단편), 피브릴 번들 또는 피브릴과 물의 혼합물을 지칭할 수 있으며, 전형적으로 섬유 물질의 수성 분산물은 이들 성분들의 혼합물이며, 성분 비는 가공도 (degree of processing) 또는 처리 단계, 예를 들어, 동일 배치의 섬유 물질에 대한 처리 운영 (run) 또는 "통과 (pass)" 횟수에 따라 결정된다.
나노피브릴 셀룰로스를 특정하기 위한 한가지 방식은 나노피브릴 셀룰로스를 함유한 수용액의 점도를 이용하는 것이다. 점도는 예를 들어 브룩필드 점도 또는 제로 전단 점도일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 비점도는 나노피브릴 셀룰로스를 비-나노피브릴 셀룰로스와 구분한다.
일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스의 겉보기 점도는 브룩필드 점도계 (브룩필드 점도) 또는 상응하는 다른 장치를 사용해 측정한다. 적합하게는, 베인 스핀 (vane spindle) (number 73)을 사용한다. 모두 동일한 원리에 기초한, 겉보기 점도를 측정하기 위한 시판 브룩필드 점도계가 수종 있다. 적합하게는, 장치에 RVDV 스프링 (Brookfield RVDV-III)을 사용한다. 나노피브릴 셀룰로스 샘플을 물에 0.8 중량% 농도로 희석하여, 10분간 혼합한다. 희석한 샘플을 250 ml 비이커에 넣고, 온도를 20℃±1℃로 조정하고, 필요에 따라 가열하고, 혼합한다. 낮은 회전 속도 10 rpm을 적용한다. 일반적으로, 브룩필드 점도는 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정할 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스, 예를 들어 본 방법에서 출발 물질로서 제공되는 나노피브릴 셀룰로스는, 수용액에 제공되는 점도로 특정될 수 있다. 점도는, 예를 들어, 나노피브릴 셀룰로스의 피브릴화도를 나타낸다. 일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 적어도 3000 mPaㆍs과 같이 적어도 2000 mPaㆍs의 브룩필드 점도를 제공한다. 일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 적어도 10000 mPaㆍs의 브룩필드 점도를 제공한다. 일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 적어도 15000 mPaㆍs의 브룩필드 점도를 제공한다. 물에 분산시, 나노피브릴 셀룰로스의 브룩필드 점도 범위의 예는, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 2000-20000 mPaㆍs, 3000-20000 mPaㆍs, 10000-20000 mPaㆍs, 15000-20000 mPaㆍs, 2000-25000 mPaㆍs, 3000-25000 mPaㆍs, 10000-25000 mPaㆍs, 15000-25000 mPaㆍs, 2000-30000 mPaㆍs, 3000-30000 mPaㆍs, 10000-30000 mPaㆍs, 및 15000-30000 mPaㆍs를 포함한다.
나노피브릴 셀룰로스는 또한 평균 직경 (또는 너비) 또는 브룩필드 점도 또는 제로 전단 점도와 같은 점도와 함께 평균 직경으로 특정될 수 있다. 일 예에서, 본원에 기술된 생산물에 사용하기 적합한 나노피브릴 셀룰로스는 1-200 nm 또는 1-100 nm 범위의 평균 피브릴 직경을 가진다. 일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스의 평균 피브릴 직경은 1-50 nm, 예를 들어 2-20 nm 또는 5-30 nm이다. 일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스의 평균 피브릴 직경은 TEMPO 산화된 나노피브릴 셀룰로스의 경우에서와 같이 2-15 nm 범위이다.
피브릴의 직경은 현미경 검경과 같은 몇가지 기법으로 측정할 수 있다. 피브릴 두께 및 너비 분포는 전계 방출 주사 전자 현미경 (FE-SEM), 투과 전자 현미경 (TEM), 예를 들어 극저온 투과 전자 현미경 (cryo-TEM), 또는 원자력 현미경 (AFM)으로부터 입수한 이미지를 이미지 분석함으로써, 측정할 수 있다. 일반적으로, AFM 및 TEM이 피브릴 직경 분포 범위가 좁은 나노피브릴 셀룰로스 등급에 가장 적합하다.
나노피브릴 셀룰로스 분산물의 레오미터 점도는, 일 예로, 30 mm 직경의 실린더형 샘플 컵 안에 좁은 갭 베인 구조 (직경 28 mm, 길이 42 mm)가 설치된 응력 조절형 회전 레오미터 (AR-G2, TA Instruments, UK)를 사용해 22℃에서 측정할 수 있다. 샘플을 레오미터에 로딩한 후, 5분간 휴지기를 둔 후 측정을 개시한다. (인가된 토크에 비례하여) 전단 응력을 점진적으로 높이면서 정상 상태 점도를 측정하고, (각속도에 비례하여) 전단 속도를 측정한다. 특정 전단 응력에서 기록되는 점도 (=전단 응력/전단 속도)는, 일정한 전단 속도에 도달한 후 또는 최대 2분 후, 기록한다. 전단 속도 1000 s- 1를 초과하면, 측정을 중단한다. 이 방법은 제로-전단 점도를 측정하기 위해 사용할 수 있다.
다른 예로, 20 mm 플레이트 기하 구조가 장착된 응력 조절형 회전 레오미터 (AR-G2, TA instruments, UK)를 사용해 하이드로겔 샘플의 유변학적 측정을 수행한다. 샘플을 레오미터 1 mm 갭에 희석하지 않고 로딩한 다음, 5분간 둔 후 측정을 개시한다. 전단 응력을 0,001-100 Pa 범위에서 서서히 증가시키면서 진동수 10 rad/s, 변형율 2% 및 25℃에서 응력 스윕 점도 (stress sweep viscosity)를 측정한다. 저장 탄성률, 손실 탄성률 및 항복 응력/파괴 강도를 측정할 수 있다.
하이드로겔은 주입 후 그 형태를 유지하기 위해 최소 점도 수준이 필요한 것으로 확인되었다. 이는, 전단 응력을 0,001-100 Pa 범위에서 서서히 증가시키면서 진동수 10 rad/s, 변형율 2% 및 25℃에서 응력 조절형 회전 레오미터에 의해 측정하는, 저장 탄성률 350 Pa 이상 및 항복 응력/파괴 강도 25 Pa 이상으로 특정될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 심지어 화학적으로 변형된 또는 비-변형된 셀룰로스와 같이 여러가지 타입의 출발 물질을 이용하는 경우에도, 상기한 특징을 달성하기 위한 적절한 제조 방법 및 파라미터를 선택할 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스는 원하는 특성 및 효과가 달성되도록 적당한 수준의 피브릴화를 가져야 한다. 일 구현예에서, 나노피브릴 셀룰로스는 1-200 nm 범위의 피브릴 평균 직경을 가지거나, 및/또는 나노피브릴 셀룰로스 또는 약학적 조성물은, 전단 응력을 0,001-100 Pa 범위에서 서서히 증가시키면서 진동수 10 rad/s, 변형율 2% 및 25℃에서 응력 조절형 회전 레오미터에 의해 측정하였을 때, 물에 분산시, 저장 탄성률 350 Pa 이상, 예를 들어 350-5000 Pa 범위 또는 바람직하게는 350-1000 Pa, 및 항복 응력 25 Pa 이상, 예를 들어 25-300 Pa 범위, 바람직하게는 25-75 Pa를 제공한다.
일 예로, 예를 들어, 본 방법에 출발 물질로서 제공되는 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 수성 매질 중의 컨시스턴시 0.5% (w/w) 및 22℃±1℃에서 회전 레오미터에 의해 측정하였을 때, 1000-100000 Paㆍs, 예컨대 5000-50000 Paㆍs 범위의 제로 전단 점도 (약한 전단 응력 적용시, 일정한 점도의 "안정 상태 (plateau)"), 및 1-50 Pa, 예컨대 3-15 Pa 범위의 항복 응력 (전단 박화 개시시의 전단 응력)을 제공한다. 이러한 나노피브릴 셀룰로스는 또한 200 nm 이하, 예컨대 1-200 nm 범위의 평균 피브릴 직경을 가질 수 있다.
탁도는 일반적으로 육안으로 보이지 않는 개별 입자 (현탁 또는 용해된 전체 고체)에 의해 발생되는 유체의 흐림도 (cloudiness) 또는 탁한 정도 (haziness)이다. 탁도를 측정하는 실무적인 방식들이 몇가지 있으며, 가장 직접적인 방식은 샘플의 물 기둥을 통과함에 따른 빛의 약화 (즉, 세기 저하)를 측정하는 것이다. 대안적으로 사용되는 Jackson Candle 방법 (단위: 잭슨 탁도 단위 또는 JTU)은 기본적으로 물 기둥을 통해 보이는 양초 불꽃을 완전히 가리는데 필요한 물 기둥의 길이의 역수 (inverse measure)이다.
탁도는 광학 탁도를 측정하는 장치를 사용해 정량적으로 측정할 수 있다. 탁도를 정량적으로 측정하는데 사용가능한 상업적인 탁도계가 여러개 있다. 본 경우에는, 네펠로법 (nephelometry)에 기반한 방법을 이용한다. 보정된 네펠로미터의 탁도 단위를 네펠로미터 탁도 단위 (NTU)라 한다. 측정 장치 (탁도계)를 보정하고, 표준 보정 샘플로 조정한 다음 NFC 희석 샘플의 탁도를 측정한다.
한가지 탁도 측정 방법으로, 나노피브릴 셀룰로스 샘플을 물에 나노피브릴 셀룰로스의 겔화점 미만의 농도로 희석하고, 희석 샘플의 탁도를 측정한다. 나노피브릴 셀룰로스 샘플의 탁도 측정 농도는 0.1%이다. 탁도 측정에 50 ml 측정 용기가 구비된 HACH P2100 탁도계를 사용한다. 나노피브릴 셀룰로스 샘플의 건물량 (dry matter)을 측정하고, 건물량으로 계산된 샘플 0.5 g을 측정 용기에 로딩하고, 여기에 수돗물을 500 g까지 충진한 후 약 30초간 셰이킹에 의해 왕성하게 혼합한다. 지연없이, 수성 혼합물을 측정 용기 5개로 나누어 담아 이를 탁도계에 장착한다. 각 용기에 대해 3번씩 측정한다. 수득한 결과들로부터 평균값 및 표준 편차를 계산하고, 최종 결과를 NTU 단위로 나타낸다.
나노피브릴 셀룰로스를 특정하는 한가지 방법은 점도와 탁도 모두로 정의하는 것이다. 작은 피브릴은 빛 산란도가 낮기 때문에, 낮은 탁도는 작은 크기의 피브릴, 예를 들어 작은 직경의 피브릴을 의미한다. 일반적으로, 피브릴화도가 높을 수록, 점도는 증가하고, 동시에 탁도는 감소한다. 이 현상은 특정 지점까지 발생한다. 피브릴화가 더욱 계속되면, 피브릴은 최종적으로 부서지기 시작해 더 이상 강력한 네트워크를 형성할 수 없다. 따라서, 그 시점 이후에는, 탁도와 점도 둘다 감소하기 시작한다.
일 예로, 음이온성 나노피브릴 셀룰로스의 탁도는, 수성 매질 중에 컨시스턴시 0.1% (w/w)에서, 네펠로법에 의해 측정하였을 때, 90 NTU 이하, 예를 들어 3-90 NTU, 예를 들어 5-60 NTU, 예를 들어 8-40 NTU이다. 일 예로, 네이티브 (native) 나노피브릴의 탁도는, 20℃±1℃에서, 수성 매질 중의 컨시스턴시 0.1% (w/w)에서, 네펠로법에 의해 측정하였을 때, 심지어 200 NTU 이상, 예를 들어 10-220 NTU, 예를 들어 20-200 NTU, 예를 들어 50-200 NTU일 수 있다. 나노피브릴 셀룰로스를 특정하기 위해, 이들 범위는 제로 전단 점도와 같은 나노피브릴 셀룰로스의 점도 범위, 저장 탄성률 및/또는 항복 응력과 조합될 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스는 비-변형된 나노피브릴 셀룰로스이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 비-변형된 나노피브릴 셀룰로스의 배수성 (drainage)은, 예를 들어 음이온성 등급의 것과 비교해 현저하게 더 빠르다. 비-변형된 나노피브릴 셀룰로스는 일반적으로 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때 2000-10000 mPaㆍs 범위의 브룩필드 점도를 가진다. 바람직하게는, 나노피브릴 셀룰로스는, 전기전도도 적정 (conductometric titration)에 의한 측정시, 0.6-1.4 mmol COOH/g 범위, 예를 들어 0.7-1.2 mmol COOH/g 범위, 또는 0.7-1.0 mmol COOH/g 또는 0.8-1.2 mmol COOH/g 범위와 같이, 적절한 카르복시산 함량을 가진다.
분해되는 셀룰로스 섬유 원료 물질은 변형된 섬유 원료 물질일 수 있다. 변형된 섬유 원료 물질은 섬유가 처리에 의해 영향을 받아 셀룰로스 나노피브릴이 섬유로부터 더 쉽게 해리되는 원료 물질을 의미한다. 변형은 일반적으로 액체 중의 현탁물로서 존재하는 셀룰로스 섬유 원료 물질, 즉, 펄프에 대해 수행된다.
섬유에 대한 변형 처리는 화학적, 효소적 또는 물리적일 수 있다. 화학적 변형의 경우, 셀룰로스 분자의 화학 구조가 화학 반응 (셀룰로스의 "유도체화")에 의해 달라지며, 바람직하게는 셀룰로스 분자의 길이에는 변화가 없지만 폴리머의 β-D-글루코피라노스 유닛에 관능기가 부가된다. 셀룰로스의 화학적 변형은, 반응제의 양 및 반응 조건에 따라 결정되는 특정 변환 수준으로 이루어지며, 원칙적으로 완전하지 않아, 셀룰로스는 피브릴로서 고체 형태로 유지될 것이며 물에 용해되지 않는다. 물리적인 변형에서는, 음이온성, 양이온성 또는 비-이온성 물질 또는 이들의 임의 조합이 셀룰로스 표면에 물리적으로 흡착된다.
섬유의 셀룰로스는 특히 변형 후 이온성으로 하전될 수 있다. 셀룰로스의 이온 전하는 섬유의 내부 결합을 약화시키고, 향후 나노피브릴 셀룰로스로의 분해를 촉진할 것이다. 이온 전하는 셀룰로스의 화학적 또는 물리적 변형에 의해 달성될 수 있다. 섬유는 변형 후 출발 원료 물질과 비교해 더 높은 음이온성 또는 양이온성 전하를 띠게 될 수 있다. 음이온 전하를 생성하기 위해 가장 널리 사용되는 화학적 변형법은 하이드록시 기가 알데하이드와 카르복시기로 산화되는 산화, 설폰화 및 카르복시메틸화이다. 나노피브릴 셀룰로스와 생활성 분자 간에 공유 결합을 형성하는데 참여할 수 있는 카르복시 기와 같은 기를 도입하는 화학적 변형이 바람직할 수 있다. 이후 4급 암모늄 기와 같은 양이온성 기를 셀룰로스에 부착함으로써 양이온화 (cationization)에 의해 양이온성 전하를 화학적으로 구축할 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스는 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스 또는 양이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스와 같이 화학적으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스를 포함할 수 있다. 일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스는 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스이다. 일 예에서, 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스는 산화된 나노피브릴 셀룰로스이다. 일 예에서, 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스는 설폰화된 나노피브릴 셀룰로스이다. 일 예에서, 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스는 카르복시메틸화된 나노피브릴 셀룰로스이다. 셀룰로스를 음이온성으로 변형하여 수득되는 물질을 음이온성 셀룰로스로 지칭할 수 있으며, 이는 카르복시 기와 같은 음이온성 기의 함량 또는 비율이 변형에 의해 비-변형된 물질에 비해 증가된 물질을 지칭한다. 또한, 카르복시 기 대신 또는 아울러, 포스페이트 기 또는 설페이트 기와 같은 다른 음이온성 기를 셀룰로스에 도입하는 것도 가능하다. 이들 기의 함량은 본원에 카르복시산에 대해 기술된 바와 동일한 범위일 수 있다.
셀룰로스는 산화될 수 있다. 셀룰로스 산화에서, 셀룰로스의 일차 하이드록시 기는, N-옥실 매개 촉매 산화를 통해서와 같이, 헤테로사이클릭 니트록실 화합물, 예를 들어 일반적으로 "TEMPO"로 지칭되는 2,2,6,6-테트라메틸피페리디닐-1-옥시 유리 라디칼에 의해, 촉매적으로 산화될 수 있다. 셀룰로스의 β-D-글루코피라노스 유닛의 일차 하이드록시 기 (C6-하이드록시 기)는 카르복시 기로 선택적으로 산화된다. 일차 하이드록시 기로부터 일부 알데하이드 기도 형성된다. 낮은 산화도는 효과적인 충분한 피브릴화를 허용하지 않고 높은 산화도가 기계적 파괴 처리 후 셀룰로스의 열화 (degradation)를 유발한다는 발견 사실과 관련하여, 셀룰로스는 산화된 셀룰로스의 카르복시산 함량이 전기전도도 적정에 의한 측정에서 0.5-2.0 mmol COOH/(펄프) g, 0.6-1.4 mmol COOH/ (펄프) g 또는 0.8-1.2 mmol COOH / (펄프) g, 바람직하게는 1.0-1.2 mmol COOH/ (펄프) g 범위의 수준으로 산화될 수 있다. 이렇게 수득되는 산화된 셀룰로스의 섬유를 수중에 분해할 경우, 예를 들어 3-5 nm 너비일 수 있는 개별화된 (individualized) 셀룰로스 피브릴로 된 안정적인 투명한 분산물이 수득된다. 출발 물질로서 산화된 펄프를 사용하여, 컨시스턴시 0.8% (w/w)에서 측정한 브룩필드 점도가 적어도 10000 mPaㆍs, 예를 들어 10000-30000 mPaㆍs 범위인, 나노피브릴 셀룰로스를 수득할 수 있다.
촉매 "TEMPO"가 본원에 언급된 도처에서, "TEMPO"가 참여하는 모든 측정 및 조작이, TEMPO의 임의 유도체 또는 셀룰로스에서 C6 탄소의 하이드록시 기의 산화를 선택적으로 촉매할 수 있는 임의의 헤테로사이클릭 니트록실 라디칼에 동등하고 유사하게 적용됨은 자명할 것이다.
본원에 기술된 나노피브릴 셀룰로스의 변형은 본원에 기술된 다른 피브릴 셀룰로스 등급에도 적용될 수 있다. 예를 들어, 또한 고도로 라파이닝된 셀룰로스 또는 마이크로피브릴 셀룰로스도 마찬가지로 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다. 그러나, 예를 들어, 물질의 최종 피브릴화도에는 차이가 존재한다.
일 예에서, 이러한 화학적으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 10000 mPaㆍs 이상의 브룩필드 점도를 제공한다. 일 예에서, 이러한 화학적으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 15000 mPaㆍs 이상의 브룩필드 점도를 제공한다. 일 예에서, 이러한 화학적으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 18000 mPaㆍs 이상의 브룩필드 점도를 제공한다. 사용되는 음이온성 나노피브릴 셀룰로스의 예들은, 피브릴화도에 따라, 13000-15000 mPaㆍs 또는 18000-20000 mPaㆍs 범위, 또는 심지어 최대 25000 mPaㆍs의 브룩필드 점도를 가진다.
일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스는 TEMPO 산화된 나노피브릴 셀룰로스이다. 이는 낮은 농도에서 높은 점도, 예를 들어, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 20000 mPaㆍs 이상, 심지어 25000 mPaㆍs 이상의 브룩필드 점도를 제공한다. 일 예에서, TEMPO 산화된 나노피브릴 셀룰로스의 브룩필드 점도는 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때 20000-30000 mPaㆍs 범위, 예를 들어 25000-30000 mPaㆍs 범위이다.
일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스는 화학적으로 비-변형된 나노피브릴 셀룰로스를 포함한다. 일 예에서, 이러한 화학적으로 비-변형된 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 2000 mPaㆍs 이상 또는 3000 mPaㆍs 이상의 브룩필드 점도를 제공한다.
생산물의 제조 공정을 보강하거나 또는 특성을 개선 또는 조정하기 위한 보조제가 나노피브릴 셀룰로스 분산물에 포함될 수 있다. 이러한 보조제는 분산물의 액상에 용해성일 수 있으며, 에멀젼을 형성할 수 있거나, 또는 이는 고체일 수 있다. 보조제는 나노피브릴 셀룰로스 분산물의 제조시 원료 물질에 미리 첨가될 수 있거나, 또는 제조된 나노피브릴 셀룰로스 분산물 또는 겔에 첨가될 수 있다. 보조제는 또한 최종 생산물에, 예를 들어, 함침 (impregnating), 분무, 침액 (dipping), 침지 (soaking) 또는 유사 방식에 의해 첨가될 수 있다. 보조제는 일반적으로 나노피브릴 셀룰로스와 공유 결합하지 않으므로, 나노셀룰로스 매트릭스로부터 해리가능할 수 있다. 매트릭스로서 NFC를 사용할 경우, 이러한 보조제의 조절 방출 및/또는 지속 방출 (sustained release)을 달성할 수 있다. 보조제의 예로는 치료학적 (약제학적) 물질과, 그외 활성 물질의 특성 또는 생산물의 특성에 영향을 미치는 물질, 예를 들어, 완충제, 계면활성제, 가소제, 유화제 또는 기타 물질을 포함한다. 일 예로, 분산물은, 제조 공정에서 생산물로부터 수분 제거를 촉진하기 위해 또는 최종 생산물의 특성을 강화하기 위해 첨가될 수 있는, 하나 이상의 염을 함유한다. 염의 예로는 소듐 클로라이드, 칼슘 클로라이드 및 포타슘 클로라이드와 같은 클로라이드 염을 포함한다. 염은 분산물에 건물량 0.01-1.0% (w/w) 범위의 함량으로 포함될 수 있다. 최종 생산물은 또한 약 0.9% 소듐 클로라이드 수용액과 같은 소듐 클로라이드 용액에 침액 또는 침지될 수 있다. 최종 생산물의 바람직한 염 함량은 젖은 생산물 (wet product)에 대해 0.5-1 부피%, 예를 들어 약 0.9 부피% 범위일 수 있다. 염, 완충제 등의 물질은 생리학적 조건을 달성하기 위해 제공될 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스의 비-공유적 가교를 달성하기 위해 다가 양이온이 포함될 수 있다. 일 예는 특히 나노피브릴 셀룰로스, 특히 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스, 및 다가 금속 양이온과 같은 다가 양이온, 예를 들어, 칼슘, 바륨, 마그네슘, 아연, 알루미늄, 금, 플라티늄 및 티타늄으로부터 선택되는 다가 양이온을 포함하며, 나노피브릴 셀룰로스가 다가 양이온에 의해 가교된, 나노피브릴 셀룰로스 생산물을 제공된다. 특히 바륨 및 칼슘이 생의학적 용도로 유용할 수 있으며, 특히 바륨이 표지에 사용할 수 있으며, 주입된 하이드로겔을 검출하기 위해 사용할 수 있다. 다가 양이온의 함량은 하이드로겔의 건물량으로부터 계산되는 0.1-3% (w/w) 범위, 예를 들어 0.1-2% (w/w) 범위일 수 있다.
일 예는, 펄프를 제공하는 단계, 나노피브릴 셀룰로스가 수득될 때까지 펄프를 분해하는 단계 및 나노피브릴 셀룰로스로부터 하이드로겔을 형성하는 단계를 포함하는, 하이드로겔의 제조 방법을 제공한다.
나노피브릴 셀룰로스를 원하는 피브릴화도로 피브릴화하고, 원하는 수분 함유율로 조정하거나 또는 변형시켜, 본원에 기술된 원하는 특성을 가진 겔을 만들 수 있다. 일 예에서, 하이드로겔 내 나노피브릴 셀룰로스는 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스이다.
의료용 또는 과학용 하이드로겔로서 사용할 하이드로겔은 균질하여야 한다. 따라서, 하이드로겔의 제조 방법은 나노피브릴 셀룰로스를 포함하는 하이드로겔을, 바람직하게는 본원에 기술된 것과 같은 균질화 디바이스를 사용해 균질화하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 바람직한 비-피브릴화 균질화 단계를 이용함으로써, 겔로부터 불연속적인 부분을 없앨 수 있다. 용도에 더 적합한 특성을 가진 균질한 겔을 수득한다. 하이드로겔은, 예를 들어 열 및/또는 방사선 조사를 이용하거나, 및/또는 항미생물제와 같은 살균제를 첨가함으로써, 추가적으로 살균 처리할 수 있다.
조성물의 용도
본원에 기술된 나노구조형 셀룰로스 하이드로겔 내에 약학적 화합물(들)을 포함하는 조성물은 인간 또는 동물 개체와 같은 개체에 조성물을 전달, 주입, 이식 및/또는 투여하는 것을 포함하는 다양한 방법들에 이용할 수 있다. 개체는 환자, 특히 조성물에 포함된 약학적 화합물(들)이 참여하는 테라피가 필요한 환자일 수 있다. 치료가 필요한 개체를 인지 또는 검출하는 것이 필수적일 수 있다. 약제가 타겟팅하는, 예를 들어 주입되는 개체에 특이적인 타겟이 있을 수 있다. 본 방법은 주사가능한 형태 또는 이식가능한 형태와 같은 적합한 형태로 나노구조형 셀룰로스 하이드로겔에 약학적 화합물(들)을 포함하는 조성물을 제공하는 것을 포함한다. 또한, 예를 들어 연질 캡슐제와 같은 생분해성 캡슐제에 캡슐화된, 경구 투약 형태도 제공할 수 있다. 테라피일 수 있는 치료는 지속-방출 또는 조절-방출 투여와 같이 하나 이상의 약학적 화합물(들)의 연장된 방출 (extended-release) 투여를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 투여될 약학적 제형은 지속-방출 또는 조절-방출 조성물 또는 투약 형태와 같이, 연장된 방출 조성물 또는 투약 형태일 수 있다. 치료는 장기 치료 또는 하나 이상의 그외 적합한 약학적 화합물(들)을 이용한 치료와 같이 임의의 적합한 치료학적 치료를 포함할 수 있다. 약학적 조성물은, 일반적으로 개체에게 적합한 경로 및/또는 적합한 투여 수단에 의해 투여함으로써 개체를 치료하기 위한 약제로서의 용도를 제공할 수 있다.
일 예는, 예를 들어 저장 중에 및/또는 개체에 투여시, 25℃에서 수 용해도가 1 mg/ml 이하인 약학적 화합물을 안정화하기 위한 약제로서 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
일 예는, 예를 들어, 개체에 투여시, 25℃에서 수 용해도가 1 mg/ml 이하인 약학적 화합물의 생체이용성을 강화하기 위한 약제로서 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
일 예는,
- 바람직하게는, 테라피 또는 치료가 필요한 개체를 인지하는 단계,
- 본원에 기술된 나노구조형 셀룰로스 하이드로겔 내에 약학적 화합물(들)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계, 및
- 상기 조성물을 개체에 전달 또는 투여하는 단계
를 포함하는, 테라피가 필요한 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
실시예
본 실험에서, 나노셀룰로스 (나노 결정형 셀룰로스 CNC 및 나노피브릴 셀룰로스 NFC) 분산물을 나린제닌 (NG) 및 아지트로마이신 (Azi)의 용해율 및 항산화 활성을 강화하기 위한 담체로서 사용하였다. Azi는, CNF/Azi 나노복합체의 형성에 기반하여, 수용액 내 오리지널 Azi와 비교해 용해가 현저하게 증가되었다. CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체가 CNC 담체 및 반용매 재결정화 공정에 기초하여 성공적으로 제조되었다.
퓨어 CNC는 셀룰로스의 다량의 환원성 말단으로 인해 우수한 하이드록시 라디칼 (OHㆍ) 소거 능력을 또한 가지고 있다. 또한, NFC 하이드로겔은 비-수용성 또는 제한적인 수용성 약물 산제 (카르프로펜 또는 멜록시캄)의 응결 및 응집을 방지하는 매트릭스로서 작용하는 것으로 확인되었다. 나노셀룰로스 분산제 또는 하이드로겔은 수성 시스템에서 소수성 약물의 생체이용성을 개선할 수 있다.
파트 I: 용해 및 생체이용성을 강화하기 위한 나린제닌의 나노담체로서의 셀룰로스 나노결정 (CNC)
1. 배경
나린제닌 (NG, 4,5,7-트리하이드록시 플라바논, 도 2)은 천연 다이하이드로플라보노이드 화합물이다. NG는 다수 유형의 천연물, 예를 들어 자몽, 토마토, 포도 및 감귤류들로부터 추출된다. 많은 연구들에서, NG는 유리 라디칼 소거, 항-종양, 항-박테리아, 항-바이러스, 항-염증, 항-알레르기 및 생체내 혈전 저해 등의 다수의 약리학적 활성을 가진 것으로 입증되었다. 그러나, NG의 약학적 이용은 이의 낮은 수 용해도 및 낮은 지질 용해도로 인해 매우 제한적이다.
본 실험에서, CNC를 NG의 용해 속도 및 항산화 활성을 강화하기 위한 담체로서 사용하였다. NG는 반용매 재결정화를 통해 먼저 나노크기화한 다음 CNC에 로딩하여 CNC/NG 나노복합체를 형성하였다. 아울러, CNC를 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB)로 코팅하여, CNC/CTAB/NG 나노복합체의 제조시 이의 소수성을 증가시켰다. 제조된 CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체를 푸리에 변환 적외선 (FTIR) 스펙트로스코피, 투과전자현미경 (TEM) 및 X-선 회절 (XRD) 분석에 의해 특징을 규명하였다. 용해율 및 시험관내 항산화 활성 (OHㆍ 유리 라디칼 소거)도 평가하였다.
2. 연구 목적
2.1 CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 제조 및 특징 규명;
2.2 CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체에서 NG의 수성 시스템에서의 용해 및 항산화 활성 평가.
3. 재료 및 방법
3.1 실험 재료 및 장치
셀룰로스 나노결정 (CNC)은 Cellulose Lab Inc. (Fredericton, Canada) 사로부터 98% 동결-건조된 분말 형태로 입수하였다. 나린제닌 (NG)은 Aifa Biotechnology Co.,Ltd (Chengdu, China) 사로부터 98% 순도로 구입하였다.
주요 실험 장치로는 Xinzhi Biotechnology Co., Ltd. (Zhejiang, China) 사의 초음파 세포 파쇄기 D&DN JY99-IIDN, Beijing Puhua General Instrument Co. Ltd. (Beijing, China) 사의 UV-vis 분광광도계 TU-1810PC, Thermo Fisher Company (Waltham, USA) 사의 푸리에 변환 적외선 분광기 Nicolet iS5, Electronics Corporation (Tokyo, Japan) 사의 투과 전자 현미경 JEM-2010, Bruker Company (Karlsruhe, Germany) 사의 X선 회절기 Bruker D8 Advance, 및 Marin Christ company (Osterode, Germany) 사의 동결-건조기 ALPHA1-2LDPLUS를 포함한다.
3.3 실험 방법
3.3.1 CNC/NG 나노복합체 제조
오리지널 NG 분말을 무수 에탄올에 용해하여, 실온에서 초음파 분산 하에 25 ㎍/ml 농도의 용액을 제조하였다. 이후, 얼음조 안에서, 잘-분산된 CNC 수용액 (60 ml, 0.2 wt.%)을 교반하면서 여기에 NG 에탄올 용액을 여러가지 부피로 점적 첨가하여, 10분간 유지하였다. 마지막으로, 제조된 CNC/NG 나노복합체 현탁액을 향후 사용을 위해 동결-건조하였다.
비교 목적으로, 동일한 조건 하에 탈이온수 (60 ml)에 NG 에탄올 용액 (25 ㎍/ml)을 여러 부피로 점적 첨가하여, CNC없이 NG 입자를 제조하였다 (전통적인 반용매 재결정화 공정).
3.3.2 CNC/CTAB/NG 나노복합체 제조
탈이온수에 CTAB 분말을 용해하여 1 mmol/l 농도의 CTAB 용액을 준비하였다. CTAB 용액 10 ml을 CNC 수용액 (0.2 wt.%) 100 ml에 실온에서 자기 교반하면서 점적 첨가하였다. 제조된 CNC/CTAB 혼합물을 60℃로 가열하여, 셰이킹 테이블에서 30분간 둔 후, 실온으로 냉각시켰다. 반응 산물은 CTAB-변형된 CNC 석출물로 수득되었으며, 이를 이후에 사용하였다.
일부 NG 에탄올 용액 (25 ㎍/ml)을 CTAB-변형된 CNC 수성 현탁액 (60 ml, 0.2 wt.%)에 얼음조에서 왕성하게 교반하면서 점적 첨가하고, 이를 10분간 유지하였다. 제조된 CNC/CTAB/NG 나노복합체 현탁액을 향후 사용하기 위해 동결-건조하였다.
3.3.3 푸리에 변환 적외 분광법 (FTIR) 분석
CNC, 오리지널 NG 분말, CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체 샘플들을 Nicolet iS5 FTIR Spectrometer (Thermo Fisher, Waltham, USA)에서 분석 및 기록하였으며, 400 cm-1 내지 4000 cm-1 범위에서 스캐닝을 수집하였다.
3.3.4 투과 전자 현미경 (TEM) 검경
CNC, 오리지널 NG 분말, CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체 샘플들을 탈이온수에 0.01 wt.%로 희석하고, 희석한 분산물 1 방울을 탄소-코팅된 구리 그리드에 떨어뜨렸다. 그리드는 밤새 실온에서 공기 건조시켰다. JEM 2010 (S) TEM 장치 (Japan)를 가속 전압 200 keV로 작동시켜 TEM 검경을 수행하였다.
3.3.5 X선 회절 (XRD) 분석
CNC, 오리지널 NG 분말, CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체 샘플들을 가속 전압 40 kV 하에 Bruker D8 Advance 분말 X선 회절기 (Germany)에서 분석하였으며, Cu Kα 방사선의 회절 강도를 2θ 스캐닝 범위 3°- 50°에서 단계별 0.02°/s로 측정하였다.
3.3.6 시험관내 NG 용해율
(1) 표준 NG 곡선
오리지널 NG 분말을 무수 에탄올에 용해하여, 일련의 농도 시리즈의 NG 용액 (2.4, 3.6, 4.8, 6.0, 7.2 및 8.4 mg/ml)을 준비하였다. 그런 후, 자외선 (UV) 흡광을 290 nm 파장에서 측정하여, NG 용액의 농도를 측정하였으며, 표준 NG 곡선을 수득할 수 있었다.
(2) 시험관내 용해 속도
용해 속도는 2015 중국 약전 (XC II)의 방법에 따라 측정하였다. 먼저, NG 샘플 2 mg을 탈이온수 100 ml에 넣고, 37℃에서 100 rpm으로 교반하였다. 그런 후, 지정된 시간 (1, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120분)에, 각각의 샘플 5 ml을 취하여, 0.22 ㎛ 막으로 여과한 다음 UV 흡광을 290 nm 파장에서 측정하여 NG 농도를 구하였으며; 이때, 탈이온수 5 ml를 즉시 용해 매질에 첨가하여, 부피를 일정하게 유지시켰다. NG의 용해 속도를 식 1에 따라 계산하였다:
용해율 (%) = (C n x V 2 + C 1 x V 1 + C 2 x V 1 + ... + C n-1 x V 1 ) x 100%/m (1)
상기 식에서, C1, C2, Cn -1, Cn은 지정된 시간의 NG 농도, mg/ml이고; m은 NG의 총 투입량, mg이고; V1은 고정된 샘플 부피, ml이고; V2는 용해 매질의 총 부피, ml이다.
3.3.7 시험관내 항산화 활성
샘플의 시험관내 항산화 활성은 살리실산 하이드록실화 방법에 따라 OHㆍ 소거 활성을 측정함으로써 평가하였다. 방법에서, 펜톤 (Fenton) 반응을 이용해 OHㆍ를 생성시킨 후 살리실산에 의해 포획하였다. 본 시스템은 1.8 mM 패리설페이트 (2 ml), 1.8 mM 살리실산 (1.5 ml) 및 샘플 용액 1 ml로 구성된다. 마지막으로, H2O2 (0.03 wt.%) 0.1 ml을 혼합 용액에 첨가하여, 반응을 개시하였으며, 혼합물은 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, UV 흡광도를 510 nm 파장에서 측정하였다. OHㆍ 소거율은 식 2에 따라 계산하였다:
OHㆍ 소거율 (%) = (A 0 - A i ) x 100 % / A 0 (2)
상기 식에서, A0는 생성된 OHㆍ 총량을 나타내는 UV 흡광도이고, Ai는 샘플의 UV 흡광도이다.
4. 결과 및 고찰
4.1 CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 제조 원리
CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 제조 흐름도를 도 3에 나타낸다. 전통적인 반용매 재결정화 공정 (도 3, a)에서, NG 에탄올 용액을 여러가지 조건에서 탈이온수에 점적 첨가하였다. 반용매 중에 NG의 농도 증가에 따라 과포화 농도에서 NG 핵이 생성되었으며, 이후 NG 나노입자로 계속 성장하였다. NG 나노입자는 소수성 특성으로 인해 응집되어 NG 응집체를 형성하였으며, 이는 수용액에 분산하기 곤란하였다.
담체로서 CNC는 이의 큰 표면적과 풍부한 수소 결합으로 인해 NG 핵에 대해 더 많은 부위를 제공해주며, 이에 더 작은, 심지어 NG 나노입자가 형성되었다 (도 3, b). 아울러, CNC의 우수한 친수성으로 인해, CNC/NG 시스템을 상당히 안정적이게 만들어, 수득되는 NG 나노입자의 응결 및 응집이 저하되었다. 폴리(비닐피롤리돈), 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스, Tween 80 및 소듐 도데실 설페이트와 같은 안정화제로서 계면활성제 및 폴리머의 사용은 소수성 글리세오풀빈의 입자 성장을 저해/낮출 수 있다.
CTAB 변형 후, CNC는 CTAB의 긴 탄소 체인의 존재로 인해 소수성이 더 강해지고 NG 분자와의 상용성 (compatibility)은 더욱 우수해졌다. 정전기적 상호작용 및 소수성 상호작용을 통해 CNC에 NG 나노입자를 탑재하기 더 용이해졌으며 (도 3, c), 이는 입자 크기를 추가적으로 줄일 수 있으며, NG 나노입자의 안정성을 개선할 수 있다.
4.2 CNC/NG 나노복합체 제조의 최적화
4.2.1 오르소고날 실험 (orthogonal experiment)을 위한 인자 및 수준
이전 실험을 토대로, 본 발명자들은, CNC/NG 나노복합체의 경우, 하이드록시 라디칼에 4가지 인자 (OHㆍ 소거율, pH 값, 용매:반용매의 부피비 및 NG 농도)가 상당한 영향을 미친다는 것을 알게 되었다. 이후 실험에서, 표 2에 나타낸 바와 같이, 이들 4가지 인자와 이들의 여러가지 수준들을 오르소고날 실험에서 측정하였다.
표 2 오르소고날 실험에서의 인자 및 수준
수준 pH （A) 용매/반용매 온도/℃ 농도, ㎍/ml
1 5.5 1:10 20 20
2 7 1:30 60 5
3 8.5 1:20 0 10
4 10 1:5 40 40
4.2.2
오르소고날 실험 결과 및 분석L16 (4^5) 테이블을 오르소고날 실험에 사용하였으며, OHㆍ 소거율을 CNC/NG 나노복합체의 평가 지표로 사용하였다. 오르소고날 실험의 결과 및 분석을 표 3에 나타내었다.
표 3 오르소고날 실험의 결과 및 분석
번호 A B C D 블랭크 계획 OHㆍ 소거율, %
1 1 1 1 1 1 A1B1C1D1 27.4
2 1 2 2 2 2 A1B2C2D2 21.22
3 1 3 3 3 3 A1B3C3D3 39.13
4 1 4 4 4 4 A1B4C4D4 26.81
5 2 1 2 3 4 A2B1C2D3 37.74
6 2 2 1 4 3 A2B2C1D4 30.23
7 2 3 4 1 2 A2B3C4D1 38.57
8 2 4 3 2 1 2B4C3D2 30.82
9 3 1 3 4 2 A3B1C3D4 37.3
10 3 2 4 3 1 A3B2C4D3 30.35
11 3 3 1 2 4 A3B3C1D2 38.56
12 3 4 2 1 3 A3B4C2D1 35.55
13 4 1 4 2 3 A4B1C4D2 36.69
14 4 2 3 1 4 A4B2C3D1 36.94
15 4 3 2 4 1 A4B3C2D4 44
16 4 4 1 3 2 A4B4C1D3 37.78
K1 114.56 139.13 133.97 138.46 132.57
K2 137.36 118.74 138.51 127.29 134.87
K3 141.76 160.26 144.19 145 141.6
K4 155.41 130.96 132.42 138.34 140.05
k1 28.64 34.7825 33.4925 34.615 33.1425
k2 34.34 29.685 34.6275 31.8225 33.7175
k3 35.44 40.065 36.0475 36.25 35.4
k4 38.8525 32.74 33.105 34.585 35.0125
범위(R) 10.2125 10.38 2.9425 4.4275 2.2575
순서 B>A>D>C
최적 계획 B3A4D3C3
오르소고날 실험의 결과 및 분석을 토대로, B3A4D3C3 조합이 최적의 선택이었으며, 구체적인 CNC/NG 제조 조건은 다음과 같다: 용매/반용매 부피비, 1: 20; pH, 10; 온도, 0℃; NG 농도, 10 ㎍/ml.
그러나, pH 10은 인체의 정상적인 pH보다 높다는 것을 고려해, OHㆍ 소거율에 대한 pH 효과 추세에 따라 이하 CNC/NG 나노복합체 제조시 pH 7.0-8.5를 사용한다.
4.3 특정화
4.3.1 FTIR 분석
CNC, 오리지널 NG, CNC/NG, 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 FTIR 스펙트럼을 도 5에 도시한다. 3267 cm-1 및 1600 cm-1에서의 흡수 피크는 오리지널 NG의 전형적인 피크로서, 각각 C-H 스트레칭 및 C=O 스트레칭을 나타낸다. CNC는 셀룰로스의 특징에 따라, 3333 cm-1 (O-H 스트레칭), 1060 cm-1 (2차 하이드록시), 1030 cm-1 (1차 하이드록시)에서 전형적인 피크들이 나타난다.
대조적으로, CNC/NG 나노복합체의 경우, 3333 cm-1, 1060 cm-1 및 1030 cm-1에서 흡수 피크가 증가하였으며, 이는 CNC와 NG 간의 수소 결합의 형성을 의미한다. 아울러, NG의 전형적인 흡수 피크 역시 CNC/NG 나노복합체에서 관찰되었다.
CNC/CTAB/NG 나노복합체의 경우, 1030 cm-1 및 1060 cm-1에서의 흡수 피크가 CNC/NG 나노복합체와 비교해 더욱 증가하였는데, 이는 CNC 상의 CATB 유래 긴 알킬 체인의 부착으로 인한 것일 수 있다. 또한, NG의 전형적인 흡수 피크 역시 CNC/CTAB/NG 나노복합체에서 관찰되었으며, 이는 NG가 CNC 상에 성공적으로 탑재되었다는 것을 의미한다.
도 5는 CNC, 오리지널 NG, CNC/NG, 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 FTIR 스펙트럼을 보여준다.
도 6은 CNC, 오리지널 NG, CNC/NG, 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 XRD 패턴을 보여준다.
CNC, 오리지널 NG, CNC/NG, 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 XRD 패턴을 도 6에 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 오리지널 NG의 경우, 2θ = 10.76°, 15.92°, 17.24°, 18.15°, 19.90°, 20.52°, 22.20°, 23.80°, 24.43°, 25.34° 및 27.71°에서 강한 회절 피크가 관찰되었으며, 이는 NG가 결정형 상태로 존재한다는 것을 의미한다.
반면, CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 경우, NG의 강한 회절 피크들이 사라졌는데, 이는 NG가 고도의 결정형 상태에서 비정질 상태로 변환되었음을 의미한다. CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 형성에 기반한 NG의 효과적인 나노화는 NG의 결정형 상태의 변환이 원인일 수 있다.
4.3.3 TEM 분석
전통적인 반용매 재결정화 방법에 의해 제조된 NG 입자는 0.8-1.0 ㎛ 길이의 침상형으로 관찰할 수 있었다 (도 7a 및 b).
도 7은 (a), (b) NG 입자 via 전통적인 반용매 재결정화 공정, (c) CNC/NG 나노복합체, (d) CNC/CTAB/NG 나노복합체의 TEM 이미지를 보여준다.
대조적으로, NG 입자는 CNC/NG 나노복합체의 형성을 기반으로 복수의 소형 나노입자로 변환되었다 (도 7c). CNC는 넓은 표면적 및 풍부한 수소 결합으로 인해 NG 핵에 대해 더 많은 부위를 제공하여, 더 작은, 심지어 NG 나노입자가 형성되는 것으로, 추정되었다.
아울러, NG 입자는 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 형성에 기반하여 더 잘 분산되고 나노화되었으며 (도 7d), 이는 CTAB 변형 후 CNC의 소수성 증가로 인한 것일 수 있다. 소수성 약물의 나노화는 비표면적 증가로 인해 용해 속도 및 생체이용성을 강화하는데 일조할 수 있다.
4.4 시험관내 용해 속도
4.4.1 표준 NG 곡선
NG 에탄올 용액 (2.4~8.4 ㎍/ml)을 여러가지 농도로 준비하고, 290 nm에서 흡광도를 측정하였다. NG의 표준 곡선을 작성하였다.
NG 흡광도와 농도 간에 식 Y=0.00761X-0.0225 및 R2=0.9955이 성립되었다. NG의 농도 및 흡광도는 양호한 선형적인 관계였으며, NG 농도 결정에 활용할 수 있다.
4.4.2 시험관내 용해 속도
오리지널 NG, NG 입자 (전통적인 반용매 재결정화 공정), CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 용해 속도를 도 8에 나타낸다. 오리지널 NG는 120분 이내에 1.87%에 불과한 매우 제한적인 용해율을 나타내었다. NG 입자 (전통적인 반용매 재결정화 공정)의 용해율은 증가하여 10분 및 120분에 각각 25.1% 및 35.2%에 도달하였다.
이와는 대조적으로, CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 경우, NG의 용해율이 명확하게 증가하였다. 예를 들어, CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 용해율은 10분에 각각 53.6% 및 78.5%에 도달하였으며; 이후 용해율이 서서히 증가하여 120분에는 각각 92.6% 및 99.5%에 도달하였다. 용해율은 소수성 약물의 생체이용성과 양호한 관련성을 가진다. 문헌에서, 다수 연구자들은, 퀘르세틴 및 커쿠민과 같은 소수성 약물의 생체이용성이 이의 용해율을 높임으로써 효과적으로 강화할 수 있다고 보고한 바 있다.
도 8은 오리지널 NG, NG 입자 (전통적인 반용매 재결정화 공정), CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 용해율을 보여준다.
4.5 시험관내 하이드록시 라디칼 (OHㆍ) 소거 활성
오리지널 NG, NG 입자 (전통적인 반용매 재결정화 공정), CNC, CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 OHㆍ 소거 활성을 도 9에 나타낸다.
퓨어 CNC는 양호한 OHㆍ 소거 활성을 나타내는 것으로 관찰할 수 있었다. 예를 들어, OHㆍ 소거율은 10 내지 50 ㎍/ml 농도에서 17.1% 내지 21.6%이었으며, 이는 CNC의 다량의 환원성 말단 기로 인한 것일 수 있다.
오리지널 NG의 OHㆍ 소거율은 매우 낮아, 50 ㎍/ml 농도에서 6.7%에 불과하였는데, 이는 오리지널 NG의 소수성 특성으로 인한 것이다. NG 입자 (반용매 재결정화 공정)의 경우, OHㆍ 소거율이 증가하여, 50 ㎍/ml 농도에서 11.2%에 도달하였다.
도 9는 오리지널 NG, NG 입자 (전통적인 반용매 재결정화 공정), CNC, CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 OHㆍ 소거 활성을 보여준다.
대조적으로, CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 경우, OHㆍ 소거율은 50 ㎍/ml 농도에서 각각 41.2% 및 52.5%로 명확하게 증가하였다. 이러한 결과는, 담체로서 CNC 및 CNC/CTAB가 NG 용해를 효과적으로 강화할 수 있다는 것을 의미한다. 아울러, CNC/CTAB/NG 나노복합체는 CNC/NG 나노복합체에 비해 더 우수한 OHㆍ 소거율을 나타내었으며, 이는 CTAB 변형된 CNC의 상용성 증가가 원인일 수 있다.
5. 결론
5.1 CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체가 CNC 담체 및 반용매 재결정화 공정을 토대로 성공적으로 제조되었다. TEM 및 XRD 분석 결과, NG가 효과적으로 나노화되었으며, 잘 분산되고, 고도의 결정형 상태에서 비정질 상태로 변환되었다.
5.2 퓨어 CNC는 양호한 하이드록시 라디칼 (셀룰로스의 다량의 환원성 말단 기에 기인한 OHㆍ 소거력)을 가진다.
5.3 CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체에서 NG의 용해율은, 오리지널 NG (1.87%)와 비교해, 120분에 각각 92.6% 및 99.5%로 명확하게 증가하였다. 그 결과, CNC/NG 및 CNC/CTAB/NG 나노복합체의 OHㆍ 소거율도 오리지널 NG와 비교해 명확하게 증가하였다.
이들 실험 결과를 토대로, 담체로서 CNC는 용이한 제조 방법 및 우수한 생체적합성으로 인해 NG의 생체이용성을 강화할 것으로 기대된다.
파트 II: 아지트로마이신의 용해 및 생체이용성을 강화하기 위한 나노담체로서 CNF
1. 배경
아지트로마이신 (AZI, 도 10)은 15원성의 고리 반-합성 마크롤라이드 항생제로서, 14원성 고리에 질소 원자가 삽입되어 15원성 고리를 형성하는 것을 특징으로 한다. AZI는 그람 양성 및 그람 음성 박테리아에 대해 마크롤라이드의 강력한 항세균 활성을 나타낸다. 임상적으로, AZI는 호흡기 감염, 피부 및 연조직 감염 및 비뇨 및 생식기 감염을 치료하기 위해 널리 사용되고 있다. 그러나, 다른 수-불용성 약물들과 마찬가지로, 약학 분야에서 AZI의 큰 단점은 물 용질에서의 불용성 및 낮은 경구 생체이용성인데, 이는 소수성 특성으로 인한 것이다. 따라서, AZI에서 가장 중요하게 생각되는 부분은 수성 시스템에서 약물 방출 및 생체이용성을 강화하는 것이다.
본 실험에서, AZI를 모델 약물로 선정하였으며, UPM 사의 셀룰로스 나노섬유 (CNF)를 약물 담체로 사용하였다. AZI의 용해율 및 생체이용성을 높이기 위해, CNF/AZI 나노복합체를 반용매 재결정화 공정을 통해 제조하였다. 도 10은 아지트로마이신의 화학 구조를 도시한다.
2. 연구 목적
2.1 CNF/AZI 나노복합체의 제조 및 특징 규명;
2.2 CNF/AZI 나노복합체에서 AZI의 수성 시스템에서의 용해 평가
3. 재료 및 방법
3.1 재료 및 장치
셀룰로스 나노섬유 (CNF)는 UPM 사로부터 1.5% 겔로서 입수하였다. 셀룰로스 나노결정 (CNC)은 Cellulose Lab Inc. (Fredericton, Canada) 사로부터 98% 동결-건조된 분말 형태로 입수하였다. 아지트로마이신은 Yuanzhi Biotechnology Co., Ltd. (Nanjing, China) 사로부터 98% 순도로 구입하였다.
주요 실험 장치로는 Xinzhi Biotechnology Co., Ltd. (Zhejiang, China) 사의 초음파 세포 파쇄기 D&DN JY99-IIDN, Beijing Puhua General Instrument Co. Ltd. (Beijing, China) 사의 UV-vis 분광광도계 TU-1810PC, Thermo Fisher Company (Waltham, USA) 사의 푸리에 변환 적외선 분광기 Nicolet iS5, Electronics Corporation (Tokyo, Japan) 사의 투과 전자 현미경 JEM-2010, Bruker Company (Karlsruhe, Germany) 사의 X선 회절기 Bruker D8 Advance, 및 Marin Christ company (Osterode, Germany) 사의 동결-건조기 ALPHA1-2LDPLUS를 포함한다.
3.2 실험 방법
3.2.1 CNF/AZI 나노복합체 제조
오리지널 AZI 분말을 무수 에탄올에 용해하여, 실온에서 초음파 분산 하에 200 ㎍/ml 농도의 용액을 제조하였다. 이후, 얼음조 안에서, 잘-분산된 CNF 수용액 (60 ml, 0.05 wt.%)을 자기 교반하면서 여기에 AZI 에탄올 용액 3 ml을 점적 첨가하여, 10분간 유지하였다. 마지막으로, 제조된 CNF/AZI 나노복합체 현탁액을 향후 사용을 위해 동결-건조하였다.
비교 목적으로, 동일한 조건 하에 탈이온수 (60 ml)에 AZI 에탄올 용액 (200 ㎍/ml) 3 ml을 점적 첨가하여, AZI 입자를 제조하였다 (전통적인 반용매 재결정화 공정).
3.2.2 특정화
(1) 푸리에 변환 적외 분광법 (FTIR) 분석
CNC, 오리지널 AZI 분말, CNF/AZI 나노복합체 샘플들을 Nicolet iS5 FTIR Spectrometer (Thermo Fisher, Waltham, USA)에서 분석 및 기록하였으며, 400 cm-1 내지 4000 cm-1 범위에서 스캐닝을 수집하였다.
(2) 투과 전자 현미경 (TEM) 검경
CNF, 오리지널 AZI 분말, CNF/AZI 나노복합체 샘플들을 탈이온수에 0.01 wt.%로 희석하고, 희석한 분산물 1 방울을 탄소-코팅된 구리 그리드에 떨어뜨렸다. 그리드는 밤새 실온에서 공기 건조시켰다. JEM 2010 (S) TEM 장치 (Japan)를 가속 전압 200 keV로 작동시켜 TEM 검경을 수행하였다.
(3) X선 회절 (XRD) 분석
CNF, 오리지널 AZI 분말, CNF/AZI 나노복합체 샘플들을 가속 전압 40 kV 하에 Bruker D8 Advance 분말 X선 회절기 (Germany)에서 분석하였다. Cu Kα 방사선의 회절 강도를 2θ 스캐닝 범위 3°- 50°에서 단계별 0.02°/s로 측정하였다.
3.2.3 시험관내 하이드록시 라디칼 (OHㆍ) 소거 활성
샘플의 시험관내 항산화 활성은 살리실산 하이드록실화 방법에 따라 OHㆍ 소거 활성을 측정함으로써 평가하였다. 방법에서, 펜톤 (Fenton) 반응을 이용해 OHㆍ를 생성시킨 후 살리실산에 의해 포획하였다. 본 시스템은 1.8 mM 패리설페이트 (2 ml), 1.8 mM 살리실산 (1.5 ml) 및 샘플 용액 1 ml로 구성된다. 마지막으로, H2O2 (0.03 wt.%) 0.1 ml을 혼합 용액에 첨가하여, 반응을 개시하였으며, 혼합물은 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, UV 흡광도를 510 nm 파장에서 측정하였다. OHㆍ 소거율은 식 1에 따라 계산하였다:
OHㆍ 소거율 (%) = (A 0 - A i ) x 100 % / A 0 (1)
상기 식에서, A0는 생성된 OHㆍ 총량을 나타내는 UV 흡광도이고, Ai는 샘플의 UV 흡광도이다.
3.2.4 AZI의 시험관내 용해
(1) 표준 AZI 곡선
오리지널 AZI 분말을 2 mg/ml 농도로 실온에서 초음파 분산 하에 무수 에탄올에 용해하였다. 그런 후, AZI 용액에 염산 (0.1 M)을 첨가하여, 여러가지 농도 (16, 32, 48, 64, 80, 96 ㎍/ml)의 AZI 용액 시리즈를 제조하였다. 그 후, 각각의 AZI 샘플 5 ml과 황산 (73.5%) 5 ml을 시험관에 첨가하여 혼합한 후, 제조된 혼합물을 실온에서 30분간 반응시켰다. 마지막으로, UV 흡광도를 482 nm 파장에서 측정하여, AZI 용액의 농도를 구하고, AZI 표준 곡선을 작성하였다.
(2) 시험관내 용해율
용해율은 2015 중국 약전 (XC II)의 방법에 따라 측정하였다. 먼저, AZI 샘플 2 mg을 탈이온수 100 ml에 넣고, 37℃에서 100 rpm으로 교반하였다. 그런 후, 지정된 시간 (1, 5, 10, 30, 60, 120분)에, 각각의 샘플 3 ml을 취하여, 0.45 ㎛ 막으로 여과하였으며, 탈이온수 3 ml을 즉시 용해 매질에 첨가하여, 일정한 부피로 유지시켰다.
그런 후, 황산 (73.5%) 2 ml 및 수득한 여과물 2 ml을 시험관에 첨가하여 혼합물을 제조하고, 혼합물을 30분간 두었다. 마지막으로, UV 흡광도를 482 nm 파장에서 측정하여 AZI 농도를 구하였다. AZI의 용해율을 식 2에 따라 계산하였다:
용해율 (%) = (C n x V 2 + C 1 x V 1 + C 2 x V 1 + ... + C n-1 x V 1 ) x 100%/m (2)
상기 식에서, C1, C2, Cn -1, Cn은 지정된 시간의 AZI 농도, mg/ml이고; m은 AZI의 총 투입량, mg이고; V1은 고정된 샘플 부피, ml이고; V2는 용해 매질의 총 부피, ml이다.
4. 결과 및 고찰
4.1 CNF의 특정화
본 실험에서, 분산물 및 수성 시스템에서의 안정화, FTIR 분석, TEM 검경 및 XRD 분석을 비롯하여, UPM R&D Center 사의 CNF를 분석하여, CNC와 비교하였다. 그 결과를 다음과 같다.
4.1.1 수성 시스템에서의 CNF 분산 및 안정성
도 11a에 나타낸 바와 같이, CNF는 0.1 wt.% 농도에서 탈이온수에 쉽게 분산되지만, CNF 현탁물의 분산성 및 안정성은 CNC 현탁물 (Cellulose Lab Inc. Fredericton, Canada, 황산 가수분해 방법에 의해 제조됨)보다 낮다. 도 11b에서, CNF는 1.5 wt.% 농도에서 겔 유동성을 상실하였으며, 이와 비교해 CNC는 1.5 wt.% 농도에서 여전히 양호한 유동성과 안정성을 나타내었다.
4.1.2 CNF의 TEM 분석
도 12a 및 b는, CNF가 길이는 길고 직경은 작은 (5-50 nm) 전형적인 셀룰로스 나노섬유의 특징을 가진다는 것을 보여준다. CNF는 긴 길이와 양호한 유연성으로 인해 덩어리 (agglomeration)를 쉽게 형성한다. 이와는 대조적으로, CNC는 100-400 nm 길이 및 5-40 nm 폭의 침상형이다 (도 12c). CNF와 비교해, CNC는 길이는 더 짧고, 경직성은 더 강해, 쉽게 분산되어 안정적인 현탁물을 형성한다.
4.1.3 CNF의 FTIR 분석
도 13에 나타낸 바와 같이 CNF 및 CNC의 FTIR 스펙트럼을 분석하여 비교하였다. CNF 및 CNC는 비슷한 화학 구조 (셀룰로스 구조)를 가지고 있음을 알 수 있다. 예를 들어, 3333 cm-1, 2890 cm-1, 1060 cm-1 및 1030 cm-1에서의 흡광 피크는 각각 O-H 스트레칭, C-H 스트레칭, 2차 하이드록시, 1차 하이드록시로 인한 것이다. CNF 및 CNC 둘다 고-순도의 셀룰로스 원료 섬유로부터 제조하였으며, 따라서 이들은 비슷한 FTIR 흡광도를 가진다.
4.1.4 CNF의 XRD 분석
CNF 및 CNC의 XRD 패턴을 도 14에 나타낸 바와 같이 분석 및 비교하였다. 알 수 있는 바와 같이, 2θ = 15.5°, 16.5° 및 22.8°에서 CNF의 약한 회절 피크들이 관찰되었으며; 비교시, CNC는 2θ = 12.5°, 14.7° 및 22.7°에서 강한 회절 피크들을 나타내었는데, 이는 CNC가 CNF에 비해 결정화도가 더 높다는 것을 의미한다. CNC의 경우, 셀룰로스의 비정질 영역이 산 가수분해를 통해 제거되었고, 결정질 영역은 유지되는 것으로 설명되었지만; CNF의 경우, 셀룰로스의 결정질 영역을 심각하게 파괴할 수 있는, 압출 및 테어링 (tearing) 등의 강력한 기계적 처리를 도입하였다.
4.2 CNF/AZI 나노복합체의 제조 원리
도 4는 CNF/AZI 나노복합체의 제조 원리를 도시한다. 전통적인 반용매 재결정화 공정 (상단 경로)에서, 오리지널 AZI를 용매 (무수 에탄올)에 용해한 다음 AZI 에탄올 용액을 반용매 (탈이온수)에 여러가지 조건 (농도, 부피비, 온도 및 교반 조건) 하에 점적 첨가하였다. 탈이온수 중의 AZI 농도를 증가시키면서, AZI는 과포화 상태에 도달하였고, 다량의 AZI 핵이 생성될 것이다. AZI의 소수성 특성으로 인해, 이들 AZI 핵이 계속 성장하여, 최종적으로 AZI 나노입자 및 응집체가 형성되며, 이는 수용액에 추가로 분산시키기 어렵다.
CNF를 담체로 사용하는 경우 (하단 경로), CNF의 넓은 비표면적 및 네트워크 구조는 AZI 핵에 대해 부위를 더 많이 제공할 것이며, 그래서 AZI 입자가 과다 성장하는 것을 방지하고 AZI 나노입자가 수용액에서 더 안정적이게 만들 것이다. CNF와 AZI 간의 상호작용은 정전기 흡착 및 수소 결합일 수 있다.
4.3 CNF/AZI 나노복합체의 특정화
4.3.1 FTIR 분석
오리지널 AZI, CNF 및 CNF/AZI 나노복합체의 FTIR 스펙트럼을 도 15에 도시한다. 그 결과, 오리지널 AZI는 O-H 스트레칭, C-H 스트레칭 및 C=O 스트레칭을 각각 나타내는 피크를 가진 것으로 확인되었다. CNF FTIR 결과에서는 관찰되는 AZI의 전형적인 흡광 피크는 존재하지 않았다.
CNF/AZI 나노복합체의 경우, 3486 cm-1 (O-H 스트레칭), 2969 cm-1 (C-H 스트레칭) 및 1720 cm-1 (C=O 스트레칭)에서 흡광 피크들을 관찰할 수 있으며, 이는 (세기 감소에도 불구하고) AZI로 인한 것일 수 있다. 이들 결과는, AZI가 CNF 상에 성공적으로 탑재되었고, AZI의 화학 구조가 바뀌지 않았다는 것을 의미한다.
4.3.2 XRD 분석
CNF 및 CNF/AZI 나노복합체의 XRD 패턴을 도 16에 나타낸다.
오리지널 AZI는 2θ = 8.0°, 9.8°, 16.9°, 18.9°, 20.7°, 27.3° 및 42.3°에서 강한 회절 피크를 나타내었으며, 이는 이것이 결정질 상태임을 의미한다. 그러나, CNF/AZI 나노복합체에서 특징적인 AZI 회절 피크가 사라졌으며, 이는 AZI가 고도의 결정질 상태에서 비정질 상태로 변환되었음을 의미한다. CNF/AZI 나노복합체의 형성에 기반한, AZI의 나노화 및 충분한 분산은 AZI 상태 변환이 원인일 수 있다. 소수성 약물의 효과적인 나노화는 수 용해도 및 생체이용성을 강화한다.
4.3.3 TEM 분석
도 17은 오리지널 AZI, CNF 및 CNF/AZI 나노복합체의 TEM 이미지를 도시한다. a)에서 막대는 2 ㎛이고, b), c) 및 d)에서는 0.5 ㎛이다. 도 17a는, 오리지널 AZI가 결정질 상태로 존재하고 입자 크기가 크다 (수 ㎛)는 것을 보여준다. 전통적인 반용매 석출 공정에 의해 제조된 AZI 입자는 응집되었으며 (도 17b), 이는 AZI의 소수성 특성으로 인해 수용액에 더욱 분산시키기 어려웠다.
이와는 대조적으로, AZI 입자의 응집체들은, CNF/AZI 나노복합체의 형성에 기반하여, 다수의 작은, 심지어 나노입자로 잘 분산되었으며 (도 17d), 이는 CNF와 AZI 입자 간의 정전기 상호작용 및 수소 결합으로 인한 것일 수 있다. 반용매 재결정화 공정에 의해 제조된 AZI 나노입자는 CNF 표면 상에 쉽게 흡착될 수 있으며; 또한, CNF 네트워크는 AZI 나노입자의 응집을 낮추는데 일조할 수 있다.
4.4 CNF의 하이드록시 라디칼 (OHㆍ) 소거 활성
본 발명자들은 이전 실험에서 CNC가 우수한 OHㆍ 소거 활성을 가지고 있다는 것을 입증하였다. 여기서, 도 18에 나타낸 바와 같이, CNF의 OHㆍ 소거 활성을 조사하였으며, CNC와 비교하였다.
CNF는 동일한 조건에서 CNC와 비교해 OHㆍ 소거 효율이 낮다는 것을 알 수 있다. 예를 들어, CNF의 OHㆍ 소거 효율은 10 내지 30 ㎍/ml 범위에서 5.6% 내지 6.2% 범위였으며; 이와는 대조적으로, CNC의 OHㆍ 소거 효율은 동일한 농도에서 18.4% 내지 22.1% 범위였다.
셀룰로스 환원 말단 기의 양적 차이로 인해 OHㆍ 소거 효율에 차이가 발생하는 것으로 설명되었다. CNF의 경우, 긴 길이 및 작은 섬유 횡단면으로 인해, 셀룰로스의 환원성 말단들이 더 적게 노출되었다. 이와는 대조적으로, CNC의 경우, 짧은 길이 및 더 큰 섬유 횡단면으로 인해 셀룰로스의 환원성 말단들이 더 많이 노출되었다.
4.5 시험관내 용해율
4.5.1 AZI 표준 곡선
AZI 에탄올 용액을 여러가지 농도 (8~48 ㎍/ml)로 준비하고, 482 nm에서 UV 흡광도를 측정하여 AZI의 표준 곡선을 작성하였다. AZI의 표준 곡선을 계산하였다. 식은 다음과 같다: y = 22.996x - 0.0821, R2=0.9991, 이는 AZI의 농도 및 흡광도가 양호한 선형적인 관계임을 의미한다.
4.5.2 AZI의 시험관내 용해율
오리지널 AZI, AZI 입자 (전통적인 반용매 재결정화 공정), CNC/AZI 및 CNF/AZI 나노복합체의 용해율을 도 19에 도시한다. 오리지널 AZI는 매우 제한적인 용해율을 나타내고, 120분에 1.31%에 불과함을 알 수 있었다. 반용매 재결정화 공정을 통해, AZI의 용해율이 증가하였으며, 10분 및 120분에 각각 38.8% 및 52.2%에 도달하였다.
이와는 대조적으로, CNF/AZI 및 CNC/AZI 나노복합체의 경우, AZI의 용해율이 명백하게 증가하였다. 예를 들어, CNF/AZI 및 CNC/AZI 나노복합체에서 AZI의 용해율은 10분에 각각 80.4% 및 85.1%에 도달하였으며; 이후 용해율이 서서히 증가하여, 120분에 각각 91.2% 및 96.3%에 도달하였다. 이들 결과는, 담체로서 CNF 또는 CNC는 AZI의 용해를 효과적으로 강화할 수 있는 것으로, 확인되었다.
5. 결론
5.1 CNF/AZI 나노복합체가 CNF 담체 및 반용매 재결정화 공정에 기반하여 성공적으로 제조되었다. TEM 및 XRD 분석 결과, AZI가 효과적으로 나노화되고, 잘 분산되며, 고도의 결정질 상태에서 비정질 상태로 변환되는 것으로 입증되었다.
5.2 퓨어 CNF (6.2%, 30 ㎍/ml)의 OHㆍ 소거 효율은 퓨어 CNC (22.1%, 30 ㎍/ml) 보다 낮으며, 이는 CNF에서 셀룰로스의 환원성 말단이 적기 때문이다.
5.3 CNF/Azi 나노복합체의 형성에 기반하여, CNF/AZI 나노복합체에서 AZI의 용해율은, 오리지널 AZI (1.31%)와 비교해, 120분에 91.2%까지 명백하게 증가하였다.
5.4 제조된 CNF/AZI 나노복합체는 용이한 제조 방법 및 우수한 생체적합성으로 인해 AZI의 생체이용성을 강화할 것으로 기대된다.

Claims (18)

  1. 약학적 조성물의 제조 방법으로서,
    약학적 조성물, 바람직하게는 수분 함유율이 92-99.95% (w/w) 범위인 약학적 조성물을 제공하기 위해,
    - 약학적 화합물을 일정 부분 이상 용매에 용해할 수 있는 용매 중에 25℃에서 수 용해도가 1 mg/ml 이하인 약학적 화합물을 제공하는 단계,
    - 나노구조형 셀룰로스 (nanostructured cellulose)의 수성 분산물을 제공하는 단계, 및
    - 상기 약학적 화합물을 나노구조형 셀룰로스의 수성 분산물과 반용매 공정 (anti-solvent process)으로 조합하여 평균 직경이 50 nm 이하인 나노크기의 약학적 입자를 제공하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노구조형 셀룰로스가 평균 피브릴 직경이 200 nm 이하, 예를 들어 1-200 nm 범위인 나노피브릴 셀룰로스를 포함하고,
    바람직하게는, 상기 나노피브릴 셀룰로스가, 22℃±1℃에서, 수성 매질 중에 0.5% (w/w) 컨시스턴시에서 회전 레오미터에 의해 측정하였을 때, 물에 분산시, 1000-100000 Pa·s 범위, 예를 들어 5000-50000 Pa·s 범위의 제로 전단 점도, 및 1-50 Pa 범위, 예를 들어 3-15 Pa 범위의 항복 응력을 제공하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 나노구조형 셀룰로스가, 평균 피브릴 직경이 2-40 nm, 예를 들어 2-20 nm이고 평균 피브릴 길이가 100 nm 이상, 예를 들어 100-400 nm인, 나노결정 셀룰로스를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물의 상기 나노구조형 셀룰로스의 함유율이 0.05-8% (w/w), 예를 들어 0.05-0.5% (w/w) 또는 1-8% (w/w) 범위인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적 화합물이 25℃에서 0.6 mg/ ml 이하, 0.3 mg/ml 이하, 예를 들어 0.1 mg/ml 이하의 수 용해도 및/또는 낮은 생체이용성을 가지는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적 화합물의 함량이 상기 약학적 조성물 100 ㎕ 당 0.05-1 mg, 예를 들어 0.1-0.7 mg, 예를 들어 0.1-0.5 mg 범위인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 약학적 조성물을 제조하는 것을 포함하는, 수 용해도가 1 mg/ml 이하로 낮은 약학적 화합물의 안정화 방법.
  8. 약학적 조성물로서,
    25℃에서 수 용해도가 1 mg/ml 이하인 약학적 화합물의 나노크기의 약학적 입자를 나노구조형 셀룰로스 매트릭스 중에 포함하며,
    상기 나노크기의 약학적 입자가 50 nm 이하의 평균 직경을 가지며,
    상기 약학적 조성물이 바람직하게는 92-99.95% (w/w) 범위의 수분 함유율을 가지는, 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 나노구조형 셀룰로스가 200 nm 이하, 예를 들어 1-200 nm의 평균 피브릴 직경을 가지며,
    바람직하게는, 상기 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 22℃±1℃에서, 수성 매질 중에 0.5% (w/w) 컨시스턴시에서 회전 레오미터에 의해 측정하였을 때, 1000-100000 Pa·s 범위, 예를 들어 5000-50000 Pa·s 범위의 제로 전단 점도, 및 1-50 Pa 범위, 예를 들어 3-15 Pa 범위의 항복 응력 (전단 박하가 시작되는 지점의 전단 응력)을 제공하는, 약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 나노구조형 셀룰로스가, 평균 피브릴 직경이 2-40 nm, 예를 들어 2-20 nm이고 평균 피브릴 길이가 100 nm 이상, 예를 들어 100-400 nm인, 나노결정 셀룰로스를 포함하는, 약학적 조성물.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물의 상기 나노구조형 셀룰로스의 함유율이 0.05-8% (w/w) 범위, 예를 들어 0.05-0.5% (w/w) 또는 1-8% (w/w) 범위인, 약학적 조성물.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적 화합물이 25℃에서 0.6 mg/ ml 이하, 0.3 mg/ml 이하, 예를 들어 0.1 mg/ml 이하의 수 용해도 및/또는 낮은 생체이용성을 가지는, 약학적 조성물.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적 화합물의 함량이 상기 약학적 조성물 100 ㎕ 당 0.05-1 mg 범위, 예를 들어, 0.1-0.7 mg 범위, 예를 들어 0.1-0.5 mg 범위인, 약학적 조성물.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적 화합물이 나노구조형 셀룰로스 매트릭스로부터 10분 내에 50% 이상, 예를 들어 10분 내에 50-90% 범위의 용해율을 가지는, 약학적 조성물.
  15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 수득되는, 약학적 조성물.
  16. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이얼, 캡슐 또는 시린지에 패킹되는, 약학적 조성물.
  17. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로서, 바람직하게는 25℃에서 수 용해도가 1 mg/ml 이하인 약학적 화합물의 생체이용성을 강화하기 위한 약제로서 사용하기 위한, 약학적 조성물.
  18. 25℃에서 수 용해도가 1 mg/ml 이하인 약학적 화합물을, 바람직하게는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 안정화하기 위한, 나노구조형 셀룰로스의 용도.
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